林在俊;肖建如;罗剑;黄权;周振华;陈素;杨兴海;吴志鹏
【摘 要】目的 构建大鼠Smad6基因的慢病毒干扰载体,并在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)中验证其基因沉默效率.方法 针对大鼠Smad6基因设计、合成两对Smad6-shRNA干扰序列,并将其重组到pLKO.1质粒载体中.测序验证后在HEK293T细胞内组装慢病毒.最后体外分离培养大鼠BMSC,通过慢病毒感染将Smad6干扰序列转导到细胞内,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)及Western蛋白印迹法检测其对Smad6基因的干扰效率.结果 成功构建并包装2个大鼠Smad6基因干扰的慢病毒载体和慢病毒.与阴性对照组比较,重组慢病毒感染大鼠BMSC后经实时荧光定量PCR验证,2种重组病毒的干扰效率分别达到92.5％和93.4％,Western蛋白印迹法显示Smad6基因被干扰后蛋白表达明显下降.结论 成功构建出可有效干扰大鼠Smad6基因的慢病毒载体,为进一步研究其功能及应用提供有效工具.%Objective To construct lentiviral RNA interference(RNAi) vectors of rat Smad6 gene and evaluate the effects of Smad6 gene silencing in rat bone mesenchymal stem cells(BMSCs). Methods Two pairs of Smad6-shRNA sequences were designed and synthesized toward rat Smad6 gene, and cloned into pLKO. 1 vector. They were verified by DNA sequencing and assembled in HEK293T cells. After transduced the Smad6 shRNA sequences into BMSCs in vitro, the expression of Smad6 was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR) and Western Blot, respectively. Results Two lentiviral RNAi vectors of rat Smad6 gene were successfully designed and constructed. Compared to negative control, the silence effect of viruses with shRNA sequence were 92. 5% and 93. 4% respectively, and the protein expression of Smad6 were also significantly decreased. Conclusions We had successfully constructed lentivial RNAi vectors of rats Smad6 gene, and provided an effective tool for further study of the function and clinical application of Smad6 gene.
【期刊名称】《国际骨科学杂志》
【年(卷),期】我可能不会爱你242011(032)006
【总页数】4页(P386-388,391)
【关键词】Smad6基因;慢病毒;RNA干扰;基因重组;骨髓间充质干细胞
【作 者】林在俊;肖建如;罗剑;黄权;周振华;陈素;杨兴海;吴志鹏
【作者单位】cdma1x200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200241上海,华东师范大学生命医学研究所;200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200003,上海长征医院骨肿瘤外科;200003,上海长征医院骨肿瘤外科
【正文语种】中 文
骨髓间充质干细胞（BMSC）在向成骨细胞分化过程中受到多种细胞信号转导通路的调节，其中转化生长因子（TGF）－β／骨形态发生蛋白（BMP）信号通路最早发现，也是最重要的一条通路。Smad蛋白是TGF－β／BMP信号通路在细胞内转导中起关键作用的转导蛋白［1］。目前研究发现的Smad家族成员至少包括9种蛋白，按功能可分为受体调节Smad（R－Smad）如Smad1、2、3、5、8、9，共同调节Smad（Co－Smad）如Smad4，抑制性Smad（I－Smad）如Smad6、7。经典的TGF－β通路是R－Smad激活后与Co－Smad结合形成复合体，调节靶基因的转录，从而发挥效应，而I－Smad对 TGF－β通 路起 负 反 馈 调 节 作 用［2］。Smad6属于I－Smad，它可以与其他Smad竞争BMP
受体，抑制其他Smad磷酸化或抑制R－Smad和Co－Smad结合，从而对细胞成骨分化起抑制作用［3］。本实验拟构建并筛选大鼠Smad6基因慢病毒干扰载体，为进一步研究Smad6基因干扰对BMSC成骨分化的作用提供有效的工具。
1 资料与方法
诚信与善意的谎言1.1 主要材料和试剂
pLKO.1质粒及携带阴性对照（negative control，NC）序列的pLKO.1质粒、psPAX2质粒、pMD2G质粒、大肠杆菌感受态菌株DH5α及HEK293T细胞均由华东师范大学生命医学研究所惠赠。其他主要实验材料包括质粒抽提试剂盒（Omega公司），AgeI、EcoRI内切酶及T4 DNA连接酶（NEB公司），DMEM培养基及低糖DMEM培养基（Gibco公司），β甘油磷酸钠（Sigma公司），二磷酸维生素C（Sigma公司），地塞米松（Sigma公司），胎牛血清（FBS，HyClone公司），TRizol试剂（Invitrogen公司），逆转录试剂盒、聚合酶链式反应（PCR）试剂盒及SYBR Green荧光染料（Takara公司），Smad6一抗和二抗（Sigma公司）。4周龄SD大鼠由上海碧凯公司购入；引物由Invitrogen公司合成。
1.2 实验方法
Smad6基因shRNA慢病毒载体的构建：利用Invitrogen 软 件 （https：／／rnaidesigner.invitrogen／sirna／），针对大鼠Smad6基因（NM＿001109002）设计、合成两对Smad6－shRNA干扰序列（表1）。干扰片段用双蒸水（ddH2O）稀释成20μM，上下游引物各取5μl混合，95℃孵育4 h，再慢慢冷却退火备用。用AgeⅠ、EcoRⅠ内切酶对pLKO.1质粒分别酶切，酶切后琼脂糖电泳，电泳后可看到7 kb和1.9 kb2个条带。切取7 kb条带并按照凝胶回收试剂盒进行DNA回收。将退火产物和酶切后的pLKO.1用T4 DNA连接酶以16℃过夜连接。取连接产物2μl和感受态大肠杆菌DH5α25μl混合转化，并将转化后的大肠杆菌涂于含100μg／ml氨苄青霉素的琼脂糖平板上，37℃孵育16 h，挑取克隆于含氨苄青霉素的培养基中摇菌16 h。收集细菌并按照说明书抽提质粒，琼脂糖电泳初步鉴定后送测序（测序引物为U6启动子）。保留测序验证正确的重组质粒重新转化感受态大肠杆菌并涂板、摇菌、质粒大抽。抽取质粒再次电泳及测序验证正确后置于－20℃保存。
表1 设计、合成的Smad6－shRNA干扰序列?
慢病毒干扰载体的包装：HEK293T细胞以DMEM＋10%FBS于直径10 cm培养皿中培养，
待细胞50%汇合后用磷酸钙转染法以重组质粒（10μg）和包装质粒psPAX2（10μg）、pMD2G（5μg）共转染 HEK293T细胞。6 h后换液，再过24 h收取含重组慢病毒的细胞上清液，过滤、浓缩，置－80℃保存备用。
BMSC培养及慢病毒感染条件的测定：取4周龄SD大鼠，颈椎脱位法处死后分离双侧股骨和胫骨，冲洗骨髓腔并收集骨髓组织于低糖DMEM＋15%FBS中行全骨髓培养，3 d后换液去除悬浮细胞，以后每隔2～3 d换液。待细胞长满后以0.05%胰酶消化，并按每孔1×104／100μl接种于96孔板中，按照梯度稀释法加入不同数量的慢病毒颗粒过夜感染，12 h后换低糖DMEM＋15%FBS继续培养。48 h后换含2μg／ml嘌呤霉素的培养基培养，继续观察3～5 d，未感染细胞将因无嘌呤霉素抗性而被杀死。选取能够达到有效感染效率（80%以上）的最低病毒量作为下一步实验条件。
BMSC感染重组慢病毒后Smad6干扰效率的测定：大鼠BMSC接种于6孔板中，待细胞80%融合后按照上面条件加入适量重组慢病毒感染，12 h后换成骨诱导液（低糖DMEM＋15%FBS＋10 mmol／Lβ甘油磷酸钠＋50μmol／L二磷酸维生素C＋10－8 M地塞米松），48 h后换含2μg／ml嘌呤霉素的成骨诱导液，继续培养3～5 d。收取细胞提取总RNA和总合成氨催化剂
国家形象宣传片人物篇蛋白，逆转录PCR和实时荧光定量PCR分别测细胞Smad6基因转录水平（Smad6引物设计：上游引物为GTCTTACACTGAAACCGAGG，下游引物为AGGTAGGTCGTAGAAGATGC），Western蛋白印迹法检测细胞的蛋白表达水平。
2 结果
2.1 重组质粒鉴定结果
pLKO.1质粒经AgeI、EcoRI内切酶酶切后琼脂糖凝胶电泳得到2条特异性条带，分别为7 kb和1.9 kb。切取7 kb条带回收后与干扰片段连接，转化感受态大肠杆菌，扩增、抽提得到的重组质粒并进一步经琼脂糖凝胶电泳后观察，结果显示均有特异性条带出现，条带大小为7 kb。结果初步表明两对干扰的引物序列被成功构建到慢病毒载体pLKO.1中去。将重组质粒送上海杰李生物技术有限公司测序，结果见下页图1。结果显示两对合成的干扰序列已成功连接到载体中，重组质粒构建成功。
2.2 慢病毒感染BMSC对Smad6基因及蛋白表达的影响
实验分为携带重组质粒的慢病毒组（Smad6－shRNA1组、Smad6－shRNA2组）和携带N
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C质粒的慢病毒组（NC组）。普通PCR分析显示Smad6－shRNA1组和Smad6－shRNA2组条带灰度值较NC组明显低（见下页图2），实时荧光定量PCR分析显示Smad6－shRNA1组和Smad6－shRNA2组干扰的效率分别为92.5%和93.4%（见下页图3），两组分别与NC组比较均有显著性差别（P＜0.01）。Western蛋白印迹检测结果也显示，Smad6－shRNA1组和Smad6－shRNA2组条带灰度值均较NC组明显低（见下页图4）。以上结果表明，2种重组慢病毒均可有效地感染大鼠BMSC，并干扰内源性Smad6基因和蛋白表达。
3 讨论
RNA干扰（RNAi）是利用与特定基因mRNA同源的小分子双链RNA（dsRNA）来抑制基因转录或翻译，从而达到基因沉默效应，它在生物中普遍存在。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的dsRNA时，该基因mRNA降解而导致基因表达沉默［4］。在哺乳动物细胞中，首先由核糖核酸酶（RNase）家族的Dice酶将dsRNA前体切割成包含21～23 bp及3’端突出的双链核苷酸分子siRNA［5］。随后siRNA和若干个蛋白组成RNA诱导沉默复合体（RISC），并解旋成单链。RISC活化后在形成单链的siRNA引导下，特异性地结
合目标mRNA并引导mRNA降解［6］。小发夹RNA（shRNA）即具有紧密发夹环的RNA序列，可以通过载体导入细胞，再利用U6或H1启动子使其在细胞内持续表达。这种shRNA在细胞内被切割成siRNA，从而发挥基因沉默效应。
图1 重组pLKO.1质粒测序结果 a.Smad6－shRNA1组测序结果 b.Smad6－shRNA2组测序结果 图2 重组慢病毒感染大鼠BMSC后Smad6基因PCR检测显示，Smad6－shRNA1组和Smad6－shRNA2组条带灰度值均较NC组明显低 图3 重组慢病毒感染大鼠BMSC后实时荧光定量PCR检测Smad6基因水平（重复3次／样品），显示Smad6－shRNA1组和Smad6－shRNA2组干扰的效率分别为92.5%和93.4% 图4 重组慢病毒感染大鼠BMSC后Western蛋白印迹检测显示Smad6－shRNA1组和Smad6－shRNA2组条带灰度值均较NC组明显低
RNAi技术自发现以来持续受到广泛关注。可以用它抑制特定基因，以研究该基因功能；也可以用它抑制某些和疾病相关的基因，以达到或控制疾病的目的。目前实施RNAi的方法主要有siRNA和shRNA两种方法。siRNA法是将预先合成好的siRNA用一定的方法直接导入细胞内，目前常用的方法是脂质体法，另外还有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE
葡聚糖法、显微注射法和基因法等。但上述方法转染效率低，需要进一步筛选，对原代细胞不合适。shRNA法是将合成的shRNA先整合到载体（如质粒或病毒）中，再将载体导入到细胞中发挥基因干扰效应。其中病毒由于感染效率高，既可瞬时感染又可稳定感染，在实验研究中应用较为广泛。
