20解剖学研究2021年第43卷第丨期Anat Res，2021，Vol.43, No.l
•论著•PI3K/Akt诱导激活F0X03a可防止TNF-〇a秀导的
GnRH下降
郭晗，张本斯，施荣杰、施雨辰*12*，石纯
(大理大学基础医学院人体解剖学教研室，云南大理671003)
【摘要】目的探究P13K/Akt通路对T N F-a介导的下丘脑GnRH释放减少的调节作用和机制。方法采用F0X03a敲低的GT1 -7细胞系，用P I3K激活剂740Y-P和T N F-a处理细胞，采用ELISA检测培养基中的GnRH水 平。用Western blot检测细胞中(p)-lKBot和p-A kt的磷酸化蛋白含量，用免疫荧光法对F0X03a和NF-k B的核定位 进行检测。结果PI3K/Akt通路的激活可促进F0X03a核易位，进而逆转了 T N F-a诱导的GNRH1基因抑制和NF-k B激活。通过这一机制可防止TNF-tx对GT1-7细胞释放GnRH的抑制效应。结论PI3K/Akt通路的激活有助于 防止衰老相关的下丘脑GnRH释放减少。 【关键词】促性腺激素释放激素；衰老；NF-k B;F0X03a
PI3K/Akt-induced activation of F0X03a prevents TNF-a-induced GnRH decline GUO Han, ZHANG Ben-
si, SHI Rong-jie, SHI Yu-chen t SHI Chun.Department o f Human Anatomy of Basic Medical College, Dali University, Dali, Yunnan Province 671003, China
Corresponding author: SHI Chun, E-mail:*******************
【Abstract】Objective To investigate the effect of PI3K/Akt on TNF-a-induced hypothalamic GnRH decline. Meth-ods GT1-7 cells were treated with PI3K activator (740 Y-P) and TNF-a. GnRH level in the medium was detected by ELISA method. p-lKBa and p-Akt were analyzed using western blot. The nuclear localization of F0X03a and NF-k B were analyzed by using western blot and immunofluorescence. Results The current study revealed that PI3K/Akt-induced F0X03a nuclear translocation protects GnRH neurons from TNF-a-induced decrease of GnRH release through preventing TNF-a-induced GNRH1 gene inhibition and NF-k B activation. Conclusion The results of the present study provided novel insights into the mechanisms underlying aging-associated hypothalamic GnRH decline.
【Key words】Gonadotropin-releasing hormone; Aging; Nuclear factor-k B; Forkhead box protein 03a
下丘脑是中枢神经内分泌系统的重要组成部 分，可调节脑与周围神经系统之间的相互作用'_2]。在最
近的一项研究中，衰老已被证明由下 丘脑调控；下丘脑驱动的程序性衰老与NF-k B介 导的GnRH下降以及GnRH下降引起的神经发生 障碍有关2。然而，衰老过程中下丘脑GnRH释放 减少的分子机制尚不完全清楚。研究发现衰老与 F0X0家族的活性增加有关；F0X0介导的细胞质
基金项目：国家自然科学基金（8丨960264 >；大理大学神经生物学创新团队（202005 AF150014)；云南省李云庆专家丁.作站(ZKLX2019108)
1.大理大学第一附属医院消化内科，云南大理67丨003
2. 南华大学衡阳医学院，湖南衡阳421000
通讯作者：石纯，Email:*******************量控制在衰老过程中起着重要作用〃]。针对 F0X0的方法可预防多种与衰老相关的疾病，例如认知能力下降、癌症、糖尿病和心血管疾病5。此外，F0X03a变异与许多种的寿命有 关6:。F0X03a被认为是PI3K/AKT通路的关键靶 点[79]。然而，PI3K/Akt诱导的F0X03a的激活是 否对衰老相关的GnRH下降有影响仍有待确定。本研究旨在探讨P13K/Akt诱导的F0X03a激活是 否调节了衰老相关的GnRH下降。
1材料和方法
1.1材料
GT1-7 细胞（Bio V ector NTCC公司），10 %FBS、100 IU/m l 青霉素、100 g/m l链霉素（Invitrogen ，
Therm o Fisher Scientific 公司），100 |jL g /m l 多聚赖氨 酸（Sigma - Aldrich 公司，Merck - KGaA 公司）， F 0X 03a shRNA 表达质粒（Origene Technologies 公 司），阴性“干扰”对照、包装质粒（PCMV -dr 8.2 dvpr )、包膜质粒（pCMV -VSV -G 、GNRHl 基因启动 子荧光素酶报告质粒（47.5 ng /孔）（武汉淼灵 http ://www .miaolingbio /)，FuGENE 6 (Prom ega 公司）、MP 丨3K 激活剂 740 Y -P ( ApexBio )、TNF -ct(R & D Systems )、黄体生成素释放激素（LHRH)Elisa 试剂盒（MyBioSource 公司）、Victor - 2 ( Multilahd counter )焚光免疫分析仪（Perkin -Elmer 公司）、含 有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物的裂解缓冲液 (Cell Signaling Technology 公司）、p -lKBa ( 1: 1000; Cell Signaling Technology 公司），p 65 抗体（1: 4000)、GAPDH ( 1: 1000, Abeam 公司），1: 3000 山 羊抗小鼠丨gG -HRP 、F 0X 03a 、1: 5000辣根过氧化 物酶标记的羊抗兔 IgG 、Actiii、lam in A(Santa Cruz Biotechnology 公司），尼康 Eclipse E 600 显微镜（尼 康公司）、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Ther m o Fislier Scientific 公司 ）， 等。1.2方法
1.2.1细胞培养GT 1-7细胞采用含10%胎牛血 清，100 IU /ml 青霉素和100 g /ml 链霉素的D M EM 培养基，371、5%C 02恒温培养。同时从E 17 CD 1 小鼠胚胎中分离出下丘脑原代神经元'°。从胚胎 小鼠中共分离出5个下丘脑，经研磨分离成单细 胞悬液，转移到含有DMEM 培养基、10%胎牛血 清、1
0%热灭活马血清、1%青霉素链霉素和20 m m ol /LD -葡萄糖的培养基中。将细胞悬液加人 涂布有100 pg /ml 多聚赖氨酸的培养皿中于371、 5 % C 02的条件下培养。
1.2.2 F 0X 03a 敲低细胞系的构建参照Shi 等 1112 的方法，使用 FuGENE 6 将 F 0X 03a shRNA 表达质粒和对照慢病毒质粒，包装质粒（pCMV - dr 8.2 dvp )和包膜质粒（pCMV -VSV -G )转染到 HEK 293T 细胞中。感染3(1后收集含病毒的上清 液，加入p 〇lybrene (8 jjig /ml )后感染GT 1-7细胞或 下丘脑原代神经元。经嘌呤霉素2 pg /ml 筛选3 d 获得F 0X 03a 敲低细胞。
1.2.3药物处理分别在添加和不加20 |xniol/L 的PI 3K 激活剂740 Y -P 的情况下，用25 ng /m l 的 TNF -a 处理细胞12 h 。对照组中加入等量的 PBS 。所有处理均在无血清DMEM 中进行。
解剖学研究202丨年第43卷第1期 A m u 1^. 2021. V 〇l . 43. I
1.2.4 GnRH 释放检测GnRH 水平用黄体生成素 释放激素（LHRH )Elisa 试剂盒进行测定[13]〇药物 处理后收集细胞培养液，根据试剂盒说明书的步甘肃省人口与计划生育条例
骤测定释放到培养基中的GnRH 的含量。Victor -2 (Multilabel counter )荧光免疫分析仪上读取450 nm 的分光光度数据。
1.2.5 Akt 和I k B c k 磷酸化水平根据参考文献'S 采用W estern blot 法检测磷酸化Akt (p -Akt )、憐酸
化 iKBa (p -lKBa )的蛋白表达水平。TNF -cx 处理后，细 胞在含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物的裂解缓冲 液中裂解。细胞裂解液经SDS -PAGE 凝胶电泳后转 移至PVDF 膜。然后用p -I k B 抗体（1: 1000) X AP -
d H C 1:1000) 、p -Akt ( 1:1000) 或总 Akt ( 1:1000) 的一
抗与膜进行孵育，然后再用1:3000山羊抗小鼠IgG - HRP 来孵育。使用配备有“ Quantity One ”软件包的 BioRad GS 800密度计对蛋白条带进行定量。1.2.6 F 0X 03a 和 N F -k B 的核定位使用 Western blot 分析F 0X 03a 和NF - k B 的核定位情况。药物 处理后，细胞在亚细胞分离缓冲液（250 m m ol /L 蔗 糖、20 m m ol/L HEPES;pH 7.4; 10 m m ol/L KC 1、1.5 m m ol/L 氯化镁、1 m m ol/L EDTA 、1 m m ol/L EGTA 、1 m m ol/L PVDF 、1 m m ol /L 二硫苏糖醇）中裂解0使 细胞裂解物反复通过25号针头约10次，并在冰上 畔育20 min ，之后以3 000 rpm 离心5 min 后得到 胞核沉淀。取上清液以8 000 rpm 离心10 min 后 得到胞质颗粒。核组分和胞质组分与SDS loading dye 混合，经SDS - PAGE 电泳后转移到PVDF 膜 上。用 F 0X 03a (l :l 000)或 p 65 (]:4 000)抗体与 膜进行孵育，然后采用1 :5 000辣根过氧化物酶标 记的羊抗兔IgG 与膜进行孵育。
同时采用用免疫荧光法分析F 0X 03a 和NF -
k B 的核定位。细胞在多聚-I .-赖氨酸包被的盖玻
片上生长24 h 。用4%甲醛固定细胞15 min 后，用 PBS 冲洗，然后用 1%FBS 、2%BSA 和 0.1%Triton X - 100封闭l h 。在常温下，将含有抗F 0X 01或抗
N F -k B
抗体的PBS 加人细胞，孵育3 h ，然后与异
硫氰酸荧光素酯偶联的二抗（稀释度1: 250)和 DAPI (1 m g /ml )畔育 1 h 。用尼康 Eclipse E 600 显 微镜观察细胞。
1.2.7 GNRH 1启动子活性参照双荧光素酶报告 基因检测试剂盒说明书测定GNRH 1启动子活 性。将细胞以l .OxlO 4个/孔的密度接种在96孔板 中培养12 h 。然后用lipofectamine 将GNRH 1基因
21
vehicle TNF-<
□ WT Q sh-foxo3a
TNF-a+PI3K activator
PI3K activator
control
PI3K activator
activator
：：C \ Il'-u l
□ nucleus
月刊锦鲤F0X()3a
control
PI3K activator
control
PI3K activator
F0X03a
出乌兰记F0X03a
DAPI
Merge
启动子荧光素酶报告质粒（pGL 3-Basic -GNRHl - promoter 质粒)转染细胞，培养48h 14:。同时，用海 肾荧光素酶质粒PRL -SV 40转染细胞（47.5 ng /孔； Promega 公司）作为内参照。细胞经药物处理后裂 解，使用Victor -2( Multila 丨)el counter )突光免疫分析 仪进行荧光素酶双重检测，过程均严格按照说明 书进行。试验重复3次。1.3统计学分析
全部数据均以均数±标准差表示，统计 分析采用15.0版SPSS 软件。数据的正态分布分 析米用Ryan -joiner 检验，方差齐性分析米用Lev - ene 等方差检验。两组均数比较采用两独立样本Z 检验。多组均数比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 激活 PI 3K /Akt /F 0X 03a 通路可防止 TNF-oc 诱导的GnRH 下降
22〇
为了研究PI 3K 通路的激活是否对衰老相关 的GnRH 的降低有影响，分别在添加PI 3K 激活剂 和不加PI 3K 激活剂的情况下，用TNF -a 处理GT 1 - 7细胞。发现TNF -a 可显著减少GnRH 的释放(P < 0.01)；用PI 3K 激活剂处理细胞可以防止TNF -a 诱 导的GnRH 下降（？<0.0丨），这种现象可以通过敲 低F 0X 03a 来逆转（图1A )。由于已经确定Akt 和 F 0X 03a 是PI 3K 的直接底物'因此，本文进一步 探索了 Akt 和F 0X 03a 是否参与了 PI 3K 激活剂对 GnRH 减低的保护作用。我们观察到PI 3K 激活剂 使Alct 发生了磷酸化，并增强了 F 0X 03a 的核定位 (P <0.01，图 1B -D )。这些结果表明 PI 3K /Akt / F 0X 03a 途径的激活能够防止由TNF -a 诱导的 GnRH 下降。
2.2激活PI 3K /Akt /F 0X 03a 通路可防止TNF-a 诱 导的GnRH 1基因抑制
已经有研究表明，与衰老相关的GnRH 降低 与下丘脑GnRHl 启动子活性降低有关''2:。在本
p i 3K
解剖学研究202丨年第43卷第I期 Anat Hes, 2021. V ()l . 43. V U
图1激活PI3K/Akt/F0X03a 通路可防止TNF-a 诱导的GnRH 下降A .不同处理组释放的GnKH 的水平；B .用Western hlot 分
析不同处理组A kt 的磷酸化水平；C .用Western blot 分析不同处理组胞核和胞质的F 0X 03a 水平*与contro 丨组比较，/^<0.01 ; D .免疫荧光 法分析F 0X 03a 在胞质及胞核中的定位（X 200)
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解剖学研究 2021 年第 43 卷第 1 期 Anat Res, 2021，Vol. 43. No.l 23
研究中，TNF -a 可使GnRHl 启动子活性降低到 50% ，说明TNF - a 通过抑制GnRH 1基因而降低 GnRH 的释放。我们的研究发现，PI 3K 激动剂可 阻断TNF -a 对GnRHl 启动子活性的抑制（P <0.01;
马加爵犯罪心理分析图2)。而PI 3K 激活剂对F 0X 03a 敲低细胞没有影 响（图2)。这一结果表明，PI 3K /Akt /F 0X 03a 途径 的激活可以阻止通过TNF -a 诱导对GnRH 丨产生 的抑制效应。
2.3激活PI 3K /F 0X 03a 通路可阻止TNF-oc 诱导 的NF -k B 活化
N F -k B
与I k B cx 蛋白相结合，以非活性形式存
在于细胞质中，I k B cx 蛋白是具有抑制N F -k B 功能 的I k B 家族的成员；N F -k B 可以通过多种机制被 激活，如I k B c x 磷酸化后的I k B c x 降解:|516;。本研究 发现，TNF -a 可促进I k B c (磷酸化并增强N F -k B 的 核定位（P <0.01)；用TNF -ct 处理GT 1-7细胞可以激
图2
激活PI3K/Akt/F0X03a 通路可逆转T N F-a 诱导的
GNRH1基因抑制用双荧光素酶试剂盒测定GNKH1启动子
活性。*与contml 组比较，P<0.0l
活NF - k B 信号传导。此外，PI 3 K 激活剂能够阻止 TNF -ct 诱导产生iK B a 的磷酸化和N F -k B 的核易 位（P <0.01)；而PI 3K 激活剂对F 0X 03a 敲低细胞 无影响(图3)。这一结果提示PI 3K /Akt /F 0X 03a 通路可阻止TNF-a 诱导的NF -k B 活化。
图3激活PI3K/AKT/F0X03a 通路可阻止TN F-a 诱导的NF-k B 活化 A.用Western Wot 分析不同处理组p-UBcx 水平；B .用
Western blot 分析不同处理组细胞核和胞质中NF-k B p65的表达。*与contro 丨组比较，/><0.01
C .D.分别在添加PI3K 激活剂和不加PI3K
激活剂的情况下，用TNF-o(处理对照shRNA 转染的细胞（C )和F0X 03a 转染细胞（D )l2h ，用免疫荧光法分析NF-k B 在胞质/胞核的定位 情况
2.4激活PI 3K /Akt /F 0X 03a 通路可防止TNF-a a 诱导的GnRH 下降，我们在下丘脑原代神经元上 诱导的下丘脑原代神经元释放的GnRH 下降
重复了上述实验。结果表明，TNF-a 能显著减少为了证实PI 3K /Akt /F 0X 03a 通路参与了 TNF -
下丘脑原代神经元释放GnRH (P <0.01)；用P 13
K
激活剂处理细胞可以防止TNF-a诱导的〇111^下 降(/^O.O l)，这一作用可被F0X03a的敲低所逆转(图4)。
24
activator
图4激活PI3K/Akt/F0X03a通路可阻止T N F-a诱导的下丘脑原代神经元GnRH释放减少通过E lA试剂盒测量释放到培养基中的G nR H *与c o n tro l组相比，/><0.01
3讨论
已有文献表明下丘脑通过释放GnRH来控制 衰老的速度，并且衰老与下丘脑炎症有关，而下丘 脑炎症与活化小胶质细胞所释放的炎症细胞因子 (如TNF-a)有关[|i。在早期衰老过程中，在下丘 脑中可以观察到TNF-a的积累，这可能是导致NF -k B信号通路激活的原因。先前的一项研究表 明，TNF-a通过激活N F-k B信号通路来减少GnRH 的释放"3]。为了支持这一发现，我们的研究表明，TNF-a抑制GnRH的释放并促进NF-k B核易位。然而，调控衰老相关GnRH下降的机制尚未确定。
哺乳动物的FOXO家族包括FOXO1、3a、4和6[17]。FOXO蛋白的磷酸化是调控其活性的关键 机制之一[3'm8]。未磷酸化的FOXO因子主要位于 细胞核，在细胞核中调节与细胞周期，细胞死亡和 氧化应激反应相关的基因[|9]。F0X03a已被证明 是许多不同细胞系中PI3K/AKT通路的关键靶点〜_2°]。例如，在生长因子存在的情况下，许多 FOXO因子被Akt磷酸化，导致它们从细胞核转移 到细胞质[3•21
22]。Bao等心研究显示PI3K/AKT通 路通过F0X03a向细胞核的易位介导高血糖诱导 的新生大鼠心室肌细胞凋亡。L u等[2°]用 LY294002抑制PI3K/AKT通路可显著降低脂多糖 诱导的脊髓细胞F0X03a蛋白水平，促进TNF-a 的释放。衰老与FOXO家族的活性增加有关〜]。F0X03a变异与许多种的寿命有关〜。在一项 使用成年大鼠脊髓损伤的活体研究中，PI3K/Akt/ F0X03a通路已被揭示通过减少TNF-a产生来促 进神经元再生[2°]。这些结果提示PI3K/Akt/F0X03a通路的激活可能会逆转衰老相关的GnRH下降。在本研究中，PI3K/Akt/F0X03a途径 通过逆转TNF-ot引起的GNRH1基因抑制和NF-k B激活，可预防TNF-a引起的GnRH下降。
先前有报道称与衰老相关的下丘脑GnRH分 泌减少与炎症引起的下丘脑GnRH启动子活性降 低有关本研究发现TNF-a抑制了 GNRH1启动子活性，支持了这一结论。PI3K/Akt/F0X03a途 径可阻止TNF-a诱导的GNRH1启动子活性的抑 制，这表明PI3K/Akt/F0X03a途径通过调节GNRH1基因来预防TNF-a诱导的GnRH下降。衰 老与下丘脑GnRH释放减少有关，这已被证明是 由NF-k B信号介导的14。处于非活性状态的NF-k B定位于细胞质中，并与I k B c x结合多效性
细胞外因子可以启动磷酸化级联反应，导致蛋白 酶体降解IK B a，使活化的NF-k B易位到细胞核#16。NF-k B的活性受多种不同机制的调节，如I k B的降解[15_16]。本研究发现TNF-cx可促使GT1-7 细胞中I k B的磷酸化和NF-k B的活化。而PI3K/ Akt/F0X03a通路可抑制TNF-o[诱导的NF-k B信 号传导，提示PI3K/Akt/F0X03a通路可通过I k B抑制NF-k B的活化。NF-k B参与了衰老相关的下丘 脑GNR
H1启动子活性降低和GnRH释放减少U2]。而本研究提示PI3K/Akt/F0X03a途径可能 通过直接抑制GNRH1基因和/或通过促进NF-k B 活化间接抑制GNRH1启动子活性来阻止TNF-a 诱导的GnRH下降。
综上所述，PI3K/Akt/F0X03a通路可通过防 止TNF-a引起的GNRH1基因抑制和N F-k B活化，进而逆转TNF-a引起的GnRH下降（图5)。本研 究结果将有助于了解与衰老相关的下丘脑GnRH 下降的潜在机制。
解剖学研究202丨年第43卷第1期Anat Res，202丨.Vol.43, No.1
图5 PI3K/Akt/F0X03a途径通过逆转T N F-a引起的GNRH1基因抑制和NF- k B活化来防止T N F-a诱导的GnRH
下降
