首先，需要知道基因序列，如，我们要设计rat的 CK18 mRNA检测的引物，我们先到bi.v/ 这个网站查CK18
mRNA的基因序列，云南卫视自然密码
比较优势理论首先选择Nucleotide 然后在搜索栏输入基因序列号（如果不知道基因序列号则输入 rat CK18）如图
然后点击搜索，就会出现rat CK18 mRNA的基因序列 现在，往下拉就会看到基因序列
人宇科学
将这个序列复制到primer 6.0中就可以进行引物设计，
我们先打开peimer 6.0
破解版打开会出现这个对话框，关闭即可
将序列复制至这个对话框
点击 Add
出现下面对话框，这里可以选择引物在序列哪些地方设计引物，我一般不更改，也就是引物可以设计在整个序列，你也可查一下序列有几个区，一般引物应该跨两个区。
之后点击 primer Parameters
这里可以设置退火温度、引物长度、产物长度等，我一般只是更改产物长度，我一般设为100到300bp，因为如果产物太大，在染料法中会影响扩增效率，
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索溪峪的野教学实录之后点击 Search 之后出现下面对话框
点击OK 出现下面引物序列
这个时候引物设计完成，我们需要对引物进行验证，我一般到NCBI（bi.v/）上验证，进去后点击最下面菜单中的BLAST
之后点击Primer-BLAST
将前引物复制到图中位置
将后引物复制（注复制前引物用 Copy Sense Primer，复制后引物用Copy Anti-sence Primer 点击右键即出现复制菜单）
