2.目标片段的PCR扩增
3.载体和目标片段的限制性酶切
4.连接转化
5.挑取克隆提质粒
6.单克隆的验证及送样测序。
载体的选择
实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位 点分析结果来选择载体。举例如下：
实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。应选用真核表达载体pCI-NEO或pCDNA3.1。
引物设计
引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。
载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便western blot检测蛋白是否表达。常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。
Flag标签：
D Y K D D D D K
GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG
6XHis标签：
H H H H H H
CAC CAC CAC CAC CAC CAC
缘HA标签：
Y P Y D V P D Y A
TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT
Myc标签：
E Q K L I S E E D L
释永修
这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。 翻译是从mRNA的5‘端开始，而蛋白质合成是从N端到C端，所以若要把标签加在N端，标
签所对应的核苷酸序列应位于ATG之后，若是加在C端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终止密码子TAA之前。
对于真核表达载体，蛋白在真核生物中表达时切记应加入kozak序列，kozak序列是核糖体在识别mRNA上起始位点时的必须元件，蛋白在翻译表达时时从kozak序列后的第一个ATG开始翻译。并且，kozak序列的存在可以使蛋白的翻译表达效率提高很多倍。
根据以上原则，仍然以MYC为例：
1.在NCBI中查MYC的CDS序列。
2.将序列复制粘贴至DNAMAN中分析：
在这些不含有的酶切位点中选择与载体对应的酶切位点，本次举例选择pCDNA3.1
所选择的酶切位点为KpnI和XhoI.
引物设计如下： 酶切位点 Flag标签
MYC-PCD-KpnI-Flag-F:GG GGTACC GCCACC ATG GATTACAAGGATGACGACGATAAG
保护碱基 kozak atg
GATTTTTTTCGGGTAGTGGA
MYC上游引物
垮桥
酶切位点 MYC下游引物
MYC-PCD-XhoI--R:CC CTCGAG ATT CGCACAAGAGTTCCGTAGCT
保护碱基 终止子
目标片段的PCR扩增和回收
因为后续将目的片段插入之后做的是表达，所以不能引入突变，我们实验室用的是Q5高保真酶，PCR扩增体系如下：
Q5 reaction Buffer 10ul
Q5 GC enhancer 10ul
模板 gDNA(50ng)/cDNA(25ng)/质粒(0.1-1ng)/PCR产物(0.01-0.1ng)
dNTP(10mM) 1ul
网站生成系统F（10uM） 1ul
R（10uM） 1ul
Q5 0.5ul
ddH2O to 50ul
PCR扩增时是呈指数增长，即使只有少量模板，也能得到大量的目标片段，反之若模板含量过多，则会是的引物与模板非特异结合，扩增出非特异片段。
引物也不宜加多，引物过量会使得引物自身之间相互结合，扩增之后产生过多的引物二聚
体。
获得PCR产物之后，产物里有酶，dNTP,引物二聚体和目标片段，所以需要切胶回收获得较纯的目标片段。切胶回收组内有相应的试剂盒，流程如下：
（1）紫外灯下切除含有目的基因的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，尽量减少不含目的基因的凝胶量，称重（1mg=1ul），切碎凝胶，装入2mL PCR管中。 （2）加入3倍体积的Buffer A溶液，75℃水浴锅加热直至凝胶完全融化。
（3）加入1/2Buffer A体积的Buffer B ，观察溶液颜由红变黄，并无明显颗粒，表示凝胶融化完全。
（4）吸取上述步骤中的溶液并转移到制备管（置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中） ，12,000×g离心1 min，弃滤液。
（5）将制备管置回离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g离心1 min，弃滤液
（6）将制备管置回离心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g离心1 min，弃滤液；以同样
的方法再用700 μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液。
* 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。
（7）将制备管置回2 ml离心管中，12,000×g离心1 min。
（8）山东省供热管理办法将制备管移入新的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加25~40μl Eluent，室温静置1 min。12,000×g离心1 min。
载体质粒的扩繁
转化
（1）取2μl 质粒加到1.5mLEP管中，并放置于冰上。
（2）取30μl 大肠杆菌DH5α感受态细胞加入质粒中，冰上放置30min。
（3）将水浴锅调至42℃，将上述混合液放在水浴锅中热激1min30s。
（4）取出热激后的混合液，冰上放置2min，加300ul SOC培养基。
（5）再放置37℃，190rpm摇床上培养1小时
（6）取50ul涂布相应抗性的LB固体培养基，放在37℃温箱中过夜培养。
质粒提取
（1） 常熟地震挑取培养基上的单菌落于含有10ml液体LB培养基的50ml培养瓶中37℃过夜培养
（2） 取1-4 ml上述过夜的菌液12,000×g 离心1 min，弃尽上清。
（2）加250 μl Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
