学院：______ 班级:_______ 学号:_________ 姓名:__________ 成绩：______
目的：
1、掌握常规引物设计的原则及操作流程。
2、熟悉简并引物设计的原理及操作方法。
3、熟悉引物设计软件及在线引物设计工具的操作方法。
4、掌握使用相关软件及在线工具分析测序结果的方法。
内容：
1、使用Primer Premier、Oligo、BLAST等软件及在线工具进行常规引物设计，并对引物扩增效率、特异性进行评价。
2、使用DNAMAN软件进行常规引物快速设计。
3、使用NCBI中的在线引物设计工具Primer-BLAST快速设计引物。
4、使用在线工具CODEHOP设计简并引物。
5、使用Chromas、BioEdit软件查阅测序结果峰图文件。
6、使用DNAMAN慢性再生障碍性贫血软件对测序序列进行编辑，进行序列拼接。 软硬件要求：
联网计算机，预装Windows 7操作系统，预装电流变换器IE或Chrome浏览器、英汉电子词典（有道词典或金山词霸），预装DNAMAN7、Primer Premier5、Oligo7、Chromas、BioEdit等生物信息学分析软件。
操作及问题：
一、Primer Premier5、Oligo7、BLAST常规引物设计
本部分操作将使用Primer Premier5、Oligo7、BLAST等软件及工具设计拟南芥AtBADH基因编码区全长特异引物。（参考“第四章引物设计及测序结果分析”课件）
（一）使用Primer Premier5搜索引物
1、在NCBI数据中查登录号为NM_001198470的序列记录，查阅相关信息，并下载序列将其保存为fasta格式文件。
问题1：该序列是什么类型的序列？该序列编码区在什么位置？
2、打开Primer premier5软件，点击file→new→DNA sequence，使用快捷键ctrl+V将上一步中下载的序列粘贴入弹出的GeneTank窗口中（或者点击file→open→DNA sequence，选择上一步保存的文件并打开）。
山西省发布第1号总林长令3、点击GeneTank窗口中左上角的Primer按钮，在弹出的Primer premier窗口中点击Search，在弹出的Search Criteria窗口中根据要求选择合适选项及参数，选定后，点击OK，如弹出的Search Progress窗口中有OK按钮选项，点击OK，弹出Search Results窗口；如没有出现OK按钮，则改变引物筛选条件及参数重新搜索引物。
4、点击Search Results窗口中某对引物，在Primer premier窗口中查看选中引物的详细信息，初步判断引物质量。
5、点击程序主窗口中Edit→Copy，将选中引物保存在新建文档中，供后续步骤继续分析。
（二）使用Oligo7评价引物
1、打开Oligo7软件，点击File→Open法打开基因序列（即NM_001198470），或点击File→New sequence粘贴基因序列，熟悉窗口中各项功能。
2、点击菜单Edit→Forward Primer，将Primer premier5设计的一条上游引物粘入弹出窗口，点击√接受输入，点击Edit→Upper Primer选中该引物作为上游引物。同理点击菜单Edit→Reverse Primer，将Primer premier5设计的一条下游引物粘入弹出窗口，点击√接受输入，点击Edit→Lower Primer选中该引物作为下游引物。
3、依次点击菜单Analyze中的Key Info、Duplex Formation、Hairpin Formation、Composition and Tm、False Priming Sites，查看软件对所选引物对的评价。
4、点击菜单Analyze中的PCR，查看软件对该对引物的PCR反应的归纳。
5、依次将Primer premier5设计的各对引物载入Oligo进行评价，选择合适的引物。如未能发现完全满足要求的引物，可通过在引物末端去掉一个不满意的碱基或加上一个碱基，再对其评价分析是否可用。
（三）使用在线BLAST分析引物特异性
1、打开NCBI BLAST程序页面（bi.i），点击Basic BLAST下面的nucleotide BLAST，进入新页面。
2、在Enter Query Sequence下面的框内连续输入上游引物、20个以上的N、下游引物的反向互补序列，在Choose Search Set下面Datebase后选择Others，点击下方BLAST按钮开始运行程序。
3、根据BLAST结果分析该对引物的特异性，如果匹配的序列均为该基因的同源基因，则特异性好，如出现其他基因，需根据具体实验目的评价特异性。
问题2、写出你最终确定的引物序列，并说明引物的位置、Tm值、扩增产物大小等信息。
二、DNAMAN软件常规引物设计
DNAMAN是美国Lynnon Biosoft公司开发的高度集成化的分子生物学应用软件，可以用于多重序列比对、PCR 引物设计、限制性酶切分析、质粒绘图、蛋白质分析等，几乎囊括了所有日常核酸、蛋白质序列的分析工作。本次实验以拟南芥甜菜碱醛脱氢酶基因（NM_001198470）为例，利用DNAMAN软件进行快速引物设计。
1、打开DNAMAN软件，将基因序列通过菜单sequence中的load sequence载入channel 1（也可通过点击File→Open或File→New等方式载入序列）。
2、点击选择channel 1，点击菜单primer→design PCR primers for DNA，在弹出的窗口中根据扩增需要调整相应参数，点击Next按钮，查看筛选到的引物及引物对。
3、对于筛选到的引物可继续使用Oligo、BLAST进行引物结构及特异性评价。
三、在线工具Primer-BLAST引物设计
Primer-BLAST是整合于NCBI的一款在线引物设计工具，该工具将Primer和BLAST合二为一，即将引物设计和特异性比对一步完成，从而快速筛选获得所需的合适引物。现仍以序列NM_001198470为例设计常规引物。
1、打开NCBI BLAST页面，点击页面下方specialized BLAST中的Primer-BLAST链接，进入引物设计页面。
2、将PCR模板序列粘贴在PCR Template框中，选择相应参数限定搜索条件。
3、点击页面最下方Get Primers按钮，进入引物筛选结果页面，根据实验需求选择合适的引物用于实验。
四、在线工具CODEHOP简并引物设计
本实验介绍使用在线工具CODEHOP根据多个HMGR同源基因蛋白质序列设计简并引物的方法。
1、从NCBI数据库获取5条HMGR蛋白质序列，登录号依次为AAK95406、BAA36291、P48020、绝对大牌NP_177775、NP_179329。
2、登录Blockmaker页面/blocks/blockmkr/make_
blocks.html，对上述5个序列进行Block比对，得到高度保守区域。
3、在Block results界面上直接点击CODEHOP，登录CODEHOP数据库，进行引物搜索，并参照简并引物设计的原则设定相关参数，在密码子选用框（codon usage table）中选用与目标物种亲缘关系较近的物种，在此我们选择Arabidopsis thaliana。
4、根据简并引物设计原则，在搜索结果中选择合适上下游引物。
问题3、写出你选择的一对简并引物，计算其简并度。
短信写手五、测序结果文件查阅
测序分析是分子生物学实验中的日常操作之一。一般情况下，单次测序反应将产生600-1000bp的核酸序列。这一过程通过全自动测序仪完成。送交专业公司进行测序的结果返回后，测序结果需使用特定软件将将碱基读出（base calling），并对所测序列进行一系统后续分析，其中主要包括载体序列的去除和序列拼接。
1、 测序峰图的查看
主要目的是核实测序的质量与准确性。测序峰图可以由程序打开，也可以由BioEdit及DNAstar软件打开。
