转一步一步教你使用NCBI 查DNA、引物设计、BLAST 序列比对 [i=s] 本帖最后由绝地重生于2012-10-6 20:13 编辑[/i]
原始版本下载：[url=d.dxy/preview/2096690]d.dxy/preview/2096690[/url]
最近看到很多战友在论坛上询问如何查询[size=12px]基因序列、如何进行引物设计、如何使用 [/size]BLAST 进行序列比对……，这些问题在NCBI 上都可以方便的到答案。现在我就结合我自
己使用NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下BCBI 的使用。希望大家都能发表自己的使 用心得，让我们共同进步！
我分以下几个部分说一下NCBI 的使用：
Part one 如何查基因序列、mRNA、Promoter
Part two 如何查连续的mRNA、cDNA、蛋白序列
Part three 运用STS 查已经公布的引物序列
Part four 如何运用BLAST 进行序列比对、检验引物特异性
特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！
从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我
投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！
请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高
的战友给予补充
First of all，还是让我们从查基因序列开始。
[size=24px][b]第一部分利用Map viewer 查基因序列、mRNA 序列、
启动子（Promoter）
[/b][/size]
下面以人的IL6（白细胞介素6）为例讲述一下具体的操作步骤
1．打开Map viewer 页面，网址为：[url=bi.v/mapview/index.html][color=#0066cc]bi.nlm.nih. gov/mapview/index.html[/color][/url] 在search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：
3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter，下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：
说明一下：1、染体的红区域即为你的目的基因所处位置。2、下面参考序列给出了
三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。现在普遍采用的是最上面的那个序列，这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的一个序列。我也推荐大家使用这个序列。
4．点击上述三条序列第一条序列（即reference）对应的"Genes seq"，出现新的页面，
页面下方为：
[img=670,148]b309.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/i.mME95Q1Iurpyt3ZCefkba qogaY7nRU4nayjgk.jPg!/b/dLLIMLi7NAAA[/img]
5．点击上图出现的“Download/View Sequence/Evidence ”，即下载查看序列等功能，
结果如图所示：
[img=670,310]b309.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/H9dJGpRbJPuDd0gxtV3Uj NPPRdOtn8KXAgF*lYvpj2g!/b/dCBnO7giNQAA[/img]
先对上面这张图做点简要的说明，在Sequence Format（序列输出格式）后面是一个下
拉式选择菜单，默认的为FASTA 格式，还有一个是GenBank 格式。我推荐大家选择GenBnak
格式，因为这个格式提供了很多该基因的信息，而FASTA格式只有基因序列。
6．在Sequence Format 后选择GenBank，然后点击下面的Display，目的基因的相关
信息和序列就出现在眼前了。点击后如图所示（网页较大，只抓取一小部分以作示范）：
[img=670,557]b310.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/cJKuA572zjj9zz69MWkPQ kBL
C6rIth99m0HKA1AiZLA!/b/dItPybheJwAA[/img]世界史论文
在上述打开的网页中，你可以看到基因长度，基因序列，以及这个基因是如何被报道出
来的等各种信息。
你会看到: mRNA join(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..8394)
这代表了从基因的3598位开始就是转录区了，即我们常说的mRNA 片断，由于内含子的存在，
所以mRNA 在DNA 序列上分成了几段。
CDS join(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..7970)
CDS 代表编码序列，即蛋白编码区是从3660 开始的（ATG），由于剪接作用所以CDS 区也是不连续的。
说到这里，可能很多朋友都已经明白了promoter 即启动子区域在哪里了。但我还是再
唠叨几句：转录起始位点前面是基因的调控区，启动子区没有明显的位置定义，大家也只是
猜测它的大体位置，如果你要研究promoter 区的话，建议你选择转录起始位点前的2000 个碱基进行研究，一般默认的是这样。当然你如果觉得长度太长不好研究的话，也可以只研究-1000 到0这一千个碱基，因为一般情况下，启动子区的变异都在这个区域内。
李培根记忆这样大家就可以到自己的目的基因序列和启动子了，这种方法可能使用的人不是很
多，但我个人比较喜欢，因为它最大的优点是可以到启动子区域和其他调控区域。希望大家可以发帖交流，让我们把NCBI 用的更好！
6
[size=24px][b]第二部分如何查连续的mRNA、cDNA、蛋白序列（依
然以人类的IL6 为例）
[/b][/size]1．进入NCBI 主页：[url=bi.v/][color=#0066cc]bi.v/[/color][/url]
在search 后面选择Gene，在for 后面填写需要查的基因的名字。如图所示：
[img=670,561]b308.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/ds.VizNq3EJDn0jsiRL8yU MWrLWBs64L0fao8AcZvRQ!/b/dGgrmLe6NQAA[/img]
出现了很多基因序列，在每个序列的右边还有“Order cDNA clone” 的链接，这些序
列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是别名（Other Aliases）与你的目的基因一致，根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。上图中我需要的IL6 是标号为2的序列。
2.1 查cDNA 序列
2.1.1 点击Order cDNA clone, 出现目的页面如图所示：
[img=670,469]b309.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/Lm1nF6E1titMGJtF6mJb9V ohGAHGegMmc*6vxnbAU0I!/b/dP00L7jwNQAA[/img]
2.1.2 点击Clone Sequence 后面的链接即可得到cDNA 序列。点击后如图所示（只抓
取其中一部分）
[img=670,471]b311.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/.XO3S7VcoUMhvKAOI5ae qi0nmQ8HqhU0O*FsDRSoFaM!/b/dOZ2Y7kEJwAA[/img]
2.2 查mRNA、蛋白序列
回到步骤1 点击“Go”之后出现的页面，点击目的基因的名字，出现以下页面(只抓取相关部分)：
[img]b309.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/Lk9ps*.TTi.jkvA3lIV7U3A1lE0Bem Vb3oTlDnd5LZM!/b/dOnPM7gINgAA[/img]
页面的下半部分，即可以获取mRNA和蛋白序列的部分：
[img=670,455]b306.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/O*z2KmMMfrVjsMpqOZ MYmuHWJ7Wmk4z6AoD8NE3bDto!/b/dEAhcLZidwAA[/img]
到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，它分为几个板块，第一个“mRNA and
Protein ”区可以让我们到连续的编码mRNA 序列和蛋白序列。在mRNA and Protein下面有两个序列代码（中间划有一个箭头），这代表了mRNA序列和蛋白序列。分别点击就可
以得到相应的序列页面。点击后如图所示，mRNA 序列：
[img=670,509]b309.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/gct6*dNztYzPp4Z3MUgM ABc7QTXqoRTcBtVUKgPbsZY!/b/dJLjObi4NAAA[/img]
NCBI Reference Sequences (RefSeq)的第二个板块是Reference assembly，它下面显示的是Genomic ，点击Genomic 下面Reference assembly 对应的Genbank 或FASTA 即可出现编码的DNA 序列（注意：只是编码序列，其中包括内含子，但一般没有5‘非编码区）。一步就不做贴图演示了吧，
呵呵。这样我们就可以到基因的cDNA 序列、连续的编码mRNA 序列、蛋白序列以及含有内
含子的编码DNA 序列了。相信这些操作对很多战友还是有用的。
如果大家有更好的方法，欢迎发帖交流！
友情提示：在NCBI 里打开的每一个页面都会给我们提供大量的信息，大家不妨好好看看，可能会有令我们惊喜的收获！
最后唠叨一句：最近我实验比较忙，只能在深夜发帖，可能要过几天再发第三部分[Part three 运用STS 查已经公布的引物序列]，希望“期待下集”的朋友可以理解。
[p=30, 2, left][size=24px][b]第三部分运用STS 查已经公布的引物序列[/b][/size][/p][p=30, 2, left][size=24px][b][size=14px][b]STS，序列标签位点（Sequence Tagged Site）：一段短的DNA 序列（200－500 个碱基
对），这种序列在染体上只出现一次，其位置和碱基顺序都是已知的。在PCR 反应中可以
检测处STS 来，STS 适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA 的方向和特定序
列的相对位置。
以上内容基本是STS 的定义，我主张活学活用，下面就介绍一下我个人用STS 数据库查引物的一点经验。
[/b][/size][size=14px][b]还是使用人的IL6 基因为例，呵呵
1．打开NCBI 主页，在Search 后面的下拉菜单选择UniSTS，在FOR 后面填写目的基因。
操作完毕如图所示[/b][/size][/b][/size][/p][size=24px][b][size=14px][b][p=30, 2, left]
[img=577,601]b310.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/BuMnSEqqT2MUDHjYxU 4Gd82fqUAb9E6Yt9crCEddA6k!/b/dDbhyrjYJwAA[/img]
碳纤维复合材料
[/p][p=30, 2, left]这是你会发现NCBI 又提供了很多序列，下面我们还是要初步筛选我们需要的序列。
2．根据物种、目的引物所在染体的位置等选择相应序列（可能不只一个），点击。
下面以点击第一个进入的画面为例。
[img]b311.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/Vqm4Y3Ad1iX.IZtUl2d9x8i1Dze.dX ZfeSyezVn.zbg!/b/dJUabrkTJwAA[/img]
你会发现这个页面直接就给出了引物序列，PCR之后的片段长度也是给了的（247bp）。下面还有很多相关的信息……
3．点击GeneBank Accession 后面的代码，进入下一个页面。[/p][p=30, 2, left]
[img=487,430]b308.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/8EMPhJ6ETjfbEcVWFNhxj wkn7rZAHOVv43ACqmcqKGY!/b/dGeZlrdENQAA[/img]
[/p][p=30, 2, left]啊！前后引物都呈现在眼前了，还有反应体系和反应条件！其中Primer A 是前引物序
列，Primer B 则是后引物序列，并且给出了他们在DNA 序列中的位置。有兴趣的朋友可以
在序列中一下，是可以到的，不过要注意，PCR 是双链扩增，在序列中可以直接到的是Primer A 的原序列和Primer B的互补序列。
在步骤二里面我只点开了一个序列，继续打开其他的可能还会有对自己有用的引物，不
过这要你自己慢慢发掘了。
021导弹艇这种寻引物的方法有点投机取巧的味道，实用程度不是很高，但如果这里面恰好有你
想P 的片段的话，恭喜你，这些引物都是很成熟的引物，可以直接拿过来使用了。
如果想寻引物，大家可以查阅相关论文，已经报道的引物我们为什么不用呢？！既省
时间，可靠性又强。
如果这两种方法都不能到你需要的引物的话，那就自己设计吧，建议使用Primer 5 和Oligo。引物设计的详细内容我在这里就不多说了，推荐两个帖子给大家看一下，第一个是本版版主liuzeyi2002 发起的，内容很丰富，很值得学习，另一个则是我发的。
[url=www.dxy/bbs/post/view?bid=64&id=9517792&sty=1&tpg=1&age=0][color=#0066 cc]www.dxy/bbs/post/view?bid=64&id=9517792&sty=1&tpg=1&age=0[/color][/url] [url=www.dxy/bbs/post/view?bid=67&id=9523263&sty=1&tpg=1&age=0][color=#0066 cc]www.dxy/bbs/post/view?bid=67&id=9523263&sty=1&tpg=1&age=0[/color][/url] [/p] [/b][/size]
[/b][/size]第四部分如何运用BLAST 进行序列比对、检验引物特异性
[p=30, 2, left]
提到序列比对，绝大多数战友都会想到BLAST，但BLAST 的使用确实又是一个很大的难题，因为他的功能比较强悍，里面涉及到的知识比较多，而且比对结束后输出的结果参数（指
标）又很多。如果把BLAST 的使用详细的都讲出来，我想我发帖发到明天也发不完，更何况
我自己也不是完全懂得BLAST 的使用。所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列
为例来给大家介绍一下BLAST 的使用，也算是BLAST 的入门课程吧。请看帖的战友好好体会，
如果你用心看，在看帖完毕之后BLAST 的基本使用（包括其他序列的比对）应该没有问题
了。
热敏电阻
1．打开BLAST 页面，[url=bi.v/BLAST/][color=#0066cc]bi.v/BLAST/ [/color][/url] 打开后如图所示：[/p][p=30, 2, left]
[img=588,477]b307.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/Z1yBWI8AeiYobBej9.7FEL F6TlUdc4Kqc7siyj2qOXM!/b/dAu9CLeKdgAA[/img]
对上面这个页面进行一下必要的介绍：
BLAST 的这个页面主体部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂这三个短语的意思，我就不多说了；我要说
的是，可以认为这是三种序列比对的方法，或者说是BLAST 的三条途径。
第一部分BLAST Assembled Genomes 就是让你选择你要比对的物种，点击相应物种之后即可进入比对页面。
第二部分Basic BLAST 包含了5 个常用的BLAST，每一个都附有简短的介绍。
第三部分Specialized BLAST 是一些特殊目的的BLAST，如IgBLAST、SNP 等等，这个时候你就需要在Specialized BLAST部分做出适当的选择了。
总之，这是一个导航页面，它的目的是让你根据自己的比对目的选择相应的BLAST 途径。
下面以最基本的核酸序列比对来谈一下BLAST的使用，期间我也会含沙射影的说一下其他序列比对的方法。[/p][p=30, 2, left]
2．点击Basic BLAST部分的nucleotide blast 链接到一个新的页面。打开后如图所
平衡电桥示：[/p][p=30, 2, left]
[img]b309.photo.store.qq/psb?/V10eVufs3oak1c/wLrEh4*dj8yVBasHYEeGB9le5Htqe J9ovoPNCPCSWvc!/b/dNfDM7jaNQAA[/img]
介绍一下上述页面：
Enter Query Sequence 部分是让我们输入序列的，你可以直接把序列粘贴进去，也可
以上传序列，还可以选择你要比对的序列的范围（留空就代表要比对你要输入的整个序列）。Job Title 部分还可以为本次工作命一个名字。
