① Tm=55-65℃
② GC=30-80%
③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。 ④ 引物的退火温度要高，一般要在 60局域表面等离子体共振℃以上。
组份 | 加量 |
2×PCRTaqMix | 10ul |
10uMPrimer FW | |
10uMPrimer RV | |
Template DNA | 1ul |
hb集团ddH2O 混匀至20ul |
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选择特异性好，扩增效率高的引物常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA
组份 | 加量 |
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10uM 引物F/R | |
2×qPCR Mix | |
ddH2O | |
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荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。 荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线
空间2-△△方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量
a) SG不与单链DNA结合，荧光信号强度较低；
b) SG与双链DNA结合，荧光信号强度极大的增强。
不需要设计序列特异性探针和新的引物对
CUTTING POINT没有序列特异性内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析
是一种短的寡核苷酸序列，5‘末端连接有荧光报告染料，3‘端连接有荧光淬灭分子a) 报告染料R发射的能量被淬灭分子Q所吸收和淬灭； b) 聚合酶的外切核酸酶活性通过水解方式将报告染料与淬灭分子相分离导致了荧光信号的增加。
不能进行溶解曲线分析具有序列特异性，只结合到互补区双标记探针对每扩增的一个拷贝只释放一个分子的荧光染料
昂立口译
四川达县县委书记FRET 探针依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。FRET 探针可以进行溶解曲线分析
a) 扩增循环中，两个探针与靶DNA退火；
b) 供体被外部光源激发通过能量传递导致发射荧光的产生。
（MB）有一个发夹结构，在此结构的一个末端有一个荧光染料报告基团，在另一个末端有一个淬灭分子可以进行溶解曲线分析a) 的发夹结构淬灭了荧光信号；
b) 杂交后开始发射荧光信号。
激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭
