盖雪姣，韩振宇，云瀚漩，范龙兴①，彭媛①，白家磊①，宁保安①，刘颖①*
(内蒙古医科大学公共卫生学院，内蒙古呼和浩特010110)
摘要：目的基于胶体金侧流层析技术，利用寡核苷酸序列为识别探针，建立裸眼半定量检测蓖麻毒素的方法㊂方法利用 修饰生物素和FAM 的寡核苷酸序列为识别探针，与标记FAM 抗体的胶体金颗粒结合；在硝酸纤维素膜上包被链霉亲和素作为检测线，包被抗FAM 抗体的二抗作为控制线，建立蓖麻毒素裸眼检测方法，评价其特异性和重复性，并利用image J 软件进行数据处理分析，绘制检测曲线㊂结果胶体金侧流层析试纸条在120min 内完成检测，最低可检测到10ng/mL ，特异性㊁重复性良好㊂结论建立了检测蓖麻毒素的胶体金侧流层析方法，该方法无需制备相应抗体，且操作简单，可满足现场检测的需求㊂ 关键词: 蓖麻毒素; 胶体金; 寡核苷酸序列; 侧流层析; 裸眼检测 中图分类号:R991 文献标志码:A 文章编号:1001-5248(2020)12-0099-06 基金项目：国家重点研发计划课题(No.2018YFC1602600)
内蒙古自治区自然科学基金项目(No.2019MS08026)
作者简介：盖雪姣(1994-)，女，硕士研究生㊂从事流行病与食品安全相关研究工作㊂
①军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所*通信作者E-mail:yingruru@sina
蓖麻，拉丁学名Ricinus communis L.，原产于非洲东北部的索马里和肯尼亚，在全球热带地区均有广泛分布㊂蓖麻植株的茎㊁叶或蓖麻籽实中含有有毒物质，主要包括蓖麻毒素㊁蓖麻碱㊁蓖麻反应原等〔1〕㊂蓖麻毒素经化学提纯后能够溶于弱酸或水中，且理化性质较为稳定㊂从化学结构而言，蓖麻毒素是由A㊁B 两条肽链所组成的高毒性植物蛋白㊂活性蓖麻毒蛋白通过B 链介导内吞作用进入真核细胞，随后A 链从28S rRNA 中纯化出特定的腺嘌呤，从而诱导蛋白质合成失败，并最终激活细胞死亡途径
sealed lead acid battery
〔2〕
㊂蓖麻毒素
作为剧毒蛋白质，其毒性高于6000倍〔3〕㊂蓖麻毒蛋白由于其强毒性和易获得性，不但吸引科研人员的兴趣，同时也成为的利器，著名的马尔科夫毒伞案就是例子㊂开发灵敏㊁高效的检测手段是应对威胁的主要措施㊂传统的检测技术主要有放射免疫技术㊁酶联免疫吸附技术(ELISA)〔4-6〕㊁高效液相谱〔7-9〕㊁免疫PCR㊁纳米金增强光谱技术〔10-13〕等㊂但这些检测方法需
要依托昂贵仪器及专业技术人员进行，不利于在现场使用，限制其进一步应用和推广㊂胶体金侧流层析法(colloidal gold later-flow assay)是20世纪末研发的一种利用胶体金纳米粒子作为显
元件，与免疫识别技术和层析技术相结合的一种现场㊁快速检测方法㊂其基本原理是利用抗原抗体的特异性识别结合，导致胶体金在侧向层析试纸条上出现颜变化㊂利用侧向层析试纸条技术，已经实现了水中汞离子的快速测定〔14-15〕㊁以及通过信号放大实现水产品中甲霜灵〔16〕的超灵敏检测等㊂本研究基于胶体金侧流层析方法，根据蓖麻毒素A 链可以纯化出腺嘌呤，使得含有腺嘌呤的寡核苷酸序列断裂的原理，设计了生物素和FAM 共同修饰的寡核苷酸序列H1为识别探针，以此建立了裸眼检测蓖麻毒素的试纸条方法，该方法操作简单，无需大型仪器设备，可满足现场检测的需求㊂此外，本方法采用寡核苷酸链作为识别元件，无需制备蓖麻毒素抗体，降低了成本㊂
1 材料与方法
1.1 原料与仪器
LX-200掌式离心机㊁ST70-2微孔
恒温振荡器㊁OSE-DB-02制冷型五段程控金属浴㊁恒温孵育仪㊁蓖麻毒素标准品(北京翰谱医药生物研究所)㊁金黄葡萄球菌肠毒素B(SEB)(课题组自制)㊁伏马毒素标准品(山东蓝都生物科技有限公司)
㊁牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)(Sigma-Aldrich)㊁相思子毒素凝集素(军事医学研究院毒物药物研究所，北京)㊁Milenia Hybri Detect㊂所有核苷酸(ODN)均购自上海生工生物科技有限公司(中国上海)，并经高效液相谱(HPLC)纯化具体如下:
奔跑女孩钱运星现状表1 寡核苷酸序列
DNA 链序列(5'-3')
P15’-Biotin -TTT TTT TTT ATA TAT ATA-3’(18bp)P25’-TAA CAT AAT TAG GTC TTT TTT-FAM -3’(21bp)
P35’-GAC CTA ATT ATG AAA AAA AAA AAA TTA TAT ATA TAT-3’(36bp)A15’-TAA CAT AAT TAG GTC TTT TTT-Biotin -3’(21bp)A2
5’-GAC CTA ATT ATG AAA AAA AAA AAA TTA TAT ATA TAT-FAM-3’(36bp)
H1
5’-FAM-GAC CTA CTT ATG AAA AAA AAA AAA TTA TAT CTA TCT-Biotin-3’(36bp)
1.2 DNA序列设计与筛选 本研究以蓖麻毒素为目标物，根据孙洁芳等文献〔17〕，分别设计了3套寡核苷酸序列，一套是：含有连续腺嘌呤的寡核苷酸P3序列㊁修饰生物素P1序列㊁修饰FAM抗体的P2
序列；第二套是：修饰生物素的A1序列和修饰FAM 且含有连续腺嘌呤的A2序列；第三套是：同时修饰生物素和FAM且含有连续腺嘌呤的H1序列，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验和SYBR Green1荧光实验对上述DNA序列进行筛选㊂
1.3 试纸条检测蓖麻毒素实验原理 蓖麻毒素侧流层析试纸的检测原理如图1所示㊂它包括两个步骤:(1)H1-AuNPs-FAM抗体与蓖麻毒素孵育;(2)用侧向层析(Lateral-flow assay,LFA)试纸检测，进行结果判读㊂本研究以蓖麻毒素为目标物，根据活性蓖麻毒蛋白A链可以纯化腺嘌呤㊁使得含有腺嘌呤的寡核苷酸序列断裂的原理，设计含有连续腺嘌呤的寡核苷酸序列P3㊁A2㊁H1，以H1为例，如图1a 所示，当目标物蓖麻毒素存在时，会切割H1序列上的连续多个腺嘌呤，导致H1序列断裂㊂对于LFA 试纸条，如图1b所示，它包括四个部分：样品垫㊁吸收垫和带塑料背卡NC膜㊂链霉亲和素和抗FAM 抗体的二抗分别固定在NC膜的检测线和控制线上〔18-19〕㊂AuNPs表面修饰有FAM抗体，当不存在目标物时,H1序列和AuNPs-FAM抗体的混合液滴加到样品垫上后，混合液在毛细管力的作用下向吸收垫迁移，标记了生物素和FAM的H1将与修饰FAM抗体的金纳米颗粒特异性结合，形成复合物㊂当这些复合物通过检测线时，会被固定在检测线上的链霉亲和素捕获，在检测线上产生明显可见信号㊂过量的金
纳米颗粒继续在NC膜上迁移，并被固定在控制线上的抗FAM抗体的二抗捕获，从而显㊂如果样品中存在蓖麻毒素，进行混合孵育后,H1序列会出现断裂和溶解，则检测线上的复合物减少或消失，检测线颜变浅或消失㊂简而言之，在目标物蓖麻毒素不存在的情况下，观察到两条红线( on”)为阴性结果㊂随着目标物浓度的增加，检测线颜逐渐变浅，当浓度达到一定程度时，仅在控制线上观察到一条红线( 关闭”)，作为阳性结果㊂控制线上的红用于证明LFA试纸正常工作㊂
1.4 实验条件优化
1.4.1 序列的筛选 表1中列出了设计的含有连续A的寡核苷酸序列，其中,P1㊁P2序列分别与P3序列的两端互补配对，由此形成P1-P3-P2复合物, P1磷酸端修饰有生物素,P2羧基端修饰有FAM，因此该复合物可被检测线上的链霉亲和素捕获而显㊂A1序列可与A2序列互补配对,A1羧基端修饰有生物素,A2羧基端修饰有FAM，它们也可以被检测线上的链霉亲和素捕获而显㊂根据上述设计的序列，在相同体积和浓度下，分别向不同寡核苷酸序列中加入相同浓度的蓖麻毒素，用聚丙烯酰胺凝胶电泳表征毒素对寡核苷酸序列切割溶解能力㊂利用SYBR Green1只染双链DNA的原理，考察序列互补配对情况，最终筛选出合适的寡核苷酸序列㊂
图1 胶体金侧流试纸条定性检测蓖麻毒素的流程和原理示意图
1.4.2 H1序列孵育浓度的优化 将5μL50nM㊁25nM㊁10nM和1nM的寡核苷酸序列H1置于金属浴中
孵育1h(设置4段程:95℃5min 80℃10min 50℃10min 37℃10min)，向反应管中加入10μL50ng/mL FAM-AuNPs和85μL Tris-HCl 缓冲液，配置成100μL的反应体系，取50μL反应液滴加在试纸条样品区，静止10min观察实验结果㊂1.4.3 与目标物孵育时间的优化 向含有5μL H1-AuNPs-FAM抗体的反应管中分别加入不同浓度的蓖麻毒素标准品，置于微孔恒温振荡器中，在37℃700rpm分别孵育30min㊁60min㊁90min和120min，待反应结束后，取50μL反应液滴加在试纸条样品区，静止10min观察实验结果㊂
1.5 检测范围的确定 将蓖麻毒素用Tris-HCl缓冲液配制成系列浓度:1μg/mL㊁100ng/mL㊁80ng/mL㊁10ng/mL㊁1ng/mL，每个浓度检测3次㊂用Tris-HCl缓冲液作为阴性对照㊂取95μL不同浓度的蓖麻毒素加入5μLH1-AuNPs-FAM抗体复合物进行混合孵育120min，待反应结束后，取50μL 反应液滴加在试纸条样品区，静止10min观察实验结果，用image J软件进行结果分析㊂
1.6 特异性检测 用制备好的胶体金侧流层析试纸条在相同实验条件下，检测相思子毒素㊁胎牛血清白蛋白(BSA)㊁卵清蛋白(OVA)㊁金黄葡萄球菌肠毒素B㊁伏马毒素㊂重复3次，考察试纸条的特异性㊂1.7 重复性检测 在线性检测范围内，检测高㊁中㊁低3个浓度(100ng/mL㊁60ng/mL㊁20ng/mL)，每个浓度重复测6次，以拟合曲线计算浓度，以方差(STDEVA)与平均值(AVERAGE)的比值计算重复率(CV)㊂
2 结果与讨论
2.1 寡核苷酸序列的筛选 用聚丙烯酰胺凝胶电泳考察验证目标物对寡核苷酸序列切割溶解能力㊂如图2a所示，在相同体积和浓度下，分别向不同寡核苷酸序列中加入相同浓度的目标物，加入目标物后出现弥散条带，且亮度明显降低㊂说明目标物可以切割溶解含有连续腺嘌呤的寡核苷酸序列㊂使用P1-P3-P2体系作为识别元件检测蓖麻毒素时，最低检测限高达到50μg/mL，无法满足实际需求㊂推测可能是P1-P3-P2结合率较低，导致大量P3链剩余，从而影响毒素对检测线上P1-P3-P2体系的切割㊂此外，利用SYBR Green1只染双链DNA的原理，将A1㊁A2序列分别孵育㊁混合孵育后用SYBR Green1染，荧光结果(图2b)显示,A1和A2序列混合孵育后会产生A1-A2结合双链，而A1㊁A2自身也会折叠形成双链㊂因此,A1㊁A2序列无法完全互补结合而剩余部分A1链或A2链，剩余的A2链也影响毒素对检测线上A1-A2体系的切割，干扰检测线颜变化㊂因此最终选择H1序列为识别元件
㊂
图2 a聚丙烯酰胺凝胶电泳图b寡核苷酸序列荧光光谱图
(a图:Lane1:P1;Lane2:P2;Lane3:P3;Lane4:P3+RT;Lane5:A2;Lane6:A2+RT;Lane7H1;Lane8:H1+RT;b图:100nM A1;100n M A2;100nM A1-A2)
2.2 H 1序列孵育浓度优化 同时修饰FAM 和生物素抗体的H1序列是侧流条带中的识别元件，在侧流层析过程中,H1序列与预先固定在试纸条检测线上的链霉亲和素特异性结合，在检测线上形成的三明治结构会产生明显的可见信号㊂因此,H1序列的加入浓度对检测线颜影响较大，而且其用量对检测范围和检测限有决定性影响㊂于是，先优化了H1序列的用量㊂观察加入不同浓度的H1序列(100nM㊁
50nM㊁25nM㊁10nM 和1nM)时检测线和控制线颜变化(图3)，由图可知，随着加入H1序列浓度的降低，检测线逐渐变浅，控制线无明显变化，说明检测线上与链霉亲和素结合的H1序列随加入浓度的降低逐渐变少㊂为了获得明显的检测信号，同时为保证有良好的检测灵敏度，选择H1的加入浓度为10nM㊂2.3 加入目标物孵育时间优化 当存在目标物蓖麻毒素时，切割溶解含有腺嘌呤的H1序列，导致H1序列断裂，检测线颜变浅或消失㊂因此，目标物与H1序列孵育时间对检测效果影响较大㊂
在本研究中，相同浓度H1序列和目标物在不同孵育时间(30min㊁60min㊁90min 和120min)的条件下，观察检测线和控制线颜变化(图4)，从图中可以看出，随着孵育时间的增加，检测线颜逐渐变浅，表明越来越多的H1序列被切断㊂为获得明显的检测信号，选择目标物与H1序列混合孵育的时间为120min㊂
江杨清2.4 定性检测的灵敏度 蓖麻毒素用Tris-HCl 缓冲
液稀释至100ng /mL㊁80ng /mL㊁40ng /mL㊁10ng /mL 和1ng /mL，用胶体金侧流层析试纸条进行检测，结果如图5所示㊂与空白对照相比(图5中的6),10ng /mL 毒素的检测线颜变浅(图5中的4)㊂(图5)㊂而成人吸入及肌注蓖麻毒素的LD 50约为22μg /kg，口服的LD 50约为1mg /kg 〔13〕，该试纸条能够满足蓖麻毒素的实际检测需求
㊂
图3 H1序列浓度优化1~5依次为H1100nM ㊁
50nM ㊁25nM ㊁10nM 和1nM
2.5 标准曲线拟合
以蓖麻毒素浓度的对数
(100ng /mL㊁80ng /mL㊁40ng /mL㊁10ng /mL㊁1ng /mL)
为横坐标，以各浓度的相对强度为纵坐标，相对强度(T/C)表示检测线和控制线的集成密度比，误差棒表示三次测量的标准差㊂线性方程为y =-0.1605x+0.9518;
R 2=0.9916㊂在1~100ng/mL 范围内线性关系良好㊂图4 蓖麻毒素与H1-AuNPs-FAM 抗体混合孵育时间优化,1~4依次为加入1μg /mL 蓖麻毒素孵育
30min ㊁60min ㊁90min 和120min
图5 蓖麻毒素胶体金侧流层析试纸条的目测灵敏度,1~5依次为蓖麻毒素100ng /mL ㊁80ng /mL ㊁40
ng /mL ㊁10ng /mL 和1ng /mL ;6：空白对照
图6 相对强度与蓖麻毒素对数浓度
之间的线性关系
2.6 特异性
用Tris -HCl 缓冲液将卵清蛋白
(OVA)㊁胎牛血清白蛋白(BSA)㊁相思子毒素㊁金黄葡萄球菌肠毒素B(SEB)㊁伏马毒素(FB1)稀释至100ng /mL，用胶体金侧流层析试纸条检测，结果如图7所示㊂只有蓖麻毒素的检测线条带颜相对变浅，而其他蛋白及毒素的检测线与对照组相比无明显差异，说明该试纸条具有良好的特异性㊂特异性源自于：蓖麻毒素是由两条肽链RTA 和RTB 构成,RTA 是蓖麻毒素的效应链，具有催化H1序列脱去腺嘌呤A 的特性㊂而上述其他蛋白及毒素不具备这项催化能力，因此无法切割H1序列，因此检测线颜与空白对照无明显差异㊂
2.7 重复性检测 在线性检测范围内，检测高㊁
中㊁低3个浓度(100ng /mL㊁60ng /mL㊁20ng /mL)，每个浓度测6次，分别计算CV 值，结果如表2所示,CV 均≤20%，表明胶体金侧流层析试纸条具有良好的稳定性，后续可以进行实样检测
㊂
图7 蓖麻毒素胶体金侧流层析试纸条特异性检测
玺印
1：蓖麻毒素;2：相思子毒素;3:SEB ;4:BSA ;5:OVA ;
6:FB1;7：空白对照
表2 蓖麻毒素胶体金侧流层析试纸条的重复性检测
实际浓度(ng/mL)AVERAGE(ng/mL)STDEVA CV(%)100103.160917.5216.986065.3917.18510.9920
乙酸乙酯
22.446
车流波动理论
2.73
12.17
3 结论
蓖麻毒素毒性强㊁易获得，是潜在的生物恐怖战剂，因此，亟待建立快速检测蓖麻毒素的方法，以保障国家公共安全㊂本研究建立了一种快速半定量检测蓖麻毒素的方法，利用活性蓖麻毒蛋白A 链可以纯化出特定的腺嘌呤，切割溶解含腺嘌呤的H1序列，导致H1序列断裂的特性〔17〕，开发了以修饰FAM 和生物素的H1序列为识别元件的胶体金侧流层析试纸条，实现了蓖麻毒素的裸眼半定量检测，并考察了检测方法的灵
敏度和特异性㊂研制的蓖麻毒素胶体金侧流层析试纸条最低检测值低于10ng /mL，可以满足检测需要㊂参考文献:
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