DNA固相合成

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应用固相合成法合成下列碱基顺序的DNA:5'-GCCTAACGTAAC-3'。
郭金服DNA化学合成时由3'端向5'进行。
合成原理步骤如下:
一、脱保护基用三脱去预先连接在CPG上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基),获得游离的5'-羟基端,以供下一步合成反应。
二、活化将质子化的核苷3'-亚磷酰胺单体与四氮唑活化剂混合进入合成柱,形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体(其5'端仍受DMT保护,3'端被活化)。
三、连接二步中活化得到的中间体遇到一步中脱保护基的核苷酸,与核苷酸的5'-羟基发生亲核反应,缩合并且脱去四唑,此时合成的寡糖核苷酸链向前延长一个碱基。
四、氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酸酯键与连接在CPG上的寡糖核苷连接,而亚磷酸酯键不稳定、易被酸、碱水解,此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酸酰胺转化为磷酸三脂,得到稳定的寡糖核苷酸。
经过上述几个步骤后,一个脱氧核苷酸就被连接到CPG的核苷酸上,再采取上述同样的步骤,即可得到
一DNA片段样品。最后对其进行切割和脱保护基(一般对A、C碱基使用苯甲酰基保护;G碱基采用异丁酰基保护;T碱基则不必保护;亚磷酸用腈乙基保护)。具体则是用苯硫酚除去5'-OH上的保护剂DMT,用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断开,使DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除去,最后除去氢氧化铵,在真空中抽干。
DNA纯化分离
利用HPLC或者PAGE对得到的粗品进行纯化分离,得到所需的DNA分子。
DNA序列鉴定
检定D N A 片段的顺序的方法主要有两种: (1)wandering SPot方法,主要适用于适用于寡核苷长度在20个碱基以下的片段;(2)化学裂解法,该法核苷酸碱基顺序从凝胶的放射自显影图谱上直接读出,但对于合成产物中少量的不纯物是检测不出来的;
具体步骤:
各种基团的保护方分别如下图所示:
(1)戊糖的保护
(2)碱基的保护
梅机关
在本题中保护后的碱基A、C、G分别简记为Ba、Bc、Bg、Bt。因为T无需保护,为书写方便简记为Bt。
(3)磷酸酯基的保护:
具体合成步骤如下:
如此不断重复,最后得到一条DNA分子的长链,其结构如下:
得到粗产物后再利用电泳或者HPCL技术加以分离,回收片段最长的。
DNA的鉴定
经分离纯化后的DNA寡核苷酸片段,应对其质量(包括长度和核苷酸顺序)进行检定。检定DNA片段的顺序的方法:采用wandering SPot方法,适用于寡核苷酸长度在20个碱基以下的片段。寡核苷酸片段5'一端经[γ一32P]-ATP用T4多核苷酸激酶标记后,经蛇毒磷酸二醋酶进行部分水解,标记混合物于pH=3.5的条件下在醋酸纤维纸上进行电泳,然后在DEAE一纤维素板上进行同系层析,寡核苷酸的顺序通过这一标记消化产物的特定迁移率来测定。此方法的好处在于不仅可测出寡核苷酸的顺序,也可以检出不纯物的污染。
参考文献:
1.生物化学教材,古练权,高等教育出版社
圣格2.DNA的化学合成及其应用,静国忠,生物化学与生物物理进展,1986.4知网
八旗满洲氏族通谱3.DNA的化学合成,戚志红、陈常庆,(中国科学院上海生物化学研究所),专论与综述
>中国慈善总会

本文发布于:2023-08-15 08:37:09,感谢您对本站的认可!

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