PCR基本原理
1、PCR引物；2、测序引物；3、杂交探针；4、简并引物；5、其他引物
引物的作用（基因获得、测序、检测等）
引物设计软件（ Primer 、Oligo 、codehop、FastPCR、Generunner 、Vector NTISuit、Dnasis、Omiga、Dnastar等）
引物分析软件（ Oligo 、Primer、Blast等）
引物设计需考虑的问题：
1、引物长度（primer length）
2、产物长度（product length）
3、序列Tm值爱宝贝亲子论坛(melting temperature)
4、ΔG值(internal stability)
5、引物本身和引物之间二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 6、错误引发位点（false priming site） 7、引物及产物GC含量（composition）
PCR引物设计原则：
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A商场现代化、T之间，所以3′端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是llr3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过
高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
9. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）
小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11. 引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表
来源： 高慧的日志
PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表1 酶 | 寡核苷酸序列 | 切割率% | 令牌网2 hr | 20 hr | Acc I | GGTCGACC
CGGTCGACCG
CCGGTCGACCGG | 0
0
0 | 0
0
0 | Afl III | CACATGTG
CCACATGTGG
CCCACATGTGGG | 0
>90
苏金生>90 | 0
>90
>90 | Asc I | GGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA | >90
>90
>90 | >90
>90
>90 | Ava I | CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA | 50
>90
>90 | >90
>90
>90 | | | | |
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PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表2
BamH I | CGGATCCG
CGGGATCCCG
CGCGGATCCGCG | 10
>90
>90 | 25
>90
>90 |
Bgl II | CAGATCTG
GAAGATCTTC
GGAAGATCTTCC | 0
75
25 | 0
>90
>90 |
BssH II | GGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA | 0
0
50 | 0
0
>90 |
BstE II | GGGT(A/T)ACCC | 0 | 10 |
BstX I | AACTGCAGAACCAATGCATTGG
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT | 0
25
25 | 0
50
>90 |
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