DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.05.007 ·
邢玉华，谭俊杰，李玉霞，凌焱，刘刚，陈惠鹏
关元
20 世纪的生物学研究一直着眼于对生物系统的不断分解，解剖至细胞中单个蛋白或基因，研究其结构和功能来解释生命现象。但随着当代分子生物学技术的迅猛发展，以系统化设计和工程化构建为理念的合成生物学成为新一代生物学的发展方向。合成生物学旨在对多种天然的或人工设计的生物学元件进行合理而系统的组合以获得重构的或非天然的“生物系统”，其涵盖的研究内容可以大体分为 3 个层次：一是利用已知功能的天然生物模体（motif）或模块（module）构建成新型调控网络并表现出新功能；二是采用从头合成（de novo synthesis）的方法，人工合成基因组 DNA 并重构生命体；第三个层次则是在前两个研究领域得到充分发展之后，创建完整的全新生物系统乃至人工生命体（artificial life）。合成生物学强调利用工程化的设计理念，实现从元件到模块再到系统的“自下而上”设计。利用生物系统最底层的 DNA、RNA、蛋白质等作为设计的元件，利用转录调控、代谢调控等生物功能将这些底层元件关联起来形成生物模块，再将这些模块连接成系统，实现所需的功能。这是一门涉及微生物学、分子生物学、系统生物学、遗传工程、材料科学以及计算科学等多个领域的综合性交叉学科。它有别于传统的基因工程，其目的在于组装各种生命元件来建立人工生物体系，让它们能像电路一样在生物体内运行，使生物体能按预想的方式完成各种生物学功能。合成生物学的最高境界是灵活设计和改造生命，重塑生命体。 本文就目前合成生物学采用的关键技术和研究应用进展两方面进行综述。
1 基因组的人工合成技术
2010 年 5 月 20 日，Science报道了 Venter 研究组采用化学方法合成了一个 1.08 Mb 的蕈状支原体基因组，并将其移植入一个山羊支原体受体细胞，从而创造了一个仅由合成基因组控制的新的蕈状支原体细胞[1]。这项成果在合成生物学的发展史中具有里程碑的意义。在此之前，也有许多基因组合成的成功报道。2002 年，纽约州立大学 Wimmer 实验室合成了脊髓灰质炎病毒，这是人类历史上第一个人工合成的病毒。多年来，Venter 等一直致力于合成基因组的研究。2003 年，合成了长达 5386 bp 的ΦX174 噬菌体基因组，实现了用寡核苷酸合成的方法精确合成了 5 ~ 6 kb 的 DNA 序列；2008 年，Venter 实验室又合成了生殖支原体基因组，该基因组全长 582970 bp，是已知的生物体中独立生存的最小基因组[2]；2010 年 10 月他们又发明了迄今最简单有效的基因合成技术，并以此合成了实验小鼠的线粒体基因组[3]。Dymond 等[4]的研究更进了一步，他们于 2011 年报道成功设计合成了酿酒酵母的部分染体，这是酿酒酵母基因组人工合成计划（SC2.0 Project）取得的第一个成果，该项目的最终目标是人工合成构建酿酒酵母基因组。酵母基因组人工合成将是合成生物学发展史上又一重要的里程碑。
DNA 合成是支撑合成生物学发展的核心技术，它不依赖于 DNA 模板，可根据已知的 DNA 序列直接
合成，在基因及生物元件的合成、基因回路和生物合成途径的重新设计组装，以及全基因组的人工合成中发挥重大作用。由于化学合成的 DNA 片段长度有限，要合成长的 DNA 片段需要先合成短的寡核苷酸，然后再将寡核苷酸进行拼接。因此，基因组合成的基本思路为：①按照原始基因组序列设计合成寡核苷酸；②利用各种方法将寡核苷酸拼接成较长的 DNA 序列；③以较长的序列为基础，进一步拼接得到更长的DNA 序列，拼接成完整的基因组；④将合成的基因组移植到细胞中，并验证其功能。
1.1 寡核苷酸的合成
目前寡核苷酸一般采用固相亚磷酰胺三酯法合成。寡核苷酸的长度是一个重要的参数，随着长度的延长，产率下降，纯度也降低，积累的合成错误大大增加。较短的寡核苷酸会有较少的错误，但是需要增加组装所需的重叠序列，使合成成本增加。使用 60-mer 的寡核苷酸，可以最大程度地降低错配率和生产成本[5]。
1.2 由寡核苷酸拼接成较长的 DNA 片段
寡核苷酸可以通过各种方法拼接成几百 bp 到几千 bp 的 DNA 片段。常用的体外拼接方法有以下两种：连接酶链式反应（ligase chain reaction，LCR）和快速聚合酶链式组装法（polymerase chain assembly，PCA）。
mhlsLCR 法利用 Taq 连接酶将首尾相连、重叠杂交的寡核苷酸片段连接起来，连接反应在较高温度下进行，因而可以排除 DNA 二级结构的干扰；但是基因合成的成本大大增加。
PCA 法是两条具有部分重叠的寡核苷酸互为引物互为模板进行聚合酶的延伸，延伸得到的序列再通过与其他寡核苷酸退火、延伸，进行多次循环后，最终合成目的序列。PCA 法合成成本较连接酶法大大降低。这种方法逐渐得到广泛使
基金项目：国家高技术研究发展计划（863 计划）子课题（2012AA 022001-03D）
作者单位：100071 北京，军事医学科学院生物工程研究所（邢玉华、谭俊杰、李玉霞、凌焱、刘刚、陈惠鹏）；130012 长春，吉林大学生命科学学院（邢玉华）
通讯作者：刘刚，Email：jueliu@sohu
收稿日期：2012-07-16
用，并且衍生出一系列的 DNA拼接方法，包括 TBIO 法（thermodynamically balanced inside-out）、双重不对称 PCR （dual asymmetric PCR）、重叠延伸 PCR（overlap extension PCR，OE-PCR）[6]和连续 PCR 等。
此外，Venter 小组报道将两端带有重叠序列的寡核苷酸片段和载体转入酵母细胞中，利用酵母体内的同源重组可以拼接起来并克隆到载体上，可以实现 38 个寡核苷酸片段同时拼接[7]。
1.3 DNA 大片段和基因组的组装
利用 LCR 和 PCA 法一般可将寡核苷酸拼接成几千bp 以下的基因序列。更长的大片段和基因组 DNA 则需要进一步拼接。常用的拼接方法有以下几种：
1.3.1利用限制性内切酶和连接酶的连接这是最简单的方法，通过连接将片段连成全长。但是当进行多个 DNA 片段连接时，往往很难到合适的酶切位点，而且连接片段会有几个碱基的残留，因此该方法在多个 DNA 片段连接时有很大的局限性。合成生物学中的 Biobrick 连接法巧妙地设计了 4 个限制性内切酶，通过酶切连接可以将 DNA 片段拼接起来[8]。还有一种筛选连接法（ligation by selection，LBS），使用 IIs 型限制性内切酶Bsa I 和Bbs I，并通过抗性筛选实现无痕拼接。Kodumal 等[9]利用这种方法最终组装成了 32 kb 长的聚酮合酶基因簇。
1.3.2 基于重叠序列和聚合酶延伸的方法包括重叠延伸PCR（OE-PCR）法和环形聚合酶延伸法（circular polymerase extension cloning，CPEC）。
OE-PCR 法是相邻的具有重叠序列的 DNA 片段变性退火后形成互补双链，通过 DNA聚合酶进行延伸，
再利用末端引物将其扩增出来。该方法方便有效，但依赖于聚合酶的高保真度，合成的大片段长度有限，约在 20 kb 以下。CPEC 法原理与 OE-PCR 类似，但是不需要扩增引物，可将多个相互重叠的 DNA 片段与载体一步连接成完整的环状质粒，然后直接转化细胞，在体内进行扩增。
1.3.3 不依赖于基因序列和连接反应的克隆方法[10] 利用T4 DNA 聚合酶在无 dNTPs 的情况下发挥的 3' ~ 5' 外切酶活性，能将 DNA 片段消化产生含有同源序列的5'-ssDNA 突出端（15 ~ 30 个碱基），DNA 片段之间及DNA 与载体依靠同源序列退火，形成环状中间体，直接转化细胞，利用大肠杆菌本身的修复系统修复成完整的环状质粒。这种克隆方法不需要连接酶，也不需要考虑插入片段的序列，可实现多个 DNA 片段的一次性连接重组，用途非常广泛。国外公司已经开始将其用于商业，比如 Novagen 公司的 Radiance TM系统及 Invitrogen 公司 Gateway TM 系统都是基于此技术的原理开发的。Schmid-Burgk 等[11]对不依赖于基因序列和连接反应的克隆方法（sequence and ligation- independent cloning， SLIC）进行了改进，设计一段特殊序列，但是这种方法会在连接序列中引入多余的碱基，适用于基因之间的拼接，可用于合成生物学中基因回路的构建及生物途径的组装。1.3.4 Gibson 等温一步拼接法该法是 SLIC 法的延伸。选用核酸外切酶、DNA 聚合酶和 DNA 连接酶 3 种酶进行拼接。相邻的具有重叠序列的片段，加入上述 3 种酶和dNTPs 共同孵育。核酸外切酶能从5′降解核苷酸，且不与DNA 聚合酶竞争。双链 DNA 被消化产生突出的单链DNA，重叠序列特异性退火，此时，外切酶逐渐热失活。DNA 聚合酶和 DNA 连接酶修复连接成完整的双链 DNA 分子，从而实现无
痕拼接。Gibson 等[12]利用此方法成功地将 4 个大于 100 kb 的片段在体外组装成完整的 583 kb 的生殖支原体基因组。此外，他们还尝试将 600 个长60-mers 的寡核苷酸（寡核苷酸之间带有 20 个重叠序列）成功地合成了小鼠的线粒体基因组（16.3 kb）。这种方法方便、快速、高效，能组装长达 900 kb 的 DNA 大片段，而且出错率会大大降低。体外重组拼接一般选用细菌人工染体（BAC）为载体，但是当 DNA 片段达到一定长度时（约300 kb），BAC 在大肠杆菌中不稳定，达到转化的极限，更大的片段需要在微生物体内进行重组。
1.3.5 酵母体内同源重组拼接法利用酵母细胞内高效的同源重组系统来实现多个相互存在同源序列的 DNA 片段的组装。V enter 研究组在 2008 年的Mycoplasma genitalium JCVI-1.0（582970 bp）基因组合成中最后一步拼接就是在酿酒酵母中完成的[2]。虽然利用体外重组系统可以组装成完整的基因组，但是 BAC 载体在大肠杆菌内不稳定，为此他们建立了转化介导的重组克隆方法（transformation-associated recombination，TAR），利用酵母人工染体（YAC）能大大提高稳定性及 TAR 克隆效率。TAR 载体与 1/4 基因组片段同时转化到酵母中，这些片段之间的重叠序列使它们发生同源重组。由于 YAC 带有着丝粒、自主复制序列及筛选标记，因此不需整合到酵母染体中进行重组，通过设计同源臂可以得到环状的完整的基因组，便于与酵母染体分离。同样地，Venter 研究组利用酵母同源重组完成 1078 条平均 1080 bp 的 DNA 片段的组装，最终合成了 1.08 Mb 的M. mycoides JCVI-syn1.0 基因组。选用 Ycp 型的酵母-大肠杆菌穿梭载体，在酵母体内拼接，然后提取质粒转化到大肠
杆菌中进行扩增。酵母同源重组拼接法是目前报道的最高效的组装 DNA 大片段的方法，在合成更长的 DNA 如细菌基因组时有很大的优势。但随着要组装的片段不断延长，要合成比酵母还大的基因组时，这种方法是否可行还不清楚。综上，几种常用的大片段和基因组 DNA 组装方法如图 1 所示。
张思来
1.4 基因组的移植
基因组合成以后，需要人工转移到新的细胞中进行异源表达，实现其功能，这是一项非常有挑战的工作。体外有一些方法可以用来将基因组导入细胞，包括电穿孔、脂质转染法、使用基因等。Venter 研究组在完成基因组的人工合成之前进行了大量的探索，首先获得了不含蛋白的完整M. mycoides 基因组，并采用 PEG 介导的遗传转化系统将其移植到M. capricolum 中，通过四环素抗性筛选转化成功的
A
C
E
B
D
A：Biobrick 连接法；B：不依赖于连接酶的克隆反应 LIC；C：环形聚合酶延伸法 CPEC；D：Gibson 等温一步拼接法；E：酵母体内同源重组拼接法
图 1常用大片段和基因组 DNA 组装方法
细胞，最终得到了与供体菌表型相同的细胞[13]。但是当组装完M. mycoides 基因组后，从酵母中分离出完整基因组后转化到M. capricolum 中，开始并没有得到任何移植成功的细胞，经过分析可能是由于M. mycoides 和M. capricolum 共用同一套限制酶系统，其基因组是经甲基化修饰的。而在酵母体内拼接后的基因组是没有甲基化的，需在体外用甲基化酶进行修饰，或者破坏M. capricolum 的限制性内切酶基因，从而避免受体细胞限制酶系统的阻碍。最终将合成基因组移植入M. capricolum 体内，得到由合成 DNA 控制的人工细胞。
1.5 基因组合成中的错误纠正
在基因组合成过程中，由于合成方法本身的限制，不可避免地会引入错误碱基，而且在 DNA 组装过程中用到的PCR 等方法也会引入突变。
为了得到高保真的合成 DNA，必须对错误和突变进行纠正，这是个耗时耗力的过程。可以使用的纠错方法有：①修饰、标记和分离错配的核苷酸从而可以防止扩增错误的DNA；②使用核酸酶来识别和剪切 DNA 中的错配，再将余下正确的片段通过重叠延伸 PCR 重新组装；③定点诱变的方法，对于合成的长链 DNA，测序后选择突变少的长链DNA 进行定点突变，这是最常使用的方法；④应用错配识别蛋白 MutS 结合错配的 DNA，通过电泳可以将错配的DNA 从无错的 DNA 中分离出来。这种方法可以
处理多个大量的 DNA 片段，不会干扰进一步拼装的 DNA 小片段，可降低错误率 3.5 ~ 15 倍；⑤利用微流体芯片进行寡核苷酸的装配，极大地缩短了合成时间，减少突变率。此外先合成短的寡核苷酸（60 mer）及提高寡核苷酸的纯度也可以大大降低 DNA 合成的错误。
2 合成生物学的研究应用
2.1 合成生物学在医药领域的应用
2.1.1 萜类药物的生物合成萜类（terpenoid）是一类在
天然宿主中表达量低、结构复杂并具有多个手性中心的小分子物质。许多萜类化合物具有很高的医学应用价值与保健前景。常见的萜类化合物有青蒿素、紫杉醇等。通过科学手段提高该类化合物的产量具有极高的商业价值和社会意义。目前已利用合成生物学手段实现了该类化合物产量的提高。
青蒿素在自然界中是青蒿产生的倍半萜烯酯的内过氧化物，是疟疾的特效药，在自然界中产量很低。化学方法合成青蒿素十分困难，且成本高昂，使得青蒿素的供应短缺，许多患者无法得到及时。加州大学伯克利分校化学工程系、劳伦斯国家实验室 Keasling 教授将药物的设计、加工、控制、生产体系集成于微生物细胞，实现了青蒿素的微生物合成[14]。2003 年，Keasling 教授在Nature 发表文章，其根据大肠杆菌的密码子偏好性，合成青蒿酸合成酶（amorphadiene synthase，ADS）的
重庆智障学校
编码基因、共表达 SOE4 操纵子（编码 DXS、IPPHp、IspA），并绕过大肠杆菌的一般代谢途径，引入异源的酵母菌甲羟戊酸等途径，使得青蒿酸的产量提高了 10 ~ 300 倍。2006 年该课题组又在Nature 上公布了新的研究成果[15]：其将 ADS 基因插入由GAL1 启动子控制转录的 pRS435 质粒中，克隆青蒿类植物转化为青蒿酸的细胞素 P450 氧化还原酶等，并在酵母中对 FPP 合成途径进行了 5 次改造，改造后酵母青蒿酸的合成能力大大提高，合成量达到了惊人的 153 mg/L，是之前报道的最大合成水平的 500 倍。通过对代谢途径不断改造和优化，目前青蒿素的产量已经得到了若干数量级的提高，最终将青蒿素的合成成本降为原来的十分之一。此研究成果有望实现抗疟疾药物的低成本生产，对全世界疟疾的发展起到了巨大的促进作用。为此，Keasling 教授被美国《发现》杂志评为 2006 年最有影响的科学家，并获得高达4 000 万美元的Bill and Melinda Gates 基金资助，用于研究青蒿素的产业化生产。
紫杉醇（paclitaxel）是紫杉次级代谢产生的双萜类物质，具有显著的抗癌效果，已成为临床上肿瘤的重要药物。但是紫杉醇与青蒿素一样，在自然界中产量不高，且化学合成困难，随着合成生物学技术的发展，紫杉醇的生物合成也成为了生物学家关注的热点。紫杉醇的自然合成是一个复杂的酶促反应，涉及近 20 种酶。大致途径为由萜类化合物生物合成的共同前体双（牻牛儿基）二磷酸盐（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）通过紫杉二烯合成酶的作用生成关键中间产物紫杉二烯，其经过酶促反应转为紫杉烷，紫杉烷经过一系列的还原、加羟、酰基转移等修饰反应，形成紫杉醇的最
中药制药终前体巴卡亭 III。Engels 等[16]将紫杉二烯的合成途径转入啤酒酵母中，通过表达紫杉二烯合成酶等关键酶，引入不受反馈调节的 GGPP 合成酶的一种同工酶（HMG-COA 还原酶）以提高酵母中紫杉二烯前体 GGPP 的合成量，同时抑制宿主酵母中的类固醇竞争途径，实现了酵母中紫杉二烯的积累，使得紫杉二烯的产量提高了40 倍。目前虽尚无关于紫杉醇的完全异源表达的报道，但已经实现的关键中间体紫杉二烯的高效表达定将对其的实现产生重要影响。
2.1.2 合成生物学在疾病上的应用人们饱受各种健康问题的困扰，解决人们的健康问题始终是医学及生物学研究的核心热点。目前合成生物学在疾病的上也发挥着重要的作用，除了上述的一些关于药物研发上的贡献，在疾病的疗法上，合成生物学通过构建模块化的生物元件、疾病通路等，创造了许多新的疾病方法。
利用合成生物学构建基因功能模块在肿瘤细胞中将药物前体转变为杀死肿瘤细胞的药物是一种很有前途的肿瘤化疗方法。这些合成的生物药物可能更容易接近肿瘤组织，有选择性地杀死癌细胞。美国加州大学的 V oigt 课题组设计了一种细菌，可以侵入肿瘤细胞并将其杀死[17]。他们向细菌中引入了多个模块，将细菌对癌细胞的入侵与特定环境信号连接起来。利用数字电路门控思想，使细菌实现了对外界环境的探测。当细菌处于低氧环境并且细菌密度超过一定阈值时，细菌将表达来自假结核耶尔森菌的透明质酸酶（invasin），从而杀死癌细胞。我们还可以根据肿瘤特异性的需要，将其中的特异性模块进行更换，可以实现其对不同种类肿瘤细胞的作用，很好地体现了合成生物学技术在应
用上的灵活性。
乙硫异烟胺是一种的药物，主要是通过结合分枝杆菌酶 EthA 激活药效。但由于体内的 EthR 抑制EthA 基因转录，因此在上乙硫异烟胺总是无法达到预期的效果。Weber 等[18]利用合成生物学技术设计了一个哺乳动物的基因线路，构建了一个连有 EthR 反式作用因子的报告基因来筛选鉴定 EthR 抑制子，进而消除对乙硫异烟胺的拮抗作用，极大地提高了乙硫异烟胺在体内的抗结核疗效。
Kemmer 等[19]利用构建的基因回路，将其植入细胞，实现了对体内的尿酸浓度的检测与控制。该回路中，当尿酸浓度低于阈值时，细菌转录抑制物 HucR 与特异结合的DNA 模体 HucO 抑制下游报告基因与重组黄曲霉菌尿酸酶的表达，当尿酸浓度高于阈值时，HucR 的转录抑制作用解除，通过激活报告基因与黄曲霉菌尿酸酶的表达，实现了对体内尿酸浓度的监测与稳控。
2.2 在生物能源领域的应用
能源问题已经延伸到了政治、经济、军事等各个方面，早在 20 世纪，能源问题就引起了各个国家的高度重视，如何开发清洁、廉价、可持续的能源，一直是各国科学家研究的热点。随着合成生物学技术的发展，通过生物手段来生产能源也成为一种必然的趋势。目前已有许多科学家利用合成生物学技术，在生物生产能源的领域取得了一定的进展。2.2.1合成生物学在氢气能源开发上的应用氢气燃料是
一种最清洁的能源，其“零排放”的特点也使其在汽车能源领域应用潜力巨大。美国弗吉尼亚理工大学的 Zhang 等[20]利用合成生物学技术，将 13 种已知的酶组成一个非天然的新的催化体系，从而实现了淀粉和水在温和条件下产生氢，实现了氢的生物制造。
2.2.2 合成生物学在有机燃料合成上的应用 Sonderegger 等[21]在啤酒酵母的木糖代谢过程中编码磷酸酮（醇）酶途径来增加 NAD+ 的有效利用，从而增加乙醇的产量。Trinh 等[22]通过定向敲除策略，去除大肠杆菌中与乙醇代谢无关的途径，优化从戊糖和己糖生产乙醇的途径，实现了代谢途径中乙醇的富集，进而提高乙醇的产量。
由于乙醇燃料的腐蚀性和吸水性，使其在作为燃料的大规模使用上具有一些潜在的隐患，目前科学家们更多地将目光集中在了一些高碳醇燃料上，如异丙醇、1-丁醇、异丁醇和脂肪醇等。
Hanai 等[23]通过将编码丙酮丁醇梭菌中的异丙醇代谢通路中的关键酶的基因整合入大肠杆菌，实现了异丙醇在大肠杆菌中的高效表达，产量达到了 4.9 g/L。
Atsumi 等[24]通过将编码丙酮丁醇梭菌的 1-丁醇代谢通路中的关键酶基因整合入大肠杆菌，同时中断大肠杆菌本身存在的与 1-丁醇生产竞争乙酰辅酶 A 和 NADH 的代谢通路，从而提高了 1-丁醇的产量。该课题组又通过整合枯草芽孢杆菌中的乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase）基因 alsS、大肠杆菌中的乙酰羟基酸还原异构酶（acetohydroxy acid isomeroreductase）和二羟基酸脱水酶（dihydr
oxy acid dehydratase）基因 ilvC 和 ilvD，来提高异丁醇合成的前导产物 2-酮异己酸（2-ketoisocaproate）的产量，同时通过酮异己酸脱羧酶（ketoisovalerate decarboxylase，kivd）和醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH2）的表达，实现了异丙醇在大肠杆菌中的高效生产。
Steen等[25]在现有单糖到脂肪酸的合成途径的基础上，在大肠杆菌中引入脂肪酸到脂肪醇的代谢相关酶，其中包括fadD（来自大肠杆菌的酰基辅酶 A 合成酶）、acrI（来自不动杆菌 ADPI 的 acyl-CoA 还原酶）等，实现了单糖到脂肪醇的整体代谢途径的构建。通过过表达 acrI 和 fadD，同时阻断了脂肪酸的其他代谢通路，实现了脂肪醇在大肠杆菌中的高效表达。同时，该研究小组还利用合成生物学方法对大肠杆菌和酿酒酵母进行改造，实现了一种没药烷型倍半萜烯的高效表达，这种没药烷型倍半萜烯加氢反应后可作为一种新型的绿燃料[26]。
2.3 合成生物学在化工产品上的应用
国贼查抄内幕利用合成生物学技术重组的细胞，不仅可以用来生产能源，在工业化工产品领域也发挥着巨大作用。目前，已有科学家实现利用合成生物学技术改造细胞来生产用于塑料和纺织品的化工前体。韩国的科研人员成功利用合成生物学技术对菌株进行改造，成功组装了非天然生产环保型可降解性塑料聚羟基脂肪酸（PHA）的生产和代谢模块，构建了能够用糖稳定生产 PHA 的工艺[27-28]。美国杜邦公司实现了利用大肠杆菌合成重要的工业原料 1, 3-丙二醇等[29]。佛得角共和国的一家公司利用合成生物学技术，通过对酵母的设计改造，实现了利用糖类、植物油来生产脂肪酸[30]。
2.4 合成生物学在工业污染物检测中的应用
通过合成生物学技术，可以利用电路设计思路同生物细胞相结合，设计改造基因线路，提高生物传感性，实现一些化学物质的生物检测。
西班牙的 Lorenzo 教授课题组一直致力于合成生物学框架内的甲苯及其衍生化合物的生物监测研究[31]。该课题组构建了 XylR-Pu-Lux 的甲苯类化合物的检测模块，将其整合到恶臭假单胞菌 KT2440 基因组，并通过二步转座策略，剔除抗性基因，实现了符合环境监测要求的甲苯检测工程菌株的构建。密歇根大学的 IGEM 团队更是在此基础上，在此模块中加入自杀机制，提高了工程菌株的应用价值，降低了其对环境的副作用。
该检测平台的建立，体现了合成生物学技术在化合物检测上的应用，该技术思想不仅可用于工业污染物的检测，还具有一定的军事意义，目前已有国家将其应用于地雷生物武器的检测。
2.5 大肠杆菌基因组减小研究进展
设计合成成功的基因组需要植入某个宿主细胞内，这个宿主被称为底盘（chassis）。然而大多数宿主细胞具有抑制外源基因表达从而减少遗传负担的能力。随着许多生物体全基因组测序的完成，开始兴起了最小基因组研究。基因组减小可以减少代谢调节网络中的冗余，提高其可预测性和可控性。构建
最小基因组一方面可以对现有的基因组大片段进行有目的的精简，尽可能地删除非必需的基因组片段，即自上而下（top-down）方法；另一方面可以对必需基因进行理性设计、从头合成与组装，即自下而上（bottom-up）策略。大片段 DNA 合成技术已经取得了突破性的进展，目前已经可以实现人工合成基因组规模的 DNA，但是复杂的微生物底盘细胞基因组的人工合成还需时日，因而目前较多的是采用自上而下的删减策略构建最小基因组。研究方法主要有利用转座子随机插入或缺失，利用λ噬菌体的线性 Red 同源重组系统，Cre/loxP 重组酶系统，Flp/FRT 敲除系统；以及转座子协同 Cre/loxP 敲除，Red 重组与 I-SceI 切割系统相结合，应用两步 Red 重组技术正负筛选实现无痕删除等[32]。目前已经展开了对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、链霉菌等模式微生物的最小基因组研究并已取得很大的进展，一些基因组发生较大缺失的工程菌表现出优良性状。Komatsu 等[33]利用 Cre/loxP 重组系统分步敲除了阿维链霉菌染体大于 1.4 Mb 的负责编码次级代谢产物的DNA 区段，获得了一系列基因组减小菌株，在突变株中表达链霉素、头霉素 C 和大环内酯类抗生素普拉地内酯（pladienolide）的生物合成基因簇，基因组减小菌株均可有效合成链霉素和头霉素C，产量均高于其天然出发菌株。导入调控基因 pldR 后，基因组减小菌株可以有效合成普拉地内酯，产量提高了 20 多倍。Kolisnychenko 等[34]将MG1655 基因组减小了 8.1%，得到 MDS12 菌株，没有改变生长特性。Pósfai 等[35]完全删除了 MG1655 中的可移动元件，得到了 MDS40、41、42 和 43。这些基因组减小的菌株的生长速率与 MG1655 类似，复制环长度的变化对此没有影响。MDS42 的电转效率比 MG1655 高两个数量级，
