乳糜血
反义核酸
过去⼏⼗年⾥⼩分⼦药物，蛋⽩类⼤分⼦药物等有了飞速的发展。但是⼈类⾯临的⼀些疾病，尤其先天遗传性疾病，⽆法开发⼩分⼦药物和蛋⽩类药物。寡核苷酸类药物，是⼀个选择。
由于蛋⽩质来源于特定的mRNAs，调节mRNA或前mRNA⽔平可⽤于拓宽靶点。传统的⼩分⼦或基于蛋⽩质的策略(适配器蛋⽩、转录因⼦等)难以靶向的蛋⽩质，可以通过调节mRNA⽔平来实现。此外，⾮编码RNA的⼏种独特的调节作⽤已经被发现，并且已经证明RNA可以直接促进病理学。
⽬前，许多不同的策略被⽤于调节细胞内的RNA功能。这包括靶向RNA的⼩分⼦、基因、基因组编辑、外源性表达的mRNAs的传递以及合成反义寡核苷酸(ASOS)。本⽂对反义寡核苷酸技术进⾏了综述。
反义核酸药物作⽤机制
反义寡核苷酸(ASOs)被定义为化学合成的寡核苷酸，通常长度为12-30个核苷酸，⽬的是通过Watson-crick碱基配对规则与RNA结合。
ASOs的长度部分地提⾼了它们的特异性，因为16到20个核苷酸长的寡核苷酸能够唯⼀地与⼀个⽬标RNA结合。在与靶向RNA结合后，寡核苷酸调控RNA功能的机制：促进RNA断裂和降解，或仅限于占位的机制，有时被称为空间阻滞机制。美国丽人下载
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仅占位的机制
⼏种反义机制不会导致靶RNA的直接降解。Paul Zamecnik ⾸次介绍了合成寡核酸的概念。可开发以阻断蛋⽩质翻译。他们合成低脱氧核酸与⾁瘤病毒RNA结合，阻断翻译，随后阻断病毒复制。随着寡核苷酸化学合成技术的发展，⼈们对利⽤寡核苷酸作为平台的兴趣进⼀步扩⼤。阻断蛋⽩翻译仍是⼀种可⾏的反义机制，但尚未被⼴泛⽤作策略。最近，⼏种增加蛋⽩质翻译的⽅法也被发表。
微⼩RNA是短RNA(约21⾄23个碱基)，抑制多重mRNA靶点翻译，导致基因⽹络的控制。ASOs与microRNAs结合，阻断单个microRNA，会导致⼤量蛋⽩质的表达增加。增加蛋⽩质产量，⼀个更具体的⽅法是设计⼀种ASO，使其与抑制蛋⽩质翻译的mRNA的5-⾮翻译区中的调控序列结合，例如上游的开放阅读框架或茎环结构。
蛋⽩质编码的每⼀个步骤都可以使⽤ASO进⾏调控。
⽐如ASO因⼦外显⼦跳越，经典药物：反义核酸药物eteplirsen（商品名：Exondys 51，Sarepta Therapeutics (NASDAQ:SRPT)，杜⽒肌营养不良症）
促进外显⼦Inclusion，经典药物：Nusinersen，商品名SPINRAZA，Ionis Pharma原研，脊髓性肌萎缩症（SMA）
其他⽐如作⽤在PolyA位点的ASO也在开发中。
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DNA降解机制
开发中的ASOs都是通过RNase H1或Argonaute 2(Ago 2)来促进RNA切割的。
RNase H1是⼀种内源性核酸酶，存在于⼤多数细胞中，它促进RNA-DNA异源双链中RNA的断裂。在哺乳动物细胞中，RNase H1存在于细胞核、线粒体和细胞质中，它具有多种功能，包括清除Okazaki⽚段中的RNA、DNA修复和R 环的分解。被设计为利⽤RNaseH1的寡核酸它们的作⽤机制，必须⾄少含有5个连续的DNA碱基，7-10个是最佳的。通过RNase机制降解靶RNA的寡核苷酸被⼴泛⽤作实验⼯具，⽬前正被开发⽤于多种适应症。
过RNase机制降解靶RNA的寡核苷酸被⼴泛⽤作实验⼯具，⽬前正被开发⽤于多种适应症。
通过RNA⼲扰途径⼯作的ASOs，通常以两个RNAs或修饰RNAs的双链形式传递给细胞或有机体，其中⼀条链被设计成与⽬标RNA结合，第⼆条passenger strand被降解。
⼀旦进⼊细胞质，双链就与核酸酶Ago 2结合，释放passenger strand。与RNase H1⼀样，Ago 2对寡核苷酸有特殊的结构要求，限制了可使⽤的化学修饰类型。
反义核酸药物化学修饰及制剂
未经修饰的RNA在体内会被迅速降解，为了增强寡核苷酸药物特性，需要进⾏化学结构改造和制剂开发。
常见的化学结构改造如下图
药物代谢动⼒学
ASO的药代动⼒学取决于它是单链的还是双链的，是带负电荷还是中性，以及是否加⼊微粒。
未形成的ASO⾜够⼩，可以被⾎液迅速过滤掉。肾脏和排泄在尿液中。寡核苷酸单链硫代磷酸酯（PS）修饰具有良好的药物代谢动⼒学特征。
它们与⾎清蛋⽩(如⽩蛋⽩)的结合增加，使它们在循环中维持⾜够长的时间来分配到组织中。静脉注射或⽪下注射后，从⾎浆到组织的分配阶段从分钟到⼏个⼩时不等，然后是持续数周的长时间消除阶段。 PS修饰寡核苷酸的组织分布与⽪下或静脉给药后相似；它们⼴泛分布于⼤多数外周组织，肾脏和肝脏累积的浓度最⾼。鞘内注射后，它们似乎分布在脑脊液中，从脑脊液到脊髓和脑组织，在脊髓和⽪质组织中观察到的药物浓度最⾼，在较深的脑结构中发现的药物较少。
⼤多数发布的数据表明，PS修饰的寡肽与细胞表⾯蛋⽩结合并随后被内吞⼊细胞内囊泡。ASOs最终从膜结合的细胞器中逃脱，很可能与蛋⽩质结合，从⽽帮助它们进⼊细胞核，并可能促进与细胞质和核RNA的杂交。
PS修饰的DNAASOs的组织半衰期相对较短，为2-3天，同时含有PS和糖修饰的寡核苷酸，如2-O-甲氧基⼄基(MOE)，其组织半衰期以数周为单位。
双链RNAASOs也被肾脏快速清除，表现出有限的组织分布。曾经使⽤脂质纳⽶颗粒制剂，增强siRNA药物对靶组织的递送。
由于纳⽶粒⼦的配⽅有其独特的不同之处，因此很难提供⼴泛的概括。Patisiran是⼀种脂质纳⽶粒制
剂，是⼀种靶向转胸腺肽的siRNA，它表现出剂量⽐例的⾎浆⽔平，这与降低⾎浆转胸腺素(TTR)⽔平有关。
可离⼦化的阳离⼦脂质纳⽶粒，如⽤于颗粒制剂的纳⽶粒，优先在肝细胞中积累，部分是通过循环中的ApoE颗粒和LDL受体的清除⽽积累的。
上市反义核酸药物概况
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Inotersen（Ionis Pharmaceuticals旗下Akcea Therapeutics）
Inotersen是⼀种第⼆代反义药物，它通过RNaseH1依赖机制阻⽌TTR蛋⽩的产⽣。TTR蛋⽩主要产于肝脏，形成四聚体，结合视⽹膜结合蛋⽩4(RBP 4)-视⽹膜复合体，阻⽌肾脏清除，并成为多种甲状腺激素转运蛋⽩之⼀。转胸腺肽基因的常染⾊体显性突变导致该蛋⽩的四聚体形式变得不稳定。TTR单体形成聚集体，沉积在多个组织中，包括周围神经、⼼脏组织和肾脏。这些聚集体通常会导致周围神经病变，严重的胃肠功能障碍，在某些情况下还会导致⼼肌病。遗传性TTR(hTTR)患者的平均预期寿命通常在发病后3~15年。
Inotersen是⼀种gapmer设计，在寡核苷酸的5’端和3’端有5个2-MOE核苷酸，中间有10个DNA核苷酸，
大卫克劳斯以⽀持RNase H1作⽤。
根据Inotersen的疗效和安全性，在遗传性经胸腺肽淀粉样变(hTTR)多发性神经疾病(Neuro-TTR，NCT 01737398)的第1期和第2期后，开始了随机双盲安慰剂对照III期试验。⼀172名受试者被随机分为三周⼀次，每周⼀次⽪下注射300毫升Inotersen或安慰剂(2：1)，持续15个⽉。在这项研究中，有五⼈死亡，全部在Inotersen组，其中四⼈与基础疾病的进展或并发症相⼀致。⼀位Inotersen⼿臂受试者患有致命的颅内出⾎，并伴有4级⾎⼩板减少症。⾎⼩板减少的机制尚不清楚。第三阶段的研究清楚地证明了hATTR多神经病患者的临床益处，主要的安全问题是⾎⼩板减少症和肾⼩球肾炎，可通过频繁监测加以处理。在欧洲和美国获得批准上市。
•Patisiran（商品名Onpattro，Alnylam制药公司）
Patisiran是⼀种化学修饰的(11个2-O-甲氧基糖)在脂质中配制的siRNA，靶向TTRmRNA的纳⽶颗粒制剂。在家族性hTTR多神经病患者中，最近完成了随机双盲安慰剂对照III期研究(APOLLOII；NCT 01960348)。225个病⼈每3周输注0.3mg/kg或安慰剂组（2:1）。持续18个⽉，使⽤预处理和缓慢初始输注增强耐受性。主要研究终点为mNIS+7，次要终点包括⽣命质量、肌⾁强度、步态速度、营养状态和⾃主功能。18个⽉mNIS+7评分-6.0±1.7，安慰剂组28±2.6(p < 0.001).观察到次级终点较安慰剂有所改善，如Norfolk⽣活质量-DN评分、改良体重指数和10-m步⾏试验。报告的不良事件与先前的
研究报告⼀致，其中最常见的是外周⽔肿和输液相关反应。美国和欧洲联盟上市申请已经获得批准。•Eteplirsen（商品名Exondys51，Sarepta Therapeutics公司）
eteplirsen是⼀种30-mer morpholino ASOs。⽬的是与Dstrophin前mRNA第51外显⼦结合，促进第51外显⼦的跳过，DMD患者，dystrophin微量上调。因为临床表现不是很明显，经过⼀年多争论，2016年FDA有条件批准上市。•Nusinersen（商品名SPINRAZA，中国商品名：诺西那⽣钠注射液，Biogen）
诺基亚5140
脊髓性肌萎缩症(SMA)是⼀种隐性遗传性神经肌⾁疾病，由存活运动神经元1(SMN1)的突变或缺失引起，该基因位于5号染⾊体上。
Nusinsen是⼀种均匀修饰的MOEASO，长度为18个核苷酸，被设计成与SMN2第7内含⼦中的⼀个序列结合。
因为ASOs不能跨越⾎-脑屏障，药物是注射到CSF中。对于⼈类临床研究，药物被评价为细胞内药物。腰椎穿刺注射。Nusinersen在2型和3型SMA中的初步临床研究受试者，其允许评价药物内给药的安全性和耐受性在医学上稳定的患者⼈中，基于令⼈⿎舞的安全性和临床体征，启动开放标签多次给药II期研究，1类，II类及III类SMA患者。
进⾏了两项Sham controlled III期研究，⼀项是根据SMN2基因拷贝数和疾病发病年龄预测发展为1型SMA的受试者，另⼀项是根据基因拷贝数、发病年龄和运动⾥程碑预测发展为2型SMA的受试者。这两项临床研究，显⽰病⼈体的运动功能的改善和改善1型SMA患者的存活率。在这两项研究中，nusinsen和sham队列的不良事件的发⽣率和严重程度是相似的。
美国和中国都批准了NusinsenSAM。FDA赞赏这是罕见病药物开发的典范。
参考⽂献
C. Frank Bennett，Therapeutic Antisense Oligonucleotides Are Coming of Age，Annu. Rev. Med. 2019. 70:307–21，Ionis Pharmaceuticals, Carlsbad, California 92010, USA
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