文章编号：1001-8689(2020)11-1144-04
两株携带bla
NDM-1
现代艺术150年
尧静1周芳1林云1杜娜1刘淑敏2施雄飞1白雅丽1杜艳2,*
(1 云南省中医医院检验科，昆明 650021；2 中国云南省检验医学重点实验室，云南省实验诊断研究所，
昆明医科大学第一附属医院医学检验科，昆明 650032)
摘要：目的探讨携带bla
NDM-1
基因布氏柠檬酸杆菌的耐药特点及同源性。方法试验菌株为从临床尿液标本中分离到的
两株耐碳青霉烯类的布氏柠檬酸杆菌。采用Vitek-2全自动微生物鉴定与药敏分析系统进行鉴定及药敏试验，PCR扩增bla NDM-1
基因并测序验证，质粒接合试验了解bla
NDM-1
基因是否可通过质粒进行水平传播，并对两菌株进行多位点序列分型(MLST)及ERIC-PCR分析。结果两株菌对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类和碳青霉烯类均高度耐药，并携
带bla
NDM-1基因。接合试验成功将两株菌的bla
NDM-1
基因转移至大肠埃希菌EC600。MLST分型为ST171，ERIC-PCR发现扩增条带
位置完全相同，即为同一基因型。结论检出两株具有相同基因型ST171携带bla
NDM-1
基因的布氏柠檬酸杆菌，且菌株对碳青霉烯类在内的多种抗生素均高度耐药。
关键词：布氏柠檬酸杆菌；新德里金属β-内酰胺酶-1；多位点序列分型；ERIC-PCR
中图分类号：R978.1 文献标志码：A
Drug resistance and homology analysis of two strains of Citrobacter braakii
harboring bla NDM-1
Yao Jing1, Zhou Fang1, Lin Yun1, Du Na1, Liu Shu-min2, Shi Xiong-fei1, Bai Ya-li1 and Du Yan2
(1 Department of Clinical Laboratory, Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650021; 2 Yunnan Key
Laboratory of Laboratory Medicine; Yunnan Institute of Laboratory; Department of Clinical Laboratory,
the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032)
Abstract Objective To investigate resistance characteristics and homology of Citrobacter braakii harboring bla
NDM-1
. Methods Two strains of carbapenem resistant C. braakii isolated from urine were identified by Vitek-2
automatic identification and antimicrobial sensitivity analysis system. The bla
NDM-1
gene was amplified by PCR and sequenced. Plasmid conjugation tests were performed to explore the conjugating transfer of plasmids, and the multi locus sequence typing (MLST) and ERIC-PCR analysis of the two isolates were carried out. Results Two isolates were highly resistant to penicillins, cephalosporins, aminoglycosides, tetracyclines, quinolones and carbapenems, and harbored bla
NDM-1
. The MLST suggested sequence typing of ST131, ERIC-PCR showed identical profile indicating
same genotype. Conclusion Two isolates of C. braakii were discovered harboring bla
NDM-1
母猪性激素
with the same genotype ST171which were highly resistant to various antibiotics including carbapenems.
Key words Citrobacter braakii; bla
NDM-1
; MLST; ERIC-PCR
收稿日期：2019-11-11
基金项目：2017年云南省医学学科带头人培养项目(No. D-2017023)；云南省科技厅-昆明医科大学联合基金项目[No. 2019FE001(-060)]作者简介：尧静，女，生于1990年，硕士，检验技师，主要从事细菌耐药基因传播机制研究，E-mail:******************
*通讯作者，E-mail:***************
新德里金属β-内酰胺酶-1 (New delhimetallol-β-lactamase 1，NDM-1)能够水解包括碳青霉烯类抗生素在内的几乎所有常见的β-内酰胺类抗生素。产NDM-1的菌株几乎对所有一线抗菌药物耐药，耐药性极强[1-2]。自2009年发现以来，全球超过50多个国家
已报道携带bla
NDM-1
细菌，其中主要集中于肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，而我国以不动杆菌属为主[2-4]。布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)属于肠杆菌科、柠檬酸杆属细菌，常发现于水、土壤、食物及动物和人类的胃肠道，可引起医院获得性菌血症、尿路感染等机会性感染[5-6]。因此菌主要为胞内繁殖菌，所以临床效果不佳，容易复发。我们在两位泌尿系
感染患者的中段尿中分离获得2株携带bla
NDM-1
基因布氏柠檬酸杆菌，并对其耐药性及同源性进行分析。
1 材料与方法
1.1菌株
2株携带bla
NDM-1
基因布氏柠檬酸杆菌分离自昆明某三甲医院住院患者标本，菌株T96来源于干疗外科一位87岁老年男性的尿液标本，菌株T116来源于中医科一位72岁女性尿液标本。接合试验受体菌为大肠埃希菌EC600，药敏质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.2试剂
哥伦比亚血琼脂平板购自郑州安图生物技术公司；鉴定GN卡和AST-GN14药物敏感试验卡购自法国BioMerieux公司；利福平及亚胺培南购自北京索莱宝公司；PCR所用试剂、D2000及细菌基因组DNA抽提试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；DNA Marker购自北京博迈德生物技术有限公司；PCR扩增引物和产物测序委托通用生物(安徽)有限公司完成。
1.3仪器
VITEK 2全自动微生物鉴定与药敏分析仪购自法
国BioMerieux公司；CO
2
培养箱购自昆明友宁科技公司；DNA扩增仪及电泳仪均购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统购自美国GE公司。
1.4方法
1.4.1菌株鉴定及药敏试验
运用法国BioMerieux公司的VITEK-2全自动微生物鉴定与药敏分析系统配套的GN卡、AST-GN14进行检测，药敏判断标准按照2017年美国CLSI 的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》[7]。
1.4.2 PCR扩增bla
NDM-1
橙书包公益项目基因
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测菌株DNA，以菌株DNA为模板，利用引物F(NDM-1)5'-GGG
CAGTCGCTTCCAACGGT-3'，R(NDM-1)5'-GTAGTGCTCAGTGTCGGCAT-3'[8]PCR扩增bla
NDM-1基因片段，扩增程序：97℃ 3min；94℃ 30s，57℃30s，72℃ 60s，30个循环；72℃ 5min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并测序。
1.4.3接合试验
携带bla
NDM-1
基因布氏柠檬酸杆菌为供体菌，耐
利福平大肠埃希菌EC600为受体菌。供体菌和受体菌分别接种于2mL LB液体培养基中，35℃、200r/min 振荡培养4h；
各吸取100μL菌液至5mL LB液体培养基35℃混合培养18h；取0.2mL混合菌液涂布于LB筛选平板(亚胺培南1μg/mL+利福平512μg/mL)上，35℃培养18h，对在筛选平板上生长的疑为接合子的菌落，进行菌种
鉴定、药敏试验、PCR扩增bla
NDM-1
基因并测序。
1.4.4 MLST
P C R扩增2株布氏柠檬酸杆菌的7个管家基因(aspC、clpX、fadD、mdh、arcA、danG、lysP)并测序，引物设计、反应体系及反应条件参见MLST网站[9]。测序结果通过MLST数据库进行比对，获得该菌株相应的序列型(sequence type，ST)。
1.4.5 ERIC-PCR
分析用重复序列PCR(ERIC-PCR)对菌株基因组DNA进行分型，探讨菌株间的同源性。引物ERIC2: 5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'[10]，扩增程序：94℃ 5min ；94℃ 60s，40℃ 60s，72℃ 60s，35个循环；72℃ 8min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中120V 电泳35min。结果判断标准：扩增条带位置完全相同则为同一基因型，主条带位置相同，副带相差1~2条者为亚型，不符合上述条件者为不同基因型[11]。
2 结果
2.1菌株鉴定及药物敏感性结果
临床分离的两菌株经法国BioMerieux公司VITEK-2全自动微生物鉴定均为布氏柠檬酸杆菌。T96及T166呈现出相似的药敏结果，对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类和碳青霉烯类均耐药，仅对氨曲南、阿米卡星及庆大霉素敏感。接合子EC600-T96和EC600-T166除四环素和喹诺酮类药敏结果与供体菌相反，其余药敏结果都相似，见表1。2.2 PCR扩增bla
NDM-1
基因片段
PCR扩增布氏柠檬酸杆菌T96及T116的bla
NDM-1
基因，扩增出476bp条带(图1)，测序结果在GeneBank
(bi.v/ BLAST/)中比对，确定为bla NDM-1基因。2.3 接合试验结果
接合子在含混合抗生素L B 平板上生长，经VITEK 2鉴定为大肠埃希菌，且PCR 可扩增出同供体菌大小一致的bla NDM-1片段，产物测序及比对确定为bla NDM-1基因，即2株携带bla NDM-1基因布氏柠檬酸杆菌接合试验成功。2.4 MLST
将2株布氏柠檬酸杆菌株的7个管家基因测序结果提交至相应的MLST 数据库进行比对，结果显示：T96与T116两株菌的7个管家基因类型一致，分别为aspC-42、clpX-86、fadD-94、mdh-76、arcA-29、danG-69、lysP-80，即ST171型，说明两菌株具有高度的同源性。2.5 ERIC-PCR 结果分析
2株携带bla NDM-1基因布氏柠檬酸杆菌，经ERIC-PCR 电泳图谱比对发现扩增条带位置相同，即为同
一基因型，见图2。3 讨论
携带bla NDM-1基因的细菌广泛分布于肠杆菌科、不动杆菌属和弧菌科(弧菌)等，导致伤口、呼吸道、血液和泌尿道等医院内或社区获得性感染[8,12-14]。但携带bla NDM-1基因的布氏柠檬酸杆菌较为少见，布氏柠檬酸杆菌常常携带ampC 基因导致对β-内酰胺类抗生素耐药，而耐碳青霉烯类布氏柠檬酸杆菌大都以携带碳青霉烯酶耐药基因bla OXA-48为主[15-16]。
bla NDM-1基因常位于大小不一的质粒上，某些质粒具有较强的转移能力和广泛的宿主适应范围，能在不同种属菌中存在并通过接合转移方式在种内或种间广泛传播[17]，导致bla NDM-1基因已由最开始的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌逐渐播散到其他菌种。本课题前期研究发现该院bla NDM-1基因主要集中于肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌及阴沟肠杆菌，但未在布氏柠檬酸杆菌中发现，且bla NDM-1基因全都位于阴沟肠杆菌质粒上，并能通过接合转移转入受体菌大肠埃希菌EC600中，导致EC600对碳青霉烯类耐药[18]。此次发现两株布氏柠檬酸杆菌的bla NDM-1基因也都位于可接合转移质粒上，且M
LST 分型为ST171，ERIC-PCR
表1 bla NDM-1基因阳性布氏柠檬酸杆菌的药敏结果/(mg/L)
LVX ，左氧氟沙星；PIP
，
哌拉西林；GEN ，庆大霉素；AMK ，阿米卡星
M ：DNA Maker ；1~2：T96 bla NDM-1基因片段；
3~4：T116 bla NDM-1基因片段
本原多项式
图1 PCR 扩增bla NDM-1基因片段Fig. 1 PCR amplification of bla NDM-1 gene
100
500
1,500
3,000
bp M 1 2 3 4M ：D2000；1：T96；T2：T166
图2 ERIC-PCR 分析图Fig. 2 ERIC-PCR analysis
500
10002000
bp M 1 2
分型也一致，提示克隆传播。推测bla
NDM-1
西藏历史基因可能
来自于之前bla
NDM-1
阳性菌株。
MLST是一种以PCR为基础的核苷酸序列分析分型方法，简单易操作，分辨率高，重复性好，可与MLST数据库中相同菌种的不同ST型进行对比，从而得出目标流行株。该方法可以实现不同地区、不同国家共享菌种的序列数据，因此可以在全国甚至全球范围内实施流行病学调查[19]。本研究发现两株ST171布氏柠檬酸杆菌，为同一克隆型，昆明地区曾报道过NDM-1酶阳性的肺炎克雷伯菌ST105暴发流行，而NDM-1阳性的布氏柠檬酸杆菌暴发流行未
见报道[20]。携带bla
NDM-1
基因布氏柠檬酸杆菌对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类和碳青霉烯类均耐药，给临床带来很大困
难。因此，进一步加强对bla
NDM-1
基因的筛查，并采取措施预防耐药菌株传播流行非常重要。
参考文献
[1] Yong D, Toleman M A, Giske C G, et al.Characterization of
a new metallo-beta-lactamase gene, bla
(NDM-1), and a novel
erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India[J].
Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(12): 5046-5054. [2] Kumarasamy K K, Toleman M A, Walsh T R, et al.
Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study[J]. Lancet Infect Dis, 2010,10(9): 597-602.
[3] Chen Y, Zhou Z, Jiang Y, et al. Emergence of NDM-
1-producing Acinetobacter baumannii in China[J]. J Antimicrob Chemother, 2011, 66(6): 1255-1259.
[4] Yang J, Chen Y, Jia X, et al. Dissemination and
characterization of NDM-1-producing Acinetobacter pittii in an intensive care unit in China[J]. ClinMicrobiol Infect, 2012, 18(12): E506-E513.
[5] Brenner D, Grimont P, Steigerwalt A, et al. Classification
of citrobacteria by DNA hybridization: designation of Citrobacter farmeri sp. nov., Citrobacter youngae sp. nov., Citrobacter braakii sp. nov., Citrobacter werkmanii sp. nov., Citrobacter sedlakii sp. nov., and three unnamed Citrobacter genomospecies[J]. Int J Syst Bacteriol,1993, 43(4): 645-658.
北京全面推行电子职称证书
[6] Arens S, Verhaegen J, Verbist L. Differentiation and
susceptibility of Citrobacter isolates from patients in a university hospital[J]. Clin Microbiol Infect, 1996, 3(1): 53-57.
[7] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance
standards for antimicrobial susceptibility testing[S].
M100-S27, CLSI, 2017: 30-36.
[8] Balkan I I, Aygün G, Aydın S, et al.Blood stream
infections due to OXA-48-like carbapenemase-producing Enterobacteriaceae: treatment and survival[J]. Int J Infect Dis, 2014, 26: 51-56.
[9] Bai L, Xia S L, Lan R T, et al. Isolation and characterization
of cytotoxic, aggregative Citrobacter freundii[J]. PLoS One, 2012, 7(3): e33054.
[10] Giakkoupi P, Pappa O, Polemis M, et al. Emerging
Klebsiella pneumoniae isolates coproducing KPC-2 and VIM-1 carbapenemases[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(9): 4048-4050.
[11] 甘龙杰, 吴秀风, 高丽钦, 等. 碳青霉烯类耐药肺炎克雷
伯菌基因型检测及同源性分析[J]. 中国微生态学杂志, 2014, 26(3): 316-318.
[12] Sonnevend A, Al Baloushi A, Ghazawi A, et al. Emergence
and spread of NDM-1 producer Enterobacteriaceae with contribution 2 of IncX3 plasmids in the United Arab Emirates[J]. J Med Microbiol,2013, 62(Pt 7): 1044-1050. [13] 张盼, 沈振华, 张燕华, 等. 8株产NDM-1肠杆菌科细菌的耐
药特点和流行性分析[J]. 检验医学, 2018, 33(7): 616-621. [14] Wang J, Ning Y, Li S, et al. Multidrug-resistant Acinetobacter
baumannii strains with NDM-1: Molecular characterization and in vitro efficacy of meropenem-based combinations[J].
Exp Ther Med, 2019, 18(4): 2924-2932.
[15] Parvez S, Khan A U. Hospital sewage water: a reservoir
for variants of New Delhi metallo-β-lactamase (NDM)-and extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Enterobacteriaceae[J]. Int J Antimicrob Agents, 2018, 51(1): 82-88.
[16] Tafoukt R, Touati A, Leangapichart T, et al. Characterization
of OXA-48-like-producing Enterobacteriaceae isolated from river water in Algeria[J]. Water Res, 2017, 120: 185-189. [17] Qin S, Fu Y, Zhang Q, et al. High incidence and endemic
spread of NDM-1-positive Enterobacteriaceae in Henan Province, China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(8): 4275-4282.
[18] Du N, Liu S M, Niu M, et al. Transmission and characterization
of bla
NDM-1
in Enterobacter cloacae at a teaching hospital in Yunnan, China[J]. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 2017, 16(1): 58. doi: 10.1186/s12941-017-0232-y.
[19] Enright M C, Day N P, Davies CE, et al. Multilocus
sequence typing for characterization of methicillin- resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(3): 1008-1015. [20] Zheng R, Zhang Q, Guo Y, et al. Outbreak of plasmid-
mediated NDM-1-producing Klebsiella pneumoniae ST105 among neonatal patients in Yunnan, China[J]. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 2016, 15: 10-16.
