ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ通过靶基因ＴＮＫＳ２调控肝癌细胞增殖、侵袭、迁移的分 子机制探讨
赵克昌，吴世乐，刘林勋，冯鹏才，杨金煜
ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｔｈｅｌｉｖｅｒｃａｎ ｃｅｒｃｅｌｌｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＴＮＫＳ２ｇｅｎｅ
ＺＨＡＯＫｅｃｈａｎｇ，ＷＵＳｈｉｌｅ，ＬＩＵＬｉｎｘｕｎ，ＦＥＮＧＰｅｎｇｃａｉ，ＹＡＮＧＪｉｎｙｕ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＱｉｎｇｈａｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＰｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，ＱｉｎｇｈａｉＸｉｎｉｎｇ８１０００７，Ｃｈｉｎａ．
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｌｉｖｅｒ
ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌａｎｄｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｉｎｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒＨｅｐＧ２，ＳＭＭＣ－
７７２１ａｎｄＢＥＬ－７４０２ｃｅｌｌｓａｓｗｅｌｌａｓｎｏｒｍａｌｌｉｖｅｒｃｅｌｌＬ０２ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴ－ＰＣＲ．ＴｈｅＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｌｉｎｅｗｉｔｈ
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐａｎｄｔｈｅＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｌｉｎｅｗｉｔｈｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＴＮＫＳ２ｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＭＴＴ，Ｔｒａｎ
ｓｗｅｌｌａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒｓ网络风云
ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＰｏｓｓｉｂｌｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｗｉｔｈｄｕａｌｌｕ
ｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｇｅｎｅａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｌｉｖｅｒｃｅｌｌＬ０２，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｉｎｌｉｖｅｒ
ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＨｅｐＧ２ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ
（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐａｎｄｔｈｅｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＴＮＫＳ２ｂｏｔｈｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，
ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌ（Ｐ＜０．０５）．ＥｆｆｅｃｔｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆ
ｔｈｅＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｃａｎｂｅｐａｒｔｉａｌｌｙｒｅｖｅｒｓｅｄｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｂｙｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ，ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ，ＴＮＫＳ２，ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｉｎｖａｓｉｏｎ
ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１，２９（０５）：０７５５－０７６０
【摘要】 目的：探讨ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其潜在的作用机制。方法：运用
ｑＲＴ－ＰＣＲ检测人肝癌细胞ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ－７７２１、ＢＥＬ－７４０２和正常肝细胞Ｌ０２中ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ和ＴＮＫＳ２
的ｍＲＮＡ表达水平。建立ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ过表达和ＴＮＫＳ２抑制表达的ＨｅｐＧ２细胞株，采用ＭＴＴ法检测细胞 增殖活力，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室检测细胞的迁移及侵袭能力，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＴＮＫＳ２蛋白的表达水平；双荧光素酶
报告基因分析法验证ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ可能的靶基因。结果：与正常肝细胞Ｌ０２相比，肝癌细胞ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ－
７７２１及ＢＥＬ－７４０２中ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ的表达显著降低（Ｐ＜０．０５），ＴＮＫＳ２的表达显著升高（Ｐ＜０．０５）。过表
达ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ或抑制表达ＴＮＫＳ２均可抑制ＨｅｐＧ２细胞的增殖、迁移及侵袭（Ｐ＜０．０５）。ＴＮＫＳ２是ｍｉＲ－
５２６ｂ－３ｐ的靶基因。过表达ＴＮＫＳ２可部分逆转过表达ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ对ＨｅｐＧ２细胞增殖、迁移及侵袭的抑
制作用。结论：ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ可通过下调ＴＮＫＳ２的表达，从而抑制肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
【关键词】肝癌；ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ；ＴＮＫＳ２；细胞增殖；迁移；侵袭
【中图分类号】Ｒ７３５．７ 【文献标识码】Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－４９９２．２０２１．０５．００８
【文章编号】１６７２－４９９２－（２０２１）０５－０７５５－０６
肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其具有侵袭性强和易远处转移的特点［１］。近年来该病的发病率有所上升，且尚未取得满意的效果。因此，阐明肝癌发生的确切分子机制，
【收稿日期】 ２０１９－０４－２９
【作者单位】 青海省人民医院普外科，青海 西宁 ８１０００７
【作者简介】 赵克昌（１９８３－），男，土族，青海人，主治医师，主要从事肝癌诊治及肝移植工作。Ｅ－ｍａｉｌ：２７９０９４５３１＠ｑｑ．
ｃｏｍ
【通讯作者】 杨金煜（１９６６－），男，青海人，主任医师，主要从事普外科临床诊疗工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｈｙｊｙ３３３＠１６３．ｃｏｍ开发新的靶点具有重要意义。ＴＮＫＳ２，是端锚聚合酶（ＴＮＫＳ）的一种，属于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶家族，位于人类第８号染体。在癌细胞中，ＴＮＫＳ２通过调控端粒酶和端粒结合，诱导端粒延长，参与对损伤ＤＮＡ的修复及细胞凋亡的调控［２］。已有的研究表明，ＴＮＫＳ２在多种肿瘤细胞中表达上调，并且有望成为结肠癌［３］、乳腺癌［４］及肺癌［５］的靶点。微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）是一类短链的、较保守的、非编码单链小分子ＲＮＡ。其通过与其靶基因的３＇ＵＴＲ特异性结合，引
起靶基因ｍＲＮＡ的降解或抑制翻译过程而发挥其对靶基因的调控作用。大量研究表明，ｍｉＲＮＡ在肿瘤中扮演着癌基因或抑癌基因的角。在胃癌［６］、肺癌［７］、结肠
·
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现代肿瘤医学 ２０２１年０３月 第２９卷第０５期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｒ ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０５
癌［８］、肝癌［９］及在乳腺癌［１０］中，ｍｉＲ－５２６ｂ通过调节其靶基
因影响肿瘤细胞增殖和肿瘤形成。但ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ通过靶向调控Ｔ
ＮＫＳ２的表达对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力还鲜有报道。本文通过检测肝癌细胞中ｍｉＲ－５
２６ｂ－３ｐ和ＴＮＫＳ２的表达情况，观察过表达ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，探究ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ对ＴＮＫＳ２的靶向作用机制，以期为肝癌提供新的方向。１ 材料与方法
１．１ 实验材料、试剂与仪器
人正常肝细胞Ｌ０２和肝癌细胞ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ－７７２１、ＢＥＬ－７４０２均购于中国科学院上海细胞库；胎牛血清及ＲＰＭＩ
１６４０培养基均购于美国Ｇ
ｉｂｃｏ公司；ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ
２０００及相关转染试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；兔抗人ＴＮＫＳ２、ＧＡＰＤＨ一抗及羊抗兔二抗购于英国Ａｂｃａｍ公司；ＭＴＴ试剂购自美国Ａ
ｍｒｅｓｃｏ公司；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室购自Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；ＭａｔｒｉｇｅｌＩｎｖａｓｉｏｎＣｈａｍｂｅｒｓ购自Ｃｏｒｉｎｇ公司。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ试剂盒、ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ模拟物、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ模拟物、ＴＮＫＳ２过表达质粒（ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２）及其对照质粒（ｐｃＤＮＡ）、野生型及突变型ＴＮ
ＫＳ２基因３＇ＵＴＲ－荧光素酶表达载体（
ＷＴ－ＴＮＫＳ２Ｒ和ＭＵＴ－ＴＮＫＳ２）的构建和测序由上海生工公司完成。ＲＩＰＡ裂解液、ＢＣＡ蛋白定量试剂盒、ＰＶＤＦ膜、Ｗｅｓｔｅｒｎ洗涤液及封闭液购自上海碧云天公司。酶标仪购自美国赛默飞公司，荧光定量ＰＣＲ仪购自美国ＡＢＩ公司，倒置显微镜购自日本尼康公司。１．２ 细胞培养、转染与分组
人肝癌细胞ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ－７７２１、ＢＥＬ－７４０２和正常肝细胞Ｌ０２常规培养于３７℃、含５％ＣＯ２的细胞培养箱中。定期观察细胞，根据细胞生长情况更换培养液，当细胞融合度约为８０％时，用胰酶消化传代。
将ＨｅｐＧ２细胞分为ｍｉＲ－ＮＣ组（转染ｍｉＲ－ＮＣ）和ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组（转染ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ），ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ组（转染ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ）和ａｎｔｉ－ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组（转染ａｎｔｉ－ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ），ｓｉ－ＮＣ组（转染ｓｉ－ＮＣ）和ｓｉ－ＴＮＫＳ２组（转染ｓｉ－ＴＮＫＳ２），ｍｉＲ－５２６－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ组（转染ｍｉＲ－５２６－３ｐ和ｐｃＤＮＡ）组和ｍｉＲ－５２６－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２组（转染ｍｉＲ－５２６－３ｐ和ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２）。
收集对数生长期的ＨｅｐＧ２细胞，以细胞密度为５×１０
５
个／孔接种于６孔板中，待细胞融合度达到５０％～６０％时，将
每组的ｍｉＲＮＡ与ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ
２０００分别混合，室温孵育
２０ｍｉｎ后，将混合物加入ＨｅｐＧ２细胞中摇晃混匀，置于培养箱中培养６ｈ
，更换为正常细胞培养基继续培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ，进行后续实验分析。
１．３ ｑＲＴ－ＰＣＲ检测ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ和ＴＮＫＳ２的ｍＲＮＡ表达水平
按照Ｔｒｉｚｏｌ说明书分别提取人肝癌细胞ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ－７７２１、ＢＥＬ－７４０２和正常肝细胞Ｌ０２总ＲＮＡ，检测其浓度和纯度后，逆转录酶催化合成ｃＤＮＡ，按照说明书进行ｑＲＴ－ＰＣＲ方法扩增。引物序列参照文献［３，９］，见表１。扩增条件为９４℃４ｍｉｎ，按（９４℃１ｍｉｎ，５６℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ）循环４０次，获得Ｃｔ值。ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ和ＴＮＫＳ２ｍＲＮＡ的检测分别以Ｕ６和ＧＡＰＤＨ为内参。ｍＲＮＡ的相对表达量采
用２－△△Ｃｔ法计算。
表１ 引物序列
Ｔａｂ．１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓ
Ｐｒｉｍｅｒ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５＇－３＇）ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐＦ：ＧＧＧＧＡＧＴＴＡＧＧＡＴＴＡＧＧＴＣ
Ｒ：ＴＧＣＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣ
Ｕ６Ｆ：ＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＢＨＣＡＲ：ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴＴＮＫＳ２Ｆ：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＧＧＡＣＴＧＧＣＴＴＧＧＲ：ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＰＤＨ
Ｆ：ＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＴＴＧＲ：ＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣ
１．４ ＭＴＴ法检测细胞增殖活力
分别取ｍｉＲ－ＮＣ组、ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组、ｓｉ－ＮＣ组、ｓｉ－ＴＮＫＳ２组、ｍｉＲ
－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ组及ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２组转染成功的对数期细胞，
用胰酶消化后重悬细胞，以３×１０３
个／孔细胞数接种于９６孔板中，每组设３
个复孔，常规培养２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ后，每组分别加入２０μＬＭＴＴ试剂，继续孵育４ｈ后吸去孔内液体，每孔加入ＤＭＳＯ１５０μＬ，于摇床上低速振荡１０ｍｉｎ，以空白孔调零，用酶标仪测定４
９０ｎｍ处各孔光密度（ＯＤ）值。１．５ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法检测细胞迁移、侵袭能力
分别将ｍｉＲ－ＮＣ组、ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组、ｓｉ－ＮＣ组、ｓｉ－ＴＮＫＳ２组、ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ组及ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２组转染成功的对数期细胞用胰蛋白酶消化后，用纯ＲＰＭＩ１６４０培养基重悬细胞，调整细胞浓度为５×
１０５个／ｍＬ。首先取５００μＬ１０％ＦＢＳＲＰＭＩ１６４０培养基加入
到２
４孔板各孔中，将Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室置于孔上，放入细胞培养箱平衡３０ｍｉｎ。每个小室上腔加入２００μＬ细胞悬液。每组设置３个复孔，
将２４孔板置于常规细胞培养箱中孵育过夜。取出上腔，用棉签擦去上室膜上未迁移的细胞，ＰＢＳ洗２次，甲醇固定３０ｍｉｎ。自然晾干后，结晶紫染２０ｍｉｎ。弃染液，双蒸水洗２次。取出后于倒置显微镜下观察拍照（４００倍），计数上、下、左、右、中５个不同视野的总细胞数并取平均值。
将转染成功的对数期细胞进行Ｔ
ｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验。将基质胶和ＲＰＭＩ１６４０培养基按１∶８稀释后取６０μＬ平铺于培养小室上腔，风干后备用，其他步骤同Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ体外迁移实验。１．６ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定蛋白表达水平
用ＲＩＰＡ裂解液分别提取ｍｉＲ－ＮＣ组、ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ组、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组、ｓｉ－ＮＣ组、ｓｉ－ＴＮＫＳ２组、ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ组及ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２组细胞蛋白，同时也提取人肝癌细胞ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ－７７２１、ＢＥＬ－７４０２和正常肝细胞Ｌ０２蛋白，用ＢＣＡ蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。以每１μＬ蛋白样品与１μ
Ｌ蛋白上样缓冲液（２×）混匀沸水浴３～５ｍｉｎ变性后，取３０μｇ变性蛋白上样至ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶加样孔中进行电泳。经电转将蛋白转移至ＰＶＤＦ膜上。转膜完毕后立即用Ｗｅ
ｓｔｅｒｎ洗涤液洗膜２ｍｉｎ，用滴管吸尽洗涤液后用Ｗｅｓｔｅｒｎ封闭液室温封闭６０ｍｉｎ，吸尽封闭液，加入相应的抗ＴＮＫＳ２（１∶１００００）和抗ＧＡＰＤＨ（１∶２０００）的一抗４℃孵育过夜，ＴＢＳＴ洗涤３次，每次１０ｍｉｎ；再加入相对应的二抗（１∶１０００）室温孵育２ｈ，ＴＢＳＴ洗涤３次，每次１０ｍｉｎ，于暗盒内
·６５７·赵克昌，等 ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ通过靶基因ＴＮＫＳ２调控肝癌细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制探讨
滴加显影液进行化学发光显，凝胶成像系统拍照，ＩｍａｇｅＪ分析目的条带的灰度值。以ＧＡＰＤＨ为内参，以目的条带灰度值与Ｇ
ＡＰＤＨ灰度值的比值表示目的蛋白的表达情况。１．７ 双荧光素酶报告实验检测ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ的靶基因
用靶基因预测数据库ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒ ｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）网站预测ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ的靶基因，发现ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ可与ＴＮＫＳ２的
３＇ＵＴＲ结合，猜测ＴＮＫＳ２是ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ的靶基因。为了验证这一猜想，构建ＴＮＫＳ２的野生型ＷＴ－Ｔ
ＮＫＳ２和突变型ＭＵＴ－ＴＮＫＳ２的ＴＮＫＳ２３＇ＵＴＲ荧光素酶表达载体。实验分为ＷＴ－ＴＮＫＳ２和ＭＵＴ－ＴＮＫＳ２
组。取对数生长期ＨｅｐＧ２细胞接种于２４孔板（５×１０４个／
孔），待细胞生长至５０％～６０％融合时，参照１．２中Ｌｉｐｏ
ｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００转染方法将ＷＴ－ＴＮＫＳ２、ＭＵＴ－ＴＮＫＳ２分
斯塔尔报告
别与ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ模拟物和ｍｉＲ－ＮＣ共转染。培养４８ｈ后使用荧光素酶报告基因检测仪进行测定。实验结果以荧光素酶活性和Ｒｅｎｉｌｌａ活性的比值进行统计学分析。实验重复６次。１．８ 统计学方法
使用ＳＰＳＳ２２．０统计软件进行数据分析，所有数据均用（珋ｘ±ｓ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间差异选用ｔ检验进行分析，Ｐ＜０．０５表示差异有统计学意义。２ 结果
２．１ ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ和ＴＮＫＳ２在各细胞中的表达
ｑＲＴ－ＰＣＲ显示（表２），与正常肝细胞Ｌ０２中ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ的表达相比，肝癌ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ－７７２１、ＢＥＬ－７４０２细胞中ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｍＲＮＡ的表达水平显著降低（均Ｐ＜０．０５）；与正常肝细胞Ｌ０２中ＴＮＫＳ２ｍＲＮＡ的表达相比，肝癌ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ－７７２１、ＢＥＬ－７４０２细胞中ＴＮＫＳ２ｍＲＮＡ的表达水平显著升高（
均Ｐ＜０．０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示（图１和表２），与正常肝细胞Ｌ０２中ＴＮＫＳ２蛋白的表达相比，肝癌ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ－７７２１、ＢＥＬ－７４０２细胞中ＴＮＫＳ２蛋白的表达水平显著升高（均Ｐ＜０．０５）。
表２ ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ和ＴＮＫＳ２在各细胞中的表达 （珋ｘ±ｓ，ｎ＝１２）
Ｔａｂ．２ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐａｎｄＴＮＫＳ２ｉｎｃｅｌｌｓ （珋ｘ±ｓ，
ｎ＝１２）ＣｅｌｌｓｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｍＲＮＡ
ＴＮＫＳ２ｍＲＮＡＴＮＫＳ２ｐｒｏｔｅｉｎＬ０２１．０１±０．０８
１．００±０．０９
０．２７±０．０３
ＨｅｐＧ２
０．３３±０．０４
２．３６±０．１９
０．６３±０．０５
ＳＭＭＣ－７７２１０．４２±０．０４
双轨学制２．０８±０．２１ ０．５９±０．０６ ＢＥＬ－７４０２０．３５±０．０３
２．１３±０．２２ ０．６８±０．０７ Ｆ４７９．８１０１２９．５３０
１３８．５８８
Ｐ
０．０００
０．００００．０００enthalpic
注：与Ｌ０２细胞比较， Ｐ＜０．０５。 Ｎｏｔｅ： Ｐ＜
０．０５ｖｓＬ０２ｃｅｌｌｓ
．图１ 各细胞中ＴＮＫＳ２蛋白的表达Ｆｉｇ．１ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｃｅｌｌｓ
２．２ ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ靶向调控ＴＮＫＳ２的表达
荧光素酶报告基因检测ＨｅｐＧ２细胞ＴＮＫＳ２基因ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ定位序列显示（图２Ａ），ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ在ＴＮＫＳ２基因３＇ＵＴＲ有相应结合位点。荧光素酶活性检测结果显示（表３），野生型ＴＮＫＳ２基因表达载体ＷＴ－ＴＮＫＳ２和ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ共转
染组ＨｅｐＧ２细胞的荧光素酶活性较转染ｍｉＲ－ＮＣ组显著降低（Ｐ＜０．０５）；突变型ＴＮＫＳ２基因表达载体ＭＵＴ－ＴＮＫＳ２和ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ共转染组ＨｅｐＧ２细胞的荧光素酶活性较ｍｉＲ－ＮＣ组无明显变化。这一结果表明，ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ可通过直接识别ＴＮＫＳ２基因上３＇ＵＴＲ位点来抑制ＴＮＫＳ２的表达，即ＴＮＫＳ２是ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ的靶基因。
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果显示（图２Ｂ和表４），ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ过表达组ＨｅｐＧ２细胞ＴＮＫＳ２蛋白表达水平较ｍｉＲ－ＮＣ组明显降低（Ｐ＜０．０５）；ａｎｔｉ－ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ表达组ＨｅｐＧ２细胞ＴＮＫＳ２蛋白表达水平较ｍｉＲ－ＮＣ组明显升高（Ｐ＜０．０５）。这一结果说明，ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ可抑制ＨｅｐＧ２细胞ＴＮＫＳ２
基因的表达。
图２ ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ靶向调控ＴＮＫＳ２的表达
Ａ：ＴＮＫＳ２的３＇ＵＴＲ中含有与ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ互补的核苷酸序列；Ｂ：ＴＮＫＳ２蛋白表达。
Ｆｉｇ．２ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２ｗａｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐＡ：ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｏｎ３＇ＵＴＲｏｆＴＮＫＳ２ｇｅｎｅ．Ｂ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２ｐｒｏｔｅｉｎ．
表３ 双荧光素酶报告实验 （珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ｔａｂ．３ Ｄｏｕｂｌｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｉｎｇｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ （珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）ＧｒｏｕｐｓＷＴ－ＴＮＫＳ２ＭＵＴ－ＴＮＫＳ２ｍｉＲ－ＮＣ１．０１±０．０９
０．９９±０．０８ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ０．４２±０．０４
０．９８±０．０９ｔ１４．６７４
０．２０３Ｐ
０．０００
０．８４３
注：与ｍｉＲ－ＮＣ组比较， Ｐ＜０．０５。 Ｎｏｔｅ： Ｐ＜
０．０５ｖｓｍｉＲ－ＮＣｇｒｏｕｐ．２．３ ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ过表达对肝癌ＨｅｐＧ２细胞增殖、迁移、侵袭的影响
ＭＴＴ增殖实验结果显示（表５），ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ过表达后，分别于２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ检测细胞增殖活力。结果发现在４８ｈ、７２ｈ时，ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组ＨｅｐＧ２细胞增殖活力均显著低于ｍｉＲ－ＮＣ组（均Ｐ＜０．０５）。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ迁移实验结果显示（图３和表５），ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组ＨｅｐＧ２细胞迁移细胞数较ｍｉＲ－ＮＣ组迁移细胞数明
显减少，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；体外侵袭实验结果显示（图３和表５），ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组ＨｅｐＧ２细胞侵袭细胞
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７５７·现代肿瘤医学 ２０２１年０３月 第２９卷第０５期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｒ ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０５
数较ｍｉＲ－ＮＣ组侵袭细胞数明显减少，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。提示ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ过表达可抑制肝癌ＨｅｐＧ２细胞的迁移和侵袭能力。
２．４ 抑制ＴＮＫＳ２表达对肝癌ＨｅｐＧ２细胞增殖、迁移、侵袭的影响
新时代工人的力量
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示（图４和表６），ｓｉ－ＴＮＫＳ２组ＴＮＫＳ２蛋白表达水平显著低于ｓｉ－ＮＣ组（Ｐ＜０．０５）。
两个加快ＭＴＴ增殖实验结果显示（表６），抑制ＴＮＫＳ２表达后，分别于２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ检测细胞增殖活力。结果发现在４８ｈ、７２ｈ时，ｓｉ－ＴＮＫＳ２组ＨｅｐＧ２细胞增殖活力均显著低于ｓｉ－ＮＣ组（
均Ｐ＜０．０５）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ迁移实验结果显示（表６），ｓｉ－ＴＮＫＳ２组ＨｅｐＧ２细胞迁移细胞数较ｓｉ－ＮＣ组迁移细胞数明显减少，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；体外侵袭实验结果显示（表６），ｓｉ－ＴＮＫＳ２组ＨｅｐＧ２细胞侵袭细胞数较ｓｉ－ＮＣ组侵
袭细胞数明显减少，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。提示抑制ＴＮＫＳ２表达可抑制肝癌Ｈ
ｅｐＧ２细胞的迁移和侵袭能力。
表４ 各组ＴＮＫＳ２蛋白的表达 （珋ｘ±ｓ，ｎ＝１２）
Ｔａｂ．４ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ （珋ｘ±ｓ，ｎ＝１２）ＧｒｏｕｐｓＴＮＫＳ２ｐｒｏｔｅｉｎＦＰ
ｍｉＲ－ＮＣ０．６４±０．０６３３８．７１６０．０００
ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ０．２１±０．０３
ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ０．５８±０．０５
ａｎｔｉ－ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ０．９６±０．０８
＃注：与ｍｉＲ－ＮＣ组比较， Ｐ＜
０．０５；与ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ组比较，＃Ｐ＜０．０５
。Ｎｏｔｅ： Ｐ＜０．０５ｖｓｍｉＲ－ＮＣｇｒｏｕｐ．＃Ｐ＜０．０５ｖｓａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣｇｒｏｕｐ．
表５ ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ过表达对肝癌ＨｅｐＧ２细胞增殖、迁移、侵袭的影响 （珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ｔａｂ．５ ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ （珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
ＧｒｏｕｐｓｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐＣｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（ＯＤ４９０
）２４ｈ４８ｈ７２ｈＣｅｌｌｎｕｍｂｅｒｓｏｆ
ｍｉｇｒａｔｉｏｎ
Ｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒｓｏｆｉｎｖａｓｉｏｎ
ｍｉＲ－ＮＣ
０．９９±０．０８
０．４１±０．０４０．７９±０．０７
１．１８±０．０９
１０４．２７±９．５６
８３．１７±８．０２
ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ２．３４±０．２１
０．３８±０．０３０．５５±０．０５
０．６９±０．０６
４９．３８±４．２７
３６．５２±３．４７
ｔ１４．７１５１．４７０６．８３４
１１．０９６
１２．８４１
１３．０７７
Ｐ０．００００．１７２
０．００００．００００．００００．０００
注：与ｍｉＲ－ＮＣ组比较， Ｐ＜０．０５。 Ｎｏｔｅ： Ｐ＜
０．０５ｖｓｍｉＲ－ＮＣｇｒｏｕｐ
．图３ 肝癌ＨｅｐＧ２细胞的迁移、侵袭检测（结晶紫染×４００）
Ｆｉｇ．３ ＴｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ（ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔｓｔａｉｎｉｎｇ×４００）
２．５ ＴＮＫＳ２过表达逆转了ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ过表达对肝癌ＨｅｐＧ２细胞增殖、迁移、侵袭的作用
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果显示（图５和表７），ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组ＨｅｐＧ２细胞ＴＮＫＳ２蛋白表达水平较ｍｉＲ－ＮＣ组明显降低（Ｐ＜０．０５）；共转染ｍｉＲ－５２６ｂ－
３ｐ和ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２的ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２组ＨｅｐＧ２细胞ＴＮＫＳ２蛋白的表达（０．４７±０．０４）较ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ组（０．１８±０．０３）明显升高（Ｐ＜０．０５）。
ＭＴＴ法检测结果显示（表７），在４８ｈ、７２ｈ时，ｍｉＲ－
５２６ｂ－３ｐ组ＨｅｐＧ２细胞活力较ｍｉＲ－ＮＣ组显著降低（均Ｐ＜０．０５）；ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２组ＨｅｐＧ２细胞活力较ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ组显著升高（均Ｐ＜０．０５）。 Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ迁移实验结果显示（表７），ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组细胞迁移数量较ｍｉＲ－ＮＣ组明显减少（Ｐ＜０．０５）；ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２组细胞迁移数量较ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ组显著升高（Ｐ＜０．０５）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验结果显示（表７），ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ组细胞侵袭数量较ｍｉＲ－ＮＣ组明显减少（Ｐ＜０．０５）；ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２
·８５７·赵克昌，等 ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ通过靶基因ＴＮＫＳ２调控肝癌细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制探讨
组细胞侵袭数量较ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ组显著升高（Ｐ＜０．０５）。表明ＴＮＫ
Ｓ２过表达可以逆转ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ过
表达对Ｈ
ｅｐＧ２细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。表６ 抑制ＴＮＫＳ２表达对肝癌ＨｅｐＧ２细胞增殖、迁移、侵袭的影响 （珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
Ｔａｂ．６ ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２ｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ （珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
ＧｒｏｕｐｓＴＮＫＳ２ｐｒｏｔｅｉｎＣｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（ＯＤ４９０
）２４ｈ４８ｈ７２ｈＣｅｌｌｎｕｍｂｅｒｓｏｆ
ｍｉｇｒａｔｉｏｎＣｅｌｌｎｕｍｂｅｒｓｏｆｉｎｖａｓｉｏｎｓｉ－ＮＣ０．６６±０．０６０．４２±０．０４０．７８±０．０７１．１９±０．
１１９７．５３±８．２６８６．２７±８．２４
ｓｉ－ＴＮＫＳ２０．２３±０．０３
０．４１±０．０４０．６１±０．０６
０．７６±０．０７
５２．１９±４．３７
４４．６２±４．２７
ｔ１５．７０１
０．４３３４．５１７
８．０７８
１１．８８５
１０．９９３
Ｐ
０．０００
０．６７４
０．００１
０．０００
０．０００
０．０００
注：与ｓｉ－ＮＣ组比较， Ｐ＜０．０５。 Ｎｏｔｅ： Ｐ＜
０．０５ｖｓｓｉ－ＮＣｇｒｏｕｐ
．图４ 抑制ＴＮＫＳ２后ＴＮＫＳ２蛋白的表达
Ｆｉｇ．４ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２ｐｒｏｔｅｉｎａｆｔｅｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＴＮＫＳ
２
图５ 各转染组ＴＮＫＳ２蛋白的表达
Ｆｉｇ．５ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＮＫＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐｓ
表７ ＴＮＫＳ２过表达逆转了ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ过表达对肝癌ＨｅｐＧ２细胞增殖、迁移、侵袭的作用 （珋ｘ±ｓ，ｎ＝１２）
Ｔａｂ．７ ＥｆｆｅｃｔｏｆｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｃｅｌ
ｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｔｈｅＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｗａｓｒｅｖｅｒｓｅｄｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ＴＮＫＳ２ （珋ｘ±ｓ，ｎ＝１２）ＧｒｏｕｐｓＴＮＫＳ２ｐｒｏｔｅｉｎＣｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（ＯＤ４９０
）２４ｈ４８ｈ７２ｈ
Ｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒｓｏｆ
ｍｉｇｒａｔｉｏｎＣｅｌｌｎｕｍｂｅｒｓｏｆｉｎｖａｓｉｏｎｍｉＲ－ＮＣ０．６４±０．０５０．４２±０．０４０．７５±０．０７１．１６±０．０９１１３．４６±１０．２７９１．２４±７．３５
ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ０．１９±０．０３
０．４０±０．０３０．４９±０．０５
０．６６±０．０６
５７．６５±５．３２
４６．３８±４．２９
ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ０．１８±０．０３０．３９±０．０４０．４７±０．０５
０．６２±０．０６
５３．４６±４．９３
４１．４９±３．７６ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ－ＴＮＫＳ２０．４７±０．０４＃０．３８±０．０３０．６５±０．０６＃０．９２±０．０８＃８２．６７±７．３６＃７３．６８±６．８４＃Ｆ４１０．５７６２．８００６３．５２６
１３９．７９７
１７２．６１９
１９８．０１３
Ｐ
０．０００
０．０５１
０．００００．００００．００００．０００
注：与ｍｉＲ－ＮＣ组比较， Ｐ＜０．０５；与ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡ组比较，＃Ｐ＜０．０５。 Ｎｏｔｅ： Ｐ＜
０．０５ｖｓｍｉＲ－ＮＣｇｒｏｕｐ．＃Ｐ＜０．０５ｖｓｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ＋ｐｃＤＮＡｇｒｏｕｐ．３ 讨论
近年来，越来越多的证据表明，ｍｉＲＮＡ在肿瘤的发生发
展过程中起着至关重要的作用［
１１］
。肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，很多的基因参与其中。ｍｉＲ－５２６ｂ是一种与妊娠相关的ｍｉＲＮＡ，位于染体１９ｑ１３．４２上。现有的研究表
明，ｍｉＲ－５２６ｂ在胃癌［６］、肺癌［７］、结肠癌［８］、肝癌［９］
及乳腺癌［
１０］
中都存在着异常表达，与肿瘤的发生发展有着密切的关系。例如，ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ可靶向作用于ＨＩＦ－１α抑制结肠癌细胞ＨＴ－２９的增殖和侵袭。在小细胞肺癌中，ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ可下调Ｋｕ８０抑制癌细胞的增殖。ＴＮＫＳ２端锚聚合酶是ＰＡＲＰ家族成员之一，广泛分布于人类细胞中，参与
端粒平衡［１２］、Ｗｎｔ通路［４］
等在细胞水平的调控。大量研究表明，在宫颈癌［１３］、结肠癌［１４］及三阴性乳腺癌［１０］等多种肿
瘤中，
ｍｉＲＮＡ通过正性或负性调控ＴＮＫＳ２的表达，调控肿瘤的发生发展［１５］。如在乳腺癌［１０］中，ｍｉＲ－４９０ｂ－３ｐ通过下
调ＴＮＫＳ２基因使乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力减弱。而在
宫颈癌［１３］
中，ｍｉＲ－２１０则通过上调ＴＮＫＳ２而促进宫颈癌细
胞的侵袭和迁移。ｍ
ｉＲ－５２６ｂ－３ｐ在肝癌中的作用已有报道［９］，但以ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ为肝癌靶点的理论依据还不
充足。
本研究以肝癌细胞Ｈ
ｅｐＧ２为研究对象，发现ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ低表达、ＴＮＫＳ２高表达。而ＭＡ等［１６］
在研究肝癌细胞
ＴＮＫＳ抑制剂与Ｗｎｔ的关系时发现肝癌细胞中ＴＮＫＳ２的高表达仅表现在ｍ
ＲＮＡ水平。肝癌细胞ＴＮＫＳ２蛋白表达差异有待于进一步研究。采用脂质体上调ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ表达，观察其对Ｈ
ｅｐＧ２细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果发现，ＨｅｐＧ２细胞的增殖、迁移和侵袭均明显受到抑制。提示，ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ在肝癌细胞的增殖和转移过程中发挥着重要作用。双荧光素酶报告基因检测实验结果发现，
ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ模拟物与ＴＮＫＳ２－ＷＴ共转染后，ＨｅｐＧ２细胞的荧光素酶活性明显降低；同时Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测也发现ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ可负向调控ＴＮＫＳ２表达。表明，ＴＮＫＳ２是ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ的
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９５７·现代肿瘤医学 ２０２１年０３月 第２９卷第０５期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｒ ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０５
