1、产物扩增长度建议：80-150bp
2、引物长度：17bp---25bp
3、 3’端尽量避免⾼GC或者AT含量⾼区域
4、 3’端最后⼀个碱基最好为G或者C，避免使⽤T
5、两个引物Tm最好相差不要超过1°C，Tm值在60°C—65°C为佳（使⽤Primer 5 设计）
6、引物GC含量控制在40%---60%之间
7、引物特异性检测(NCBI)
注：通常设计qPCR引物时会将引物设计在跨两个外显⼦，⽬的减少遗留DNA造成误差，但是有时候这样设计的引物不能满⾜以上条件，所以强烈建议提取RNA时使⽤gDNA酶处理，这样完全可以不考虑跨外显⼦。
举例：⼤⿏的MyD88序列ATGTCTGCGGGAGGCCCCCGCGTGGGATCCGTGTCCGTGGACTCCTAC
TTGTTCTCTCTA CCGTTGGTCGCGCTCAACGTGGGAGTGAGGCGCCGCCTCTCGCTGTTCTTGAACCCGCGG ACAACCGCGGCGGCCGACTGGACCTCGCTGGCGGAGGAGATGGGTTTCGAGTACTTGGAG ATCCGCGAGTTTGAGACGCGCCCCGATCCCACTCGCAGTTTGTTGGATGCCTGGCAGGGG CGCTCTGGCTCGTCGGTCGGCAGGCTGCTAGAGTTGCTAGCCTTGTTAGACCGTGAGGAT ATACTGTATGAACTGAAGGACCGCATCGAGGAGGACTGCCAGAAATACATACGCAACCAG CAGAAACAGGAGTCTGAGAAGCCCTTGCAGGTGGCCAGAGTGGAGAGCAGTGTCCCACAG ACAAAGGAACTGGGAGGCATCACCACCCTCGATGACCCCCTGGGGCAAACGCCGGAGCTT TTCGACGCCTTCATCTGCTACTGCCCCAGTGATATTGAGTTTGTGCAGGAGATGATCCGG CAACTAGAACAGACAGACTATCGGCTTAAATTGTGTGTGTCCGACCGCGATGTCCTGCCT GGCACCTGCGTGTGGTCCATCGCCAGCGAGCTCATTGAGAAAAGGTGTCGTCGCATGGTG GTGGTTGTTTCTGACGATTACCTGCAAAGTAAGGAATGTGACTTCCAGACCAAGTTTGCT CTCAGCCTGTCTCCAGGTGTCCAACAGAAGCGACTGATCCCTATCAAGTACAAAGCAATG AAGAAGGACTTTCCTAGTATCCTACGGTTCATCACTATCTGCGACTATACCAACCCTTGC ACCAAGTCCTGGTTCTGGACCCGTCTTGCCAAGGCTCTGTCCCTGCCCTGA
在prime.5⾥⾯点击search之后，修改参数，主要调节Tm和GC就⾏了
针刺事件
之后，选取打分较⾼的引物，如前五个：5‘---3’
1F：GTCGCATGGTGGTGGTTGTT 1R: TGATAGGGATCAGTCGCTTCTGT
网络狂飙2F：AAAGGTGTCGTCGCATGGTG 2R: GTGGTACGCTGCTGTGGAAA
3F：TCGTCGCATGGTGGTGGTT 3R：TGATAGGGATCAGTCGCTTCTGT
安塞县高级中学
4F：TCGGCAGGCTGCTAGAGTTG 4R：GTTTCTGCTGGTTGCGTATGTATTT
5F： AGGACTGCCAGAAATACATACGC 5R：CCTTTGTCTGTGGGACACTGCTC
按照以上7条总结：
为了不使3‘为T，所以使⽤2号和5号引物
最后检查引物特异性，通过NCBI 进⾏blast⽐对即可，⽬的是引物这个基因特有的。
⽐如2号引物检查在⼤⿏基因库⾥⾯只有88号基因有这⼀段序列（引物），所以完全满⾜qPCR引物设计条件。
惰政
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2F：AAAGGTGTCGTCGCATGGTG 2R: GTGGTACGCTGCTGTGGAAA
