酶的分离纯化过程重要注意的问题？在酶的分离纯化过程中为什么进行酶活力，酶比活力的测定？ 生物技术091 支慧俊 08014177
郝水酶的分离纯化
酶的分离纯化最主要是保持酶的活性，只要有可能引起酶变性失活的因素都应注意，温度，酸碱度，重金属等。生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 直通春晚第三场酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着每一步骤的取舍。
酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原
料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。在抽提过程中应该注意的问题。
1. 盐析
常用的盐析剂是硫酸铵，其溶解度大、价格便宜。硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。对酶没有破坏作用。
pH的控制：应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑，在酶等电点时其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等电点时稳定性较差，因此要选择最佳pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦确定最佳pH值后，在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的pH值，要尽量避免溶液pH值的波动以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸铵时要注意搅拌，并注意硫酸铵的加入速度，一般是由少到多，缓慢加入，硫酸铵尽可能磨成细粉。
温度的控制：有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下操作。
酶液的净置：加完硫酸铵后，酶液要静置一段时间，使酶蛋白完全沉淀下来，酶静置后，就不要再加以搅拌。
2．有机溶剂沉淀
有机溶剂选择：可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等，如甲醇、乙醇、异丙醇。乙醇的亲水性能较好，可防止蛋白质的变性，酶蛋白在其中的溶解度也较低。
有机溶剂沉淀操作：有机溶剂一般都使蛋白质变性，当温度较高时变性蛋白质分子就会变成永久失活。因此用有机溶剂处理时最好在0℃以下进行。用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久，要尽快加水溶解。
3.聚合物絮凝剂沉淀
聚合物絮凝剂，如葡聚糖和聚乙二醇，与酶分子争夺水分子，具有脱水作用使酶沉淀。聚
乙二醇作为一种沉淀剂的优点是在水溶液中，其浓度可达到50%，浓度为18惠6%-12%的蛋白质大都可以沉淀下来。这种试剂不需要低温操作，而且对蛋白质的稳定还有一定的保护作用。聚乙二醇不会被吸附，故在离子交换吸附前不必去除。
4．用金属离子和络合物沉淀
酶和其他蛋白质都会形成金属盐，其溶解度较低。用金属离子沉淀的缺点是酶与金属离子相互作用后，可逆变化较差，尤其是用巯基衍生物，它结合的]金属离子会催化酶变性而失活。
5．用特殊试剂沉淀法
用链霉素可选择性去除核酸，从而使胞内酶沉淀出来。链霉素盐（浓度为0.5-1.0mg/mg蛋白质）对于选择性沉淀核酸的效果比锰离子还要好，酶不易失活。
6．亲和沉淀
套期保值将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量、地选择性有机结合形成
了亲和沉淀技术。将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物，该复合物与生物分子结合后在一定条件下可以沉淀出来。
配基英国的资产阶级革命-载体复合物可以选择性地与蛋白质结合，溶液中的pH值、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合的影响力并不大，只有竞争性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力，甚至使亲和结合发生逆转。
引导产生沉淀的方法有：离子交联；加入带相反电荷的聚合物；加入带相反电荷的疏水基团；改变pH值，诱导产生疏水沉淀；温度诱导产生沉淀。
亲和结合：将亲和配基加入到含有目的物蛋白质的溶液中，调节好有关沉淀的条件，使之有利于亲和结合。
洗涤：为经过处理的粗制液中发生亲和沉淀可能会发生非特异性结合，尤其是使用带电的聚合物，离子交换的效应将使其他蛋白质共同沉淀，因此在分离目的物之前要洗涤沉淀物。其做法是：加入适当的清洗剂重新溶解沉淀，再沉淀；或在专一性洗脱之前，彻底清洗沉淀。在上述过程中要始终保持目的蛋白质与配基处于亲和结合状态。
配基-载体复合物与目的蛋白质的分离：分离结束之后，要确保回收目的蛋白质和配基-载体复合物，目的蛋白质要达到一定的纯度，回收率要高。
酶是一种特殊的蛋白质，在分离纯化过程中需要注意温度以及PH值等的控制，注意在纯化过程中所使用的缓冲溶液的离子强度的控制（常用PBS缓冲溶液），在实际纯化过程中，一般要在低温冰箱中进行，缓冲溶液中注意加入EDTA二钠盐（1-5mM）螯和重金属离子一般避免酶失活。常用分离步骤包括分子筛层析、离子交换、疏水层析等步骤。由于酶很不稳定，再提取时容易变性失活，因而提取时应注意温度，整个提纯操作应尽可能在低温下（0~4°C）进行，以防止酶的变性或者蛋白质水解酶对目的酶的水解。还要注意PH的控制,在提纯过程中一般采用缓冲液作为溶剂，防止过酸或者过碱。其次还有盐浓度，因为大多数蛋白质具有盐溶性质，所以在抽取过程中可选用合适浓度的盐浓液以促进蛋白质溶解。之后还要注意液体的搅拌，剧烈搅拌容易引起蛋白质变性，提纯应该避免剧烈搅拌和产生泡沫。最后还应该避免微生物污染，以防溶液的变质变性。因为在分离纯化过程中，有些酶会死亡，酶多多数是蛋白质，有少数是RNA，就是这个原因。
酶的纯化与活力测定
肾b超酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适. 单位是在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)。温度规定为25度，其他条件取反应的最适条件。测定一般采用测定酶促反应初速度的方法来测定活力，因为此时干扰因素较少，速度保持恒定。反应速度的单位是浓度/单位时间，可用底物减少或产物增加的量来表示。因为产物浓度从无到有，变化较大，而底物往往过量，其变化不易测准，所以多用产物来测定。
酶比活力：在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的
一个重要指标。
在酶学和酶工程的生产和研究中，经常需要进行酶活力的测定，以确定酶量的多少以及变化情况。酶活力测定是在一定条件下测定酶所催化的反应速度。在外界条件相同的情况下，反应速度越大，意味着酶的活力越高。
在酶的分离纯化过程中进行酶活力及酶比活力表测定（一般发表的文章有一个详细的酶活酶比活力表）的原因是：一方面，防止酶变性失活。一旦活力明显下降，就要考虑换一种纯化方法；另一方面，计算纯化效率。通过总活力和比活，评估纯化效率，寻最佳方法。
