第⼆讲沉淀分离技术2学时
※、通过本章学习应掌握的内容
1、什么是沉析？
绩效考核制度 老子2、沉析法纯化蛋⽩质的优点有哪些？
3、沉析的⼀般操作步骤是什么？
5、盐析操作时常⽤的盐是什么？
6、影响盐析的主要因素有哪些？
7、有机溶剂沉析法的原理是什么？
8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？
9、等电点沉析的⼯作原理是什么？
10、其它常⽤的沉析⽅法有哪些？
⼀、沉淀分离的⽬的及其⽅法
沉淀分离技术是经典的化学分离技术。沉淀的概念是指溶液中的介质在适当条件下由液相变成固相⽽析出的过程。 沉淀技术的⽬的包括两个：⑴通过沉淀使⽬标成分达到浓缩和去杂质的⽬的。当⽬标成分是以固相形式回收时，固液分离可除去留在溶液中的⾮必要成分；如果⽬标成分是以液相形式回收时，固液分离可使不必要的成分以沉淀形式去除。⑵通过沉淀可使已纯化的产品由液态变成固态，有利于保存和进⼀步的加⼯处理。
沉淀分离技术通常包括下列各种沉淀⽅法：
⑴⽆机沉淀剂沉淀分离法：通常是以盐类作为沉淀剂的⼀类沉淀⽅法，如盐
析法，多⽤于各种蛋⽩质和酶类的分离纯化，以及某些⾦属离⼦的去除。常
⽤的沉淀剂有：硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化纳等。
⑵有机沉淀剂沉淀分离法：以有机溶剂作为沉淀剂的⼀种沉淀分离⽅法，
多⽤于⽣物⼩分⼦、多糖及核酸类产品的分离；有时也⽤于蛋⽩质的沉淀和⾦属离⼦的去除；⽤于酶的沉淀分离时，易导致酶的失活。常⽤到的沉淀剂有：丙酮、⼄醇、甲醇等。
⑶⾮离⼦多聚体沉淀剂沉淀分离法：采⽤⾮离⼦型的多聚体作为⽬标成分的
沉淀剂，适⽤于⽣物⼤分⼦的沉淀分离，如酶、核酸、蛋⽩质、病毒、细菌等。典型的⾮离⼦型多聚体是聚⼄⼆醇（PEG），根据其相对分⼦量的⼤⼩，有PEG600、PEG4000、PEG20000等型号。
⑷等电点沉淀法：主要是利⽤两性电解质在等电点状态下的溶解度最低⽽沉 淀析出的原理。适⽤于氨基酸、蛋⽩质及其它属于两性电解质组分的沉淀分离，如⼤⾖蛋⽩“碱提酸沉”的提取⽅法。
葵花籽饼⑸共沉淀分离法：⼜可称为⽣物盐复合物沉淀法，⽤于多种化合物特别是⼀
些⼩分⼦物质的沉淀。它是利⽤沉淀的同时对其它待分离成份吸附共沉淀⽽达到除杂的⽬的。
⑹变性沉淀分离法：⼜称为选择性变性沉淀法，是利⽤特定条件使⽬标成分
变性，导致其性质的改变如溶解度下降⽽得以分离。适⽤于⼀些变性条件下差异较⼤的蛋⽩质和酶类的分离纯化。采取的变性条件有pH值、温度的改变以及添加剂、利⽤酶的作⽤等，腐⽵的⽣产是利⽤⼤⾖蛋⽩的热变性⽽进⾏分离的⼀个例⼦。
⼆、沉析的特点
操作简单、经济、浓缩倍数⾼，但针对复杂体系⽽⾔，分离度不⾼、选择性不强。
三、沉析操作的⼀般过程
1、在经过滤或离⼼后的样品中加⼊沉析剂；
2、沉淀物的陈化，促进晶体⽣长；
3、离⼼或过滤，收集沉淀物；
四、⽆机沉淀剂沉淀分离法
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⼀些⾦属离⼦的各种盐类形式，如硫酸盐、碳酸盐、草酸盐等，其溶解度都很⼩。所以，当添加适当的⽆机沉淀剂形成上述各种化合物时，便会形成沉淀，使⾦属离⼦得以分离；另外，⼤部分蛋⽩质等
⽣物⼤分⼦都可以通过在溶液中加⼊中性盐⽽沉淀析出，这⼀过程称为“盐析”。这节重点介绍盐析法。
2.1 盐析法
盐析分离法应⽤最早和最⼴泛的是在蛋⽩质和酶类的分离⼯作中，⽤盐析法分离蛋⽩质已有80多年的历史。由于其它分离技术的出现，盐析法在选择性⽅⾯显得有些不⾜，但是在粗提纯阶段，盐析法⾄今仍普遍得到应⽤。
2.1.1盐析原理
⾸先需要了解⽣物⼤分⼦在⽔溶液中的存在状态：
（1）两性电解质，由于静电⼒的作⽤，分⼦间相互排斥，形成稳定的分散系
（2）蛋⽩质周围形成⽔化膜，保护了蛋⽩质粒⼦，避免了相互碰撞
3、盐析过程
当中性盐加⼊蛋⽩质分散体系时可能出现以下两种情况：
（1）“盐溶”现象—在低盐浓度下，蛋⽩质和酶类的溶解度随着随着盐的浓度提⾼⽽增⼤，这个过程称为盐溶。这主要是中性盐离⼦对蛋⽩质分⼦表⾯活性基团及⽔活度的影响：
（a）⽆机盐离⼦在蛋⽩质表⾯上吸附，使颗粒带相同电荷⽽互相排斥。（b）⽆机盐离⼦增加了蛋⽩质的亲⽔性，改善了与⽔膜的结合，增加了蛋⽩质分⼦与溶剂分⼦相互的作⽤⼒，使蛋⽩质的溶解度增加。
（2）“盐析”现象—⾼盐浓度下，蛋⽩质溶解度随之下降，原因如下：（a）⽆机离⼦与蛋⽩质表⾯电荷中和，形成离⼦对，部分中和了蛋⽩质的电性，使蛋⽩质分⼦之间的排斥⼒减弱，从⽽能够相互靠拢；
（b）中性盐的亲⽔性⼤，使蛋⽩质脱去⽔化膜，疏⽔区暴露，由于疏⽔区的相互作⽤导致沉淀；
在盐析过程中，蛋⽩质的溶解度与溶液中盐的离⼦强度之间的关系可⽤Cohn表达式表⽰：
lg(S/S0) = - K s I
或lgS = lgS0 - K s I
式中：S0----蛋⽩质在纯⽔中（I=0）的溶解度；
S----蛋⽩质在离⼦强度为I的溶液中的溶解度；
K s----盐析常数；
I ----离⼦强度。
其中离⼦强度I=1/2∑Mz2, M表⽰溶液中各种离⼦的物质的量浓度，z为各种离⼦的价数。当温度⼀定时，对于某⼀溶质来说，其S0也是⼀常数，即lgS0 =β（截距常数），所以有lgS =β- K s I。β值的⼤⼩取决于溶质的性质，与温度和pH值有关。
K s 取决于盐的性质，并且与离⼦的价数、平均半径有关。⼀般来说，溶质的K s值越⼤，盐析的效果越好；同⼀溶液中，两种溶质的K s值相差越⼤，则
盐析的选择性就越好。
表2-1列举了⼀些蛋⽩质⽤不同的盐类进⾏盐析时的K s 值。⼀般来说，⾼价阴离⼦如硫酸根、磷酸根
等有较⾼的K s 值，⽽⾼价阳离⼦如镁离⼦、钙离⼦等，则会有较低的K s 值。⾄于蛋⽩质的性质与K s 值之间的关系，⽬前还没有明显的规律可寻，也没有适当的理论加以详述。
2.1.2盐析分离中盐的选择
在蛋⽩质的盐析中，以硫酸铵、硫酸钠应⽤最⼴。虽然磷酸盐的盐析效果⽐硫酸铵好，但硫酸铵的最⼤优点是温度系数⼩，温度的变化引起溶液性质的改变不⼤，且其溶解度⼤，应⽤于许多蛋⽩质和酶的盐析时，对蛋⽩质和酶变性的影响较⼩，并且硫酸铵价格低廉。硫酸铵⽤于蛋⽩质盐析时，最⼤的缺点是除了缓冲能⼒较⼩外，还由于含氮，影响蛋⽩质的定量分析，尤其是采⽤凯⽒定氮法和双缩脲法进⾏测定时。
硫酸钠由于不含氮，因此不影响蛋⽩质的定量测定，但其缺点是在30℃以下溶解度太低，需在30℃以上操作效果才好，不利于保持酶的活性。磷酸盐、柠檬酸钠等也⽤于蛋⽩质的盐析，但由于溶解度低，或容易与其它⾦属离⼦产⽣沉淀，或因酸性过强，都不如硫酸铵的应⽤那样⼴泛。
4、离⼦强度对盐析过程的影响
Cohn 经验公式
S —蛋⽩质溶解度，mol/L;
I —离⼦强度 c：离⼦浓度；Z ：离⼦化合价
β—盐浓度为0时，蛋⽩质溶解度的对数值。与蛋⽩质种类、温度、pH 值有关，与盐⽆关；
I
K S s -=βlog 22
1i i Z c I ∑=
Ks—盐析常数，与蛋⽩质和⽆机盐的种类有关，与温度、pH值⽆关。Ks盐析法：在⼀定pH和温度下，改变体系离⼦强度进⾏盐析的⽅法；
β盐析法：在⼀定离⼦强度下，改变pH和温度进⾏盐析；
其中，Ks盐析法由于蛋⽩质对离⼦强度的变化⾮常敏感，易产⽣共沉淀现象，因此常⽤于提取液的前处理。
⽽β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度⼩，因此分辨率更⾼，常⽤于初步的纯化。
5、盐析⽤盐的选择在相同离⼦强度下，盐的种类对蛋⽩质溶解度的影响有⼀定差异，⼀般的规律为：
半径⼩的⾼价离⼦的盐析作⽤较强，半径⼤的低价离⼦作⽤较弱
（Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁
选⽤盐析⽤盐的⼏点考虑：
（1）盐析作⽤要强
（2）盐析⽤盐需有较⼤的溶解度
（3）盐析⽤盐必须是惰性的
（4）来源丰富、经济
6、常⽤的盐析⽤盐
#硫酸铵：溶解度⼤（767g/L）
硫酸钠
磷酸盐
柠檬酸盐
7、影响盐析的因素
（1）溶质种类的影响：Ks和β值
（2）溶质浓度的影响：蛋⽩质浓度⼤，盐的⽤量⼩，但共沉作⽤明显，分辨率低；蛋⽩质浓度⼩，盐的⽤量⼤，分辨率⾼；
（4）pH值：影响蛋⽩质表⾯净电荷的数量，通常调整体系pH值，使其在pI附近；
（5）盐析温度：⼤多数情况下，⾼盐浓度下，温度升⾼，其溶解度反⽽下降；
⑴蛋⽩质浓度的影响
对溶液中各种蛋⽩质进⾏分步分离时，各种蛋⽩质浓度不同，硫酸铵的⽤量差别也较⼤。蛋⽩质浓度⾼时，盐的⽤量减少。但如果各种蛋⽩质的Ks值⽐较接近，则会发⽣⽐较严重的共沉作⽤，使盐析分离的选择性下降。蛋⽩质浓度过低时，盐的⽤量增⼤，但共沉作⽤较⼩，选择性较好。溶液中的蛋⽩质浓度为2.5%-3.0%时进⾏盐析，效果⽐较好。
⑵离⼦强度和离⼦类型的影响
对于同⼀类的蛋⽩质，随着溶液中离⼦的强度由低⽽⾼的变化，蛋⽩质也随之发⽣由盐溶⽽⾄盐析的变化过程。对于不同类型的蛋⽩质，盐析时所要求的离⼦强度各有不同。⽤盐析法分离多种蛋⽩质时，总是采⽤低的离⼦强度分离出⼀种蛋⽩质，然后再逐渐增加离⼦强度，分离出第⼆种、第三种乃⾄更多种蛋⽩质，这就是分步盐析法。运⽤此法时，各种蛋⽩质的Ks值差别越⼤，效果越好。
⑶不同离⼦类型对盐析效果的影响
通常认为离⼦半径⼩、带较⾼电荷的离⼦盐析效果较好；离⼦半径⼤，带低电荷的离⼦盐析效果差。如单价盐KCl、NaCl的盐析效果就较差。不同离⼦的这种差异，常⽤其对应于蛋⽩质的盐析常数Ks值的差别来表⽰，Ks值越⼤，盐析效果越好。各种盐类的Ks差别可⽤下列顺序表⽰：磷酸钾〉硫酸钠〉硫酸铵〉柠檬酸钠〉硫酸镁。
⑷pH值对盐析效果的影响
属于两性电解质的分⼦，如蛋⽩质、酶及氨基酸等，其溶解度与所带的电荷有关。当其分⼦所带的正负电荷为零时，分⼦处于等电状态，此时溶液的pH值即为该分⼦的等电点。处于等电点的两性分⼦，溶解度最⼩；偏离等电点的两性分⼦，溶解度较⼤。因此在盐析时，⼀般选择在两性分⼦的等电点处的pH值下进⾏，以获得最佳的盐析效果。
⑸温度的影响
在低离⼦强度下，蛋⽩质的溶解度随着温度的升⾼⽽增⼤；在⾼离⼦强度下，则随着温度的升⾼⽽下降。对于蛋⽩质来说，盐析对温度的要求不是很严格，通常是在常温下进⾏操作。但是对于酶类，由于其⼤部分对温度都⽐较敏感，因此对于酶类盐析时应在较低温度下操作，以最⼤限度地保持酶的活性。
2.1.4盐析后的脱盐处理
常⽤的脱盐处理有：透析法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法。这⾥简单介绍⼀下透析技术。
⼴义地说，透析也是⼀种膜分离技术。⽤于透析的膜是⼀种半透膜，即具有让⼩分⼦和⽔扩散⽽不断地通过，直到膜内外浓度达到平衡；⽽⼤分⼦则不能透过膜⽽被截留在膜内侧的⼀种膜。⽣物的细胞膜、⽺⽪纸、⽕棉胶、玻璃纸以及赛璐玢等即属于半透膜。⽤于透析的膜，必须具有如下特点：
⑴只允许⼩分⼦溶质和溶剂通过，⼤分⼦不能通过；
⑵具有化学惰性，与溶质不起化学作⽤，在⽔、盐、稀酸、碱中不溶解；
⑶有⼀定的机械强度和良好的再⽣性能。
透析的⽅法⽐较简单。实验室少量样品可放⼊做成的透析袋内，并留出⼀般左右的体积，然后扎紧袋
⼝，悬挂于盛有纯净溶剂的⼤容器内，即可透析。透析过程中通过搅拌和不断更新新鲜溶剂，可⼤⼤提⾼透析效果。
在日朝鲜人2.1.5硫酸铵饱和度的调整⽅法
⑴硫酸铵使⽤前的预处理
⽤⼀般⽣化⼯业制备的硫酸铵即可，如果待盐析的蛋⽩质和酶的活性中⼼含巯基，如菠萝蛋⽩酶和⽊⽠蛋⽩酶等属于巯基蛋⽩酶类的制品，则需预处理，去除硫酸铵中的重⾦属离⼦，以消除其对酶活性的影响。⽅法是将硫酸铵配成浓溶液，然后通⼊H
2
S ⽓体⾄饱和。放臵过夜后⽤滤纸滤除重⾦属沉淀物，滤液在瓷蒸发器中浓缩结晶，再在100℃下⼲燥即可使⽤。
⑵硫酸铵饱和度的调整
①当盐析要求饱和度⾼⽽⼜不宜增⼤溶液的体积时，可直接加⼊硫酸铵的固体盐，不同的饱和度应加⼊的硫酸铵⽤量可查阅相关的分析⼿册。②当盐析要求的饱和度不⾼，⼜必须防⽌局部浓度过⾼时，通常是采⽤加⼊饱和硫酸铵溶液法。
盐析时要求的饱和度以及所需加⼊饱和硫酸铵溶液体积的计算如下：
V=V
0(S
2
-S
1
)/(1-S
和岳姆干的翻天覆地
2
)
式中：V----需加⼊饱和硫酸铵溶液的体积；
V
-
---待盐析溶液的体积；
S
1
----原来溶液的硫酸铵饱和度（第⼀次盐析时通常为0）；
S
2
----需达到的硫酸铵饱和度。
25o C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度
2.1.3影响盐析效果的因素
2.3有机沉淀剂沉淀分离法
1、概念：在含有溶质的⽔溶液中加⼊⼀定量亲⽔的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。
2原理：
（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引⼒增加，从⽽出现聚集现象，导致沉淀。
（2）由于有机溶剂的⽔合作⽤，降低了⾃由⽔的浓度，降低了亲⽔溶质表⾯⽔化层的厚度，降低了亲⽔性，导致脱⽔凝聚。
3、常⽤的有机溶剂沉析剂
⑴沉淀⾦属离⼦的有机沉淀剂：主要包括⽣成螯合物的有机沉淀剂、⽣成离
⼦缔合物的有机沉淀剂以及⽣成三元络合物的有机沉淀剂。
⑵沉淀有机成分的有机沉淀剂：可以沉淀⽔溶液中氨基酸、蛋⽩质、酶、核
酸、多糖、果胶以及其它⽣化⼩分⼦的沉淀剂包括：⼄醇、甲醇、丙酮、⼆甲基甲酰胺、⼆甲基亚砜、⼄腈、异丙醇等，其中最常⽤的是⼄醇和丙酮。
赫尔利V=V
