【实验目的】
1. 了解重组工程菌发酵培养、诱导表达重组门冬酰胺酶II的原理。
3. 掌握重组质粒的鉴定方法
【实验原理】
盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度
降低而析出的过程。如：加浓（NH4）2SO4使蛋白质凝聚的过程；在乙酸的酯化反应中加入饱和碳酸钠溶液，降低乙酸乙酯溶解度，使其分层现象更明显的过程。向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析，是物理变化，可复原。向某些蛋白质溶液中加入某些重金属盐，可以使蛋白质性质发生改变而凝聚，进而从溶液中析出，这种作用叫作变性，性质改变，是化学反应，无法复原。
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。原理是：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
【实验材料】
1. 试剂
LB液体培养基
硫酸铵
破壁液：45%蔗糖，10 mmol/L EDTA，200mg/L溶菌酶，pH 7.5
醋酸钠缓冲液（pH 5.6）
2．器材
微量移液器
磁力搅拌器
酸度计
旋涡混合器
超声波破碎仪
【实验方法】
1 破碎细胞
1.1细菌的培养
用于蛋白分离纯化的重组菌所含质粒是pET22b-AnsB。
发酵条件：
1、 种子菌培养：从甘油管中取400 µl菌液接种到50ml LB液体培养基中（含Kanamycin 50 µg/ml ），37℃摇床中（150 rpm）培养12h。
2、 取10 ml种子液体，接入到装有200 ml玉米浆质培养液的500 ml利率汇率三角瓶中，25 ℃摇床中（150 rpm）培养4h后，加入乳糖至终浓度为10 mmol/L（200ml 中加入4ml 0.5mol/L的乳糖），培养过夜。
3、 在4 ℃下，6000 rpm离心15min收集菌体。
1.2超声波破碎
取用刘振江昌平1g菌体，用20 ml 20mmol/L 的醋酸钠缓冲液（pH 5.6）重悬。
超声破碎条件：
1、 冰浴破碎20min每破碎15 S后暂停陕西黄土崩塌灾害30 S，功率400W。
2、 为使液体温度不至于过高，破碎的全部过程，含有细胞悬液的离心管应置于冰水混合物中。
3、 6000 rpm离心15min，取上清液作为粗酶提取液。
超声破碎后分别测定粗酶提取液和沉淀的活性，确定蛋白是否形成包涵体。
留样1m用于蛋白含量、酶活性及SDS-PAGE电泳分析。
2. 蛋白质粗提取（硫酸铵分级沉淀第一次）
加入缓冲液，将酶提取液的体积放大至50ml，在酶提取液中加入18.1g硫酸铵至55%饱和度，调pH至7.0，冰水浴磁力搅拌60 min，4 ℃沉淀3h
3. 硫酸铵分级沉淀第二次
超灵1、 将第一次硫酸铵分级沉淀的产物6000 rpm离心20 min除去沉淀。
2、 再在上清液中加入13.6 g硫酸铵至90 %饱和度，调pH至等电点附近（约 pH 5.0），搅拌60 min，4 ℃静置过夜， 6000 rpm离心30 min，收集沉淀冻存。
上清留样，4个样品显活性检测。
【思考题】
1. 克痢痧导致重组质粒PCR小鸡对话结果为阴性的原因有哪些？
2. 两次硫酸铵沉淀的目的分别是什么？
