动物医学进展,021,42(6)=14-18
Progress in Veterinary Medicine
韩水仲|,A，陈凌燕l,A，白晨雨12，王同燕12，黄玉欣12，宋欢欢12,
张浩浩12，石晶3，邓均华12*，田克恭12*
（.国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳471000;2.普莱柯生物工程股份有限公司，河南洛阳471000；
3.长春西诺生物科技有限公司，吉林长春130000）
摘要：为研究兔出血症病毒（RHDV）VP60蛋白形成的病毒样颗粒联合多杀性巴氏杆菌（Pm）、产气荚膜梭菌（Cp）的免疫效果，将3种抗原与铝胶佐剂混合制成三联灭活疫苗，进行安全检验、最小免疫剂量测定及免疫持续期研究。结果表明,3批疫苗以4.0mI/只免疫兔未见任何不良反应；对兔的最小免疫剂量为1.0mI/只，免疫后14日，血清RHDV HI效价为1：16〜1：64，攻毒后免疫兔均健活（5/5）；免疫后21d，用Pm和C p分别攻毒，免疫兔80%以上（4/5〜5/5）保护；免疫持续期可达210d.RHDV VP60 蛋白形成的病毒样颗粒可与Pm、Cp联合制备疫苗，解决了传统RHDV组织灭活苗生产过程存在的生物安全风险问题，同时实现了一针三防.
关键词：兔出血症病毒;VP60蛋白病毒样颗粒；多杀性巴氏杆菌；产气荚膜梭菌；灭活疫苗
中图分类号:S852.52；S858.291
兔病毒性出血症（Rabbit hemorrhagic disease, RHD）、巴氏杆菌病（Paseurellosis）及产气荚膜梭菌病{Clostridium perferingens disease）是危害养兔业最严重的3种急性传染病,3种病的病原分别为兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）和A型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,Cp）.目前，预防上述3种传染病主要依靠疫苗免疫。由于缺乏培养兔出血症病毒的敏感细胞系，传统上，RHD的预防主要依靠组织灭活疫苗[1].但是,RHDV组织灭活疫苗生产具有以下缺陷：首先，组织灭活疫苗的生产需要使用未接种疫苗的敏感兔，而敏感兔不易获得且质量具有不确定性；其次，疫苗生产需使用RHDV强毒感染兔，需要配备负压动物房以及专门的GMP生产线，不利于大规模生产且存在潜在的生物安全风险；再者，由于用兔增殖活毒，存在动物伦理与福利问题。近年来，随着生物技术的发展，通过基因工程手段构建可表达有效蛋白以用于动物疫病预防的亚单位疫苗产品逐渐增多，相对于传统疫苗，亚单位疫苗具有生产成本低，有效抗原含量高等优点。因此，用基因工程技术研发RHD亚单位疫苗成为趋势。目前国内文献标识码：A文章编号：1007-5038（2021）06-0014-05 经批准的利用重组VP60蛋白预防RHDV的疫苗有江苏省农业科学院兽医研究所开发的“兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗（BAC-VP60株）”产品及普莱柯生物工程股份有限公司开发的“兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗（RHDV-VP60株）”，但将其与多杀性巴氏杆菌和产气荚膜梭菌联合制备三联疫苗用于预防传染病尚未见相关报道。本研究主要利用构建的表达RHDV VP60蛋白病毒样颗粒及实验室分离鉴定的A型多杀性巴氏杆菌SC0512株及A型产气荚膜梭菌IY株制备三联灭活疫苗并对其进行安全性及免疫效力评价，拟解决传统RHDV组织灭活苗生产过程存在的生物安全风险问题，实现29一针三防。
1材料与方法
1.材料
1.1.1菌株和毒株表达兔出血症病毒VP60蛋白
病毒样颗粒的重组杆状病毒RHDV-VP60株、兔多杀性巴氏杆菌（A型）SC0512株、兔产气荚膜梭菌（A型）IY株、兔出血症病毒强毒HN株，国家兽用药品工程技术研究中心鉴定和保存。
1.1.2主要试剂SF-SFM昆虫细胞无血清培养
收稿日期=2020-02-29
基金项目：郑洛新国家自主创新示范区首批创新引领型产业集专项（181200211700）；洛阳市河洛英才计划项目（新型兽用生物制品研发及产业化）
作者简介：韩水仲（1985—），男，河南灵宝人，硕士，主要从事动物疫苗研究；陈凌燕（1982—），女，河南洛阳人，学士，主要从事动物疫苗和诊断试剂研究.△同等贡献作者*通讯作者
韩水仲等：含兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的兔三联灭活疫苗的研究l5
基，沃美生物公司产品；改良马丁培养基、酪蛋白胨、酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限公司产品；甲醛，国药集团化学试剂有限公司产品；硫柳汞钠，上海沪丰生物科技有限公司产品。
l.l.3实验动物l.5kg〜3.0kg健康易感兔，RHDV HI抗体效价低于l:4，购自河南省康达实验动物有限公司；l6g~20g Balb/c小白鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司。
波纹板
l.l.4主要仪器生物反应器(Celligen ll5)，美国NBS公司产品；发酵罐(l0JS700()C)，上海保兴生物设备工程有限公司产品。
1.2方法
l.2.重组VP60蛋白病毒样颗粒的制备将重组杆状病毒RHDV-VP60株按MOI=l的剂量接种在生物反应器
中长至2.0Xl(0个/mL〜2.5Xl(0个/mL 的Sf9细胞，培养条件为27°C、80/min.DO50%、pH6.5。培养96h后，收获细胞培养物，冻融后，离心去除细胞碎片，取样测定其对l%人O型红细胞的血凝效价，其余加入终浓度为0.5g/L的甲醛溶液，充分混匀，37C灭活24h，测定灭活抗原的血凝效价。
1.2.2兔多杀性巴氏杆菌菌液的制备将兔多杀性巴氏杆菌SC05l2株种子液按培养基总量的l%〜2%接入，37C、pH7.0、DO20%~30%条件下，采取流加补料法发酵培养l8h~24h，收获菌液，取样进行活菌计数，其余加入终浓度为15g/L甲醛，充分混匀，37C灭活24h.
1.2.3兔产气荚膜梭菌菌液的制备兔产气荚膜梭菌(A型)LY株按培养基总量的2.5%〜5%接入, 37C、pH7.0、通入氮气保压0.0l MPa、转速l00r/min条件下，采取手动补糖法发酵培养4h~ 5h，收获菌液，取样进行毒素含量测定，其余加入终浓度为0.5g/L的甲醛溶液，充分混匀，37C灭活脱毒72h.毒素含量用小鼠测定，将收获的菌液离心过滤后，滤液用明胶缓冲液做不同梯度稀释，分别接种小鼠，观察24h，根据小鼠死亡情况计算毒素含量.
l.2.4三联灭活疫苗的制备按上述方法共制备3批抗原，并按下述方法混合后制备3批疫苗。用PBS (0.015mol/L,p H7.0)将重组兔出血症病毒VP60蛋白液分别稀释至血凝效价为l:23兔多杀性巴氏杆菌SC0512株菌液稀释至l.0Xl00CFU/mL，兔产气荚膜梭菌(A型)LY株菌液稀释至200个小鼠MID/mL，然后分别按3:ll:l0进行混合。将上述抗原混悬液与氢氧化铝胶按4:l的体积比混合，同时按总量的(门g/L加
入硫柳汞，充分搅拌混匀。l.2.5三联苗的安全检验将3批疫苗分别经皮下途径接种5只健康易感兔，4.0mL/只，接种后观察l4d，每日观察兔的精神、采食、饮水、粪便、体温等。l.2.6三联苗的最小免疫剂量测定将3批疫苗分别以0.5mL/只、l.0mL/只、2.0mL/只剂量经皮下途径注射l.5kg〜3.0kg的健康易感兔，每个剂量免疫l5只，同时设l5只不免疫作为攻毒对照.
l..
.兔出血症病毒HI抗体效价测定及攻毒
免疫后l4d，所有兔均通过耳缘静脉采血，分离血清，使用8个血凝单位抗原测定血清中抗兔出血症病毒HI抗体效价.将免疫兔及对照兔采血后转至负压强毒区，各皮下注射兔病毒性出血症病毒HN 株l.0mL(含l000LD5())，攻毒后观察7d，统计各组兔的死亡率.
l.2.6.2兔多杀性巴氏杆菌攻毒免疫后2ld，取各剂量免疫兔及对照兔各5只转至负压强毒区，每只经皮下接种兔多杀性巴氏杆菌菌液l mL(含3~l0CFU/mL)，攻毒后观察l0d，统计各组兔的死亡率.
l.2.6.3兔产气荚膜梭菌攻毒免疫后2ld，取各剂量免疫兔及对照兔各5只，每只经耳缘静脉注射l个致死剂量的兔产气荚膜梭菌毒素，攻毒后观察7日，统计各组兔的死亡率.
l.2.7三联苗的免疫持续期试验将3批疫苗以2.0mL/只经颈背部皮下注射l.5kg〜3.0kg的健康易感兔，分
别于免疫后0d、l4d、2l d、30d、90d、l80d、210d时，选择5只免疫兔连同对照兔采血，用8个血凝单位抗原检测其血清中抗兔出血症病毒HI抗体效价，同时分别用兔出血症病毒、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌毒素攻毒，统计攻毒保护情况.
2结果
2.l三联苗的制备
用重组杆状病毒RHDV-VP60株制备的3批重组VP60蛋白液对l%人O型红细胞的HA效价为l:28〜l:29，灭活后HA效价为l:2l7〜l:28。将蛋白和菌液灭活并检验合格后，添加20%铝胶佐剂混合均匀制备疫苗，共制备3批疫苗，批号20l3120l〜20131203。
2.2三联苗的安全检验
将3批疫苗分别经颈背部皮下超剂量接种l.5kg〜3.0kg的健康易感家兔5只，4.0mL/只。接种后观察l4d，接种兔精神、采食、饮水、粪便、体温均无异常.
16
动物医学进展2021年 第42卷 第6期（总第336期）
2.3三联苗最小免疫剂量测定免疫后14日，0.5 mI/只剂量组免疫兔血清
RHDV HI 抗体效价为1 : 8〜1 : 32,1.0 mI/只剂
量组为1 : 16〜1 : 64,2.0 mI/只剂量组为1 : 32〜
2012山东文综1 : 128（见图1）；免疫后14 d，用兔出血症病毒HN
株攻毒，对照兔全部（5/5）死亡，0.5 mI/只剂量免疫 组保护率60%〜80% （3/5〜4/5）, 1.0 mI/只和
2.0 mI/只剂量免疫组保护率100%（5/5）。免疫后
21 d，用兔多杀性巴氏杆菌攻毒，对照兔全部（5/5）
表1
Table1 Protection rates of rabbits immunized with three batches of vaccine after challenge
3批疫苗不同剂量免疫兔攻毒保护结果
批号
Batch 攻毒株及剂量
Cha l engestrainanddose
0.5 mI / 只0.5 mIeach
1.0 mI/ 只1.0 mIeach
2.0 mI/ 只2.0 mIeach
对照
Control
2013120120131202兔出血症病毒HN 株，1 000 ID 5（.>/只
4/55/55/54/55/55/50/5
RHDV HN strain , 1 000 II )50 each
20131203
3/5
5/55/5201312013/55/55/520131202兔多杀性巴氏杆菌SC0512株，5 CFU/只
3/54/5
5/50/5Pm SC0512strain 5CFUeach
20131203
韩松物流4/55/55/5201312013/55/55/520131202兔产气荚膜梭菌IY 株毒素,1个兔致死剂量/只
2/55/55/50/5CpIYstrain onerabbitlethaldoseeach
20131203
2/5
4/5
5/5
注：分子表示存活数，分母表示总数。
Note ：Thenumeratorrepresentsthesurvivalnumber ,andthedenominatorrepresentsthetotal.
8765
■ 20131201 o 20131202 a 20131203▼ Blank
1
Blank 0.5 ml/只 1.0ml/只 2.0ml/只
图1不同剂量免疫兔免疫14 d 时血清中抗兔出血症病毒
HI 抗体效价
Fig.1 Hemagglutination inhibition antibody titers of rabbits
immunized with vaccine in di f erent doses on 14 days
postimmunization
2.4三联苗免疫持续期疫苗免疫后不同时间测定兔血清中抗兔出血症 病毒HI 抗体效价，免疫后14 d，血清HI 效价为
1 : 16~1 : 64；免疫后30 d，血清HI 效价达到 1 : 64~1 : 512，至免疫后210 d，血清HI 效价为 1 : 16〜1 ： 32（见图2）。免疫后210 d 攻毒，兔出血
症病毒HN 株攻毒，对照兔80%（4/5）死亡，免疫兔 全部（5/5）健活；用兔多杀性巴氏杆菌SC0512株和 兔产气荚膜梭菌IY 株毒素攻毒，对照兔全部（5/5） 死亡，免疫兔保护率80%（4/5）（见表2）。
3讨论
目前用于重组蛋白生产的表达系统主要有大肠
死亡，0.5 mI/只剂量免疫组保护率60%〜80%
（3/5〜4/5）,1.0 mI/只剂量免疫组保护率80%〜 100%（4/5〜5/5）,2.0 mI/只剂量免疫组保护率
皖南医学院学报
100%（5/5）；免疫后21 d，用兔产气荚膜梭菌毒素攻
毒，对照兔全部（5/5）死亡，0.5 mI/只剂量免疫组保
护率40%〜60% （2/5〜3/5）, 1.0 mI/只剂量免疫
组保护率80%〜100%（4/5〜5/5）,2.0 mI/只剂量 免疫组保护率100%（5/5）（见表1）
埃希氏菌、酵母、杆状病毒表达系统等。国内外有报
道使用上述三种表达系统分别表达兔出血症病毒
VP60蛋白均取得良好的免疫保护效果［山］。本研
究选择杆状病毒表达系统用于兔出血症病毒抗原的 生产。相对于酵母和杆状病毒真核表达系统，用原
核表达系统表达的重组蛋白缺少糖基化、翻译后修
饰等，使重组表达蛋白在生物活性上存在缺陷，表达
的蛋白易出现包涵体［0］。虽然有报道将兔出血症 病毒VP60基因与-半乳糖苷酶、SUMO 等共表达
可促进可溶性表达，但去除该标签需经过酶切和纯 化，不利于大规模生产23］。用酵母表达重组蛋白,
其表达的蛋白可组装成病毒粒子，免疫原性良好，兔
免疫后可抵抗兔出血症病毒的感染，但由于成本等
原因，在兽用生物制品应用较少。用杆状病毒表达 重组蛋白，重组蛋白可溶性表达，蛋白活性高，更加
便于产业化，且在兽医上已开发出相应的亚单位疫
苗用于猪瘟、猪圆环病毒病等的预防。国内外有报 道用杆状病毒表达重组VP60蛋白，但可能由于病
热力迸发毒株或表达系统不同，出现重组蛋白未形成病毒样 颗粒［］。本研究所用的重组杆状病毒RHDV-VP60
株表达的VP60蛋白在细胞内可折叠成病毒样颗 粒，电镜下观察，其形态同天然病毒相似，可最大限
度保持天然病毒的生物活性（未发表资料）杆状病
毒表达的重组蛋白产量较低，是制约其规模化应用
韩水仲等：含兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的兔三联灭活疫苗的研究
17
的原因之一［］。通过重组杆状病毒感染家蚕，将家 蚕处理后获得重组蛋白虽然产量高，但可能存在质
量控制等问题，目前还未见规模化生产［，，2］。国内 有报道构建的重组杆状病毒表达的VP60蛋白含量
为1 : 212〜1 : 213［1，3］。本研究所用重组杆状病毒 表达的VP60蛋白含量不低于1 : 28与文献报道
相比，表达量至少提高了 32倍，且免疫效果良好，节
约了生产成本，便于规模化生产。
表2疫苗免疫后不同时间攻毒保护结果
Table 2 Protection rates of rabbits immunized with vaccine
aftercha l engeindi f erentdayspostimmunization
攻毒时间（日） （免后天数）
Dayspost
immunization
兔出血症病毒（RHDV ）兔多杀性巴氏杆菌（Pm ）兔产气荚膜梭菌（Cp ）免疫组
Immunization
对照组
Control 免疫组
Immunization
对照组
Control
免疫组
Immunization
对照组
Control 14
5/50/5
4/50/52/50/521
5/51/55/50/55/50/5305/50/55/50/55/50/5905/50/5
5/50/55/50/5180
5/51/55/5
0/55/5
0/5210
5/5
1/5
4/50/5
4/5
0/5
注：分子表示存活数，分母表示总数。
Note ：Thenumeratorrepresentsthesurvivalnumber ，andthedenominatorrepresentsthetotal.
口］
参考文献：
王永坤，吉传义，周阳生，等.家兔一种新的病毒病-兔瘟的
研究［J ］.中国农业科学,1988,21 （5） =73-79.
BOGA JA,CASAIS R, MARIN MS,et. al. Molecular cloning, sequencing and expression in Escherichia coii of the capsid proteingenefromrabbithaemorrhagicdiseasevirus (Spanish isolate AST/89)[J].J Gen Virol ，1994，75 (9)：2409-2413.
系统平台开发评估
GUO H ，ZHU J ，TAN Y ，etal.Self-assembly ofvirus-lke particlesofrabbithemorrhagicdiseaseviruscapsidproteinex-pressed in Escherichia coii and their immunogenicity in
rabbts [J ].AntvirRes ，2016，131：85-91.
图2 3批疫苗免疫后不同时间兔血清抗兔出血症病毒
[4]FARNOS O ，BOUE O ，PARRA F ，etal.High-levelexpression
HI 抗体效价
and immunogenic properties of the recombinant rabbit
Fig 2
Hemagglutination inhibition antibody titers of rabbits
immunized with vaccine in di ferent doses on14 days
postimmunization
兔产气荚膜梭菌疫苗的保护效果与其疫苗中类 毒素的含量呈正相关［4］。用产气荚膜梭菌类毒素 制备的疫苗免疫动物也可获得良好的保护效果［5。
虽然通过浓缩可提高毒素含量，但这无疑增加了企 业生产成本［-17］。为提高发酵菌液中毒素的含量, 适宜的培养基及培养条件至关重要。本研究通过系 列筛选，筛选出一种适宜产气荚膜梭菌LY 株生长 的培养基，收获的发酵菌液中，其毒素含量不低于
400 MLD/mL，显著高于《中华人民共和国兽用生
物制品规程》（2000年版）及其他研究者报道［-8］。
总之，本研究开发的兔三联灭活疫苗生产成本 低，易规模化生产，免疫效果确实，解决了传统
RHDV 组织灭活苗生产过程存在的生物安全风险
问题，同时实现了一针三防。
[5][6]
[7]hemorrhagicdisease virus VP60 capsid protein obtainedin Pichia pati [J].J Biotechnol ,005,117(3) ：21 5-224.
LAURENT S, VAUTHEROT JF,MADELAINE MF, et al.
Recombinantrabbithemorrhagicdiseaseviruscapsidprotein
expressedinbaculovirusself-assemblesintoviruslikeparticles andinducesprotection [J ].JVirol ，1994，68(10)6794-6798.
MARIN MS ，MARTIN ALONSO JM ， et al.Immunogenic
properties of rabbit haemorrhagic disease virus structural
protein VP60expressedbyarecombinantbaculovirus ：ane f i-cientvaccine [J ].VirusRes ，1995，39(2-3)：119-128.
MULLER C, ULRICH R , FRANZKE K , et al. Crude extracts of recombinant baculovirus expressing rabbit hemorrhagic disease virus 2 VLPs from both insect, and rabbit, cells protect
rabbitsfrom rabbithemorrhagicdiseasecaused by RHDV2
[J].Ach Viol,019,64(1) ：137-148.
NAGESHA HS ，WANG LF ，HYATT AD ，etal.Self-assem bly ，antigenicity ，andimmunogenicity of the rabbit haemor-
rhagicdisease virus (Czechoslovakian strain V-351)capsid
proteinexpressedinbaculovirus [J ].ArchVirol ，1995，140(6)：
1095-1108.
PEREZ-FILGUEIRA DM ，RESINO-TALAVAN P ，
CUBIL-
l8动物医学进展202l年第42卷第6期(总第336期)
LOS C,et al.Development of a low-cost,insect larvae-derived recombinant subunit vaccine against RHDV[].Virology,
2007,364(2)：422-430.
[0]YAN WW,CUI ZZ/WANG YK：Expression of capsid gene of
Chinese isolate of rabbit hemorrhagic disease virus in Pichia
pastoris'JJ].Sheng Wu G()ng Cheng Xue Bao.2005.2l(l)：
l35-l38.
[1]王芳，胡波，壬雪枫，等.兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细
胞中的表达及对家兔的免疫保护效果[].畜牧兽医学报,
2008,39(l0)：l382-l387.
[2]ZHENG X,WANG S,ZHANG Wet a Z.Development of a
VLP-based vaccine in silkworm pupae against rabbit
hemorrhagicdisease virus[J].Intimmunopharmacol,20l6,
40：l64-l69.
[3]严维巍，崔治中，王永坤.在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样
颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋白[].病毒学报，2004,20(4)：
333-337
[4]刘洪斌，孙德君，白同臣，等.A型产气荚膜梭菌灭活疫苗类毒
素含量与疫苗攻毒保护率之间的平行关系研究[]•中国兽药
杂志,009,3(9):24-25.
[5]马连营，郭梦娇，吴发浩，等.E型产气荚膜梭菌的外毒素致病
性及其类毒素疫苗免疫效果[].中国兽医学报,019,9()：
63-68.
[6]徐为中，薛家宾，诸玉梅，等.家兔产气荚膜梭菌(A)型疫苗超
纳滤膜浓缩工艺研究[].西北农林科技大学学报(自然科学
版),2007,35(5):39-42.
[7]朱良全，李聪研，蒋玉文，等.A型产气荚膜梭菌合成培养基使
用参数及培养毒素浓缩工艺研究[J].中国兽药杂志,2012,47
(9)：34-37.
[8]余华，程跃红，邓小红，等.A型产气荚膜毒素培养工艺研究
[]•湖北农业科学,009,8(9)：22ll22l4.
Study on Trivalent Inactived Rabbit Vaccine Containing
RHDV VP60Protein Virus-like Particles
HAN Shui-zhong l，,CHEN Ling-yan l2,BAI Chen-yu1'2,WANG Tong-yan l，,
HUANG Y u-xin l，,SONG Huan-huan l'2,ZHANG Hao-hao1'2,SHI Ji ng3,
DENG Jun-hua1-2,TIAN Ke-gong1，
(1.National Research Center for Veterinary Medicine,Henan Luoyang471003. Chia;
2.Pulike Biological Engineering,Inc,Henan Luoyang47100
3.Chia;
3.C hangchun Sino Biotechnology Company Limited,JHin Chang chun130012)
Abstract：To evaluate the immunity efficiency of rabbit,hemorrhagic disease virus-like particles(VP60 protein)combined with multocida PaseureLLa and Clostridium perferingens type A-rabbits were immunized with three batches of the inactived vaccine.The optimal usage,safety and duration of the vaccine were investigated further.Results showed that,the optimal immune dose of the vaccine was1mL per rabbit.The RHDV serum hemagglutination inhibition titers of rabbits immunized with the vaccine could reach to1:16-1:64on14days post,immunization and rabbits could confer protection(RHDV5/5, Pm5/5,CP4/5)after challenge.No adverse reactions were observed on rabbits immunized with4mL vaccine.Duration of the vaccine was210days for the protection of rabbits against.RHDV,Pm and CP.The developed vaccine was safety and effective.
Key words:Rabbit,hemorrhagic disease virus;VP60protein VLP;multocida PaseureLLa;Clostridium perferingens;inactived vaccine
