动物医学进展,2011,32(6):174-178
Pr ogress in Veterinary Medicine
智海东1,2，王云峰1，陈洪岩1,2
(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001;
2.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江哈尔滨150069)
摘要：基因工程疫苗的研究发展日新月异，已从理论研究进入到实际生产应用，成为生物制品产业发展的一种趋势。近年来我国在兽用基因工程疫苗研发领域取得了很大进展，一些亚单位、活载体、基因缺失以及采用反向遗传操作技术制备的禽流感疫苗等兽用基因工程疫苗已经商品化，论文对我国兽用基因工程疫苗研发现状进行综述并提出相应发展策略。
关键词：兽用基因工程疫苗；亚单位疫苗；基因缺失疫苗；活载体疫苗；反向遗传操作技术
中图分类号:S852.5文献标识码:B文章编号:1007-5038(2011)06-0174-04
兽用生物制品对我国畜牧业的发展起着重要的作用，动物疫苗的使用极大程度地保证了畜牧业的健康发展[1]。但随着集约化养殖规模的扩大和新疫病的不断出现，现有的常规疫苗已经不能满足畜牧业发展的需要，与此同时一些以基因工程手段研制的基因工程疫苗逐渐进入市场应用领域。近年来我
收稿日期:2011-03-29
城市分区规划作者简介：智海东(1972-)，男，博士，副研究员，从事兽用生物制品研发工作。
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(Colleg e of Vete rinary M ed icine,S outh China A g riculture Univ er sity,Guang z hou,Guang dong,510642,China) Abstract:T cell deficiencies have been associated w ith thymic atro phy and often occur in infections,autoim-m une diseases,chem o/radio therapy as w ell as aging of the imm une sy stem.Currently,several strateg ies fo r reversal of thy mic atro phy and T cell reco nstitutio n are being tested in the clinic,such as,using inter-leukin-7,interleukin-15,interleukin-12,keratino cyte grow th factor,grow th ho rmone,ghrelin,Flt3L, sex hor mone inhibitors and T-cell precurso rs etc.In this paper,the effects of these factors on T cell im mune reconstitution w ere review ed.
Key words:T cell;IL-7;KGF;GH;sex horm one
国在兽用生物制品研发领域发展迅速，一些兽用基因工程疫苗通过注册，这为我国动物疫苗产业注入了新的生机和活力。本文对我国兽用基因工程疫苗研发现状进行综述并提出相应发展策略。
1我国兽用基因工程疫苗研发现状
基因工程疫苗是于20世纪80年代随着现代生物学技术的兴起，特别是DNA重组技术出现而出现的一类新型疫苗的总称[2]。在我国一些亚单位、病毒载体活疫苗和采用反向遗传操作技术制备的禽流感疫苗等兽用基因工程疫苗相继通过了注册。1.1基因工程亚单位疫苗 基因工程亚单位疫苗是采用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原基因导入原核或真核细胞，使其在受体细胞中高效表达，提取分泌的保护性抗原蛋白与相应佐剂乳化制成疫苗。该类疫苗安全性好，副作用小，可用于外来病病原体以及不能或不易进行培养增殖的病原体。疫苗中只含有产生保护性免疫应答所必需的免疫原成分，便于鉴别诊断。青岛易帮生物工程有限公司研制的鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗、中国军事医学科学院微生物流行病研究所与北京市兽医生物药品厂研制的鸡衣原体病基因工程亚单位疫苗、中国农业科学院生物制品工程中心研制的羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗以及复旦大学和上海市农业科学院畜牧兽医研究所研制的猪口蹄疫O型基因工程疫苗相继通过了新兽药注册。近期国内学者开展了传染性胸膜肺炎放线杆菌以及猪圆环病毒的亚单位疫苗的研究[3,4,5]。现在规模化细菌发酵技术与蛋白纯化技术发展迅速，可以进一步降低生产成本，市场前景良好。 1.2病毒基因工程缺失疫苗
缺失与毒力相关基因及病毒复制非必需基因是当前研制活疫苗的主要途径之一，缺失毒力相关基因可以降低病毒的致病性，但仍保持其免疫原性，而且缺失的基因及其编码产物可作为一种用于区别免疫与自然感染动物的鉴别诊断标志。在病毒基因缺失疫苗研究上最为成功的是伪狂犬和牛传染性鼻气管炎病毒基因缺失疫苗。由哈尔滨兽医研究所引进并已在国内推广应用多年的伪狂犬病活疫苗是gE/ gI双基因缺失的Bartha-K61株。华中农业大学研制的TK/gG双基因缺失猪伪狂犬病活疫苗(H B-98株)与四川大学研制的TK/gE/g I三基因缺失猪伪狂犬病活疫苗(SA-215株)均通过新兽药注册。以此为基础国内学者还开展了伪狂犬病毒载体活疫苗的研究，分别构建了表达猪流感病毒H3N2亚型的H A基因、猪圆环病毒2型的ORF2基因以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的重组伪狂犬病毒[6-8]，这为伪狂犬病毒载体活疫苗的研发奠定了基础。
1.3病毒载体活疫苗
病毒载体活疫苗主要以弱毒为载体通过基因工程方法使之携带并表达某种特定病原体的主要免疫原基因。目前病毒载体活疫苗研究发展迅速，商品化的病毒载体活疫苗主要以痘病毒、火鸡疱疹病毒和新城疫病毒载体为主。
1.3.1重组鸡痘病毒载体活疫苗重组鸡痘病毒主要采用同源重组技术构建，作为理想的禽类病毒性疫苗
载体，具有许多优点：产生针对表达外源蛋白的体液和细胞免疫应答，一次接种可以产生长时间的免疫力；重组疫苗中只含有病原微生物特定的抗原成分，给鸡免疫后可以将自然感染与重组疫苗免疫鸡区分开；生产成本低；具有严格的宿主特异性、安全性好。哈尔滨兽医研究所研制的鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗和禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗(H5亚型)已通过了新兽药注册，现地应用效果良好，并且对两种疫苗联合免疫的程序进行了探索[9]。同时分别进行了共表达传染性支气管炎与干扰素以及鸡传染性喉气管炎、新城疫重组鸡痘病毒载体活疫苗的研究[10-11]。
1.3.2新城疫病毒载体活疫苗随着RNA病毒反向遗传操作技术(RGS)的发展，采用新城疫病毒(NDV)作为载体的技术已经发展成熟,NDV作为载体具有很多优点:ND弱毒疫苗已经广泛使用而且免疫保护效果很好，并且重组率很低，安全性高; NDV可在鸡胚上增殖，生产成本低;NDV比较稳定，可以通过饮水或气雾方式来进行免疫；可以诱发黏膜免疫，尽管存在母源抗体，仍可诱导局部免疫应答；表达的蛋白少，对宿主的免疫干扰小。步志高等以NDV为载体构建了表达H5亚型禽流感病毒H A的重组NDV，可以抵抗新城疫以及H5亚型禽流感强毒的攻击，以此为基础研制的禽流感、新城疫重组二联活疫苗(rL H5株)通过新兽药注册[12]。这标志着我国在负链RNA病毒反向遗传操作技术领域取得突破性进展。另外，以此NDV反向遗传操作系统为基础，构建了表达高致病性鸡传染性法氏囊病(VP2)的重组NDV疫苗[13]，正在进行卵内接种疫苗的研究。
1.4基因工程菌苗
在集约化养殖中对细菌病的防控相对更加重要，采用细菌作为载体也是防控疫病的理想途径之
175
智海东等：我国兽用基因工程疫苗研发现状与策略
一，因为它们的生产成本低，可以通过口服或鼻内途径免疫，诱导细胞和体液免疫应答。可以容纳多个不同的外源基因，研制多价疫苗。如果需要可以采用抗生素控制接种产生的副反应。目前在动物用细菌载体疫苗研究上发展迅速[14]。军事科学院生物工程研究所研制的仔猪大肠埃希菌病K88、LTB双价基因工程活疫苗通过注册。哈尔滨兽医研究所研制的仔猪大肠埃希菌病K88、K99双价基因工程活疫苗已获得了转基因生物安全证书。这两个疫苗在现地应用中对仔猪腹泻的预防均取得了很好的效果。
采用致病性大肠埃希菌，再插入其他致病菌的免疫原基因，构建双价甚至多价灭活疫苗，是当前研制细菌灭活苗的趋势。中国科学院上海生物工程中心研制的仔猪大肠埃希菌K88、K99双价基因工程灭活疫苗与宁夏大学研制的犊牛、羔羊大肠埃希菌、B型产气荚膜梭菌基因工程灭活疫苗相继通过了注册，在预防仔猪和幼畜腹泻方面取得了理想的保护效果。目前在细菌基因工程疫苗的研发方面还存在着很大发展空间。
1.5采用RGS制备的禽流感疫苗
禽流感病毒的RGS发展迅速，这项技术除了用于研究禽流感病毒的结构与功能之外，主要用于禽流感疫苗的研究。根据对国内禽流感病毒流行病学多年的监测，哈尔滨兽医研究所采用RGS构建了一株疫苗生产毒株，研制出重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)。此疫苗生产种毒与流行病毒在抗原性方面高度一致，可在鸡胚上高效复制，所制备的疫苗抗原含量高，并可用于鸭、鹅等水禽的免疫。此疫苗的应用拉开了在我国采用基因工程疫苗防控禽流感的序幕，并且根据我国禽流感病毒抗原流行变异情况，完成了重组禽流感病毒疫苗由Re-1到Re-4乃至Re-4+Re-5二联疫苗的升级和换代[15]。刘明等[16]采用RGS构建了重组H5N3亚型的禽流感病毒高产疫苗株，研制了重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗(rH5N3株)。由于N3亚型在国内很少见，据此可建立血清学鉴别诊断方法。此疫苗可用于大规模细胞培养来生产灭活苗，现已作为我国重组禽流感病毒疫苗的研发储备，目前正在进行临床试验。
1.6合成肽疫苗
合成肽疫苗是一种完全基于病原体抗原表位或者抗原决定簇氨基酸序列特点开发设计的一类疫苗。该疫苗是依据天然蛋白质氨基酸序列一级结构用化学方法人工合成包含抗原决定簇的小肽(约20-40个氨基酸)，通常包含一个或多个B细胞抗原表位和T细胞抗原表位，特别适用于不能通过体外培养方式获得足够量抗原的微生物病原体或虽能进行体外培养但生长滴度低的微生物。对合成肽疫苗的研究主要集中于口蹄疫疫苗。中牧实业股份有限公司和美国联合生物医学有限公司研制的猪口蹄疫O型合成肽
疫苗通过新兽药注册。疫苗抗原为纯化的中和性抗原多肽，不易产生过敏反应，对动物的副作用小，对增重的影响小。此疫苗设计的抗原序列覆盖了众多O型FM DV的抗原位点序列，比灭活疫苗具有更强的抗流行毒株的能力，同时可以进行鉴别诊断。目前国内天康公司正在进行二价口蹄疫合成肽疫苗的研究[17]。
1.7抗独特型抗体疫苗
抗独特型抗体疫苗是免疫调节网络学说发展到新阶段的产物。抗独特型抗体可以模拟抗原物质，刺激机体产生与抗原特异性抗体具有同等效应的抗体，由此制成的疫苗称为抗独特型抗体疫苗或内影像疫苗。抗独特型抗体疫苗可以诱导细胞和体液免疫应答，目前在兽医领域的研究较为活跃，并显示出广泛的发展前景[18]。北京卓越海洋生物科技有限公司和中国人民解放军第四军医大学研制的牙鲆鱼溶藻弧菌、鳗弧菌、迟缓爱德华菌病多联抗独特型抗体疫苗通过注册，这标志着我国在抗独特型抗体疫苗的研发和产业化方面取得突破，并且在鱼用制品研究领域走到国际前列。
1.8核酸疫苗
核酸疫苗目前被称为免疫学上的第三次革命，简单说就是将编码异源蛋白基因的质粒接种于动物，在动物体内产生功能性蛋白，从而诱发免疫反应。此疫苗安全，异源抗原可以真实表达，诱导广泛的体液和细胞免疫应答。多种编码不同抗原的基因可以同时使用，不必担心疫苗间的干扰。有可能筛选出
语言清晰度
一种新的保护性抗原基因，对目前没有疫苗免疫的疾病进行免疫预防，也可能对存在母源抗体的动物产生免疫保护。目前在动物用DNA疫苗的研究上已取得了一定的进展[19-21]，犬的黑素瘤与西尼罗河热核酸疫苗在美国已注册成功。哈尔滨兽医研究所研制的禽流感DNA疫苗(H5亚型,pH5-GD)的免疫效果确实，免疫后H I抗体可以持续1年，并对强毒攻击保持100%的保护。该疫苗已通过生物安全评价，正在进行临床试验。
2外企在国内注册的兽用基因工程疫苗发达国家在基因工程疫苗的研究上起步较早，在整体水平上要高于我国。随着我国畜牧业以及宠
176动物医学进展2011年第32卷第6期(总第216期)
物产业的迅速发展，中国现在已经成为世界动物保健品的重要消费市场，国外大公司针对国际市场变化进行战略调整，将部分产品的市场重心向中国转移。在加强常规兽用疫苗注册的同时，同时也加大了兽用基因工程疫苗注册的力度，比如梅里亚公司的鸡传染性法氏囊病火鸡疱疹病毒载体活疫苗已在国内注册。梅里亚、海博莱与勃林格公司注册的伪狂犬病活疫苗所采用的毒株均为g E/gI双基因缺失的Bartha株。由于基因工程疫苗研发的瓶颈与科技含量高，所带来的附加值也大，国外企业将会加大在我国注册兽用基因工程疫苗的力度。在兽用基因工程疫苗研发领域，我们已经在面对激烈的国际竞争。
3我国兽用基因工程疫苗研发的主要特点与策略
3.1加强合作
我国目前在兽用生物制品研发上和国外发达国家相比还有一定的差距，但在总体产品的研发模式上逐渐和国外接轨。早期探索性与基础性的研究工作由高校或研究所完成，基因工程疫苗研发的创新源泉来源于高校和研究所，而企业则具有转化的优势，这促进了高校、研究所与企业之间的合作。当前我国兽用生物制品行业已经进入后GM P时代，各生药企业硬件条件越来越好，很多企业已经在规模化细菌发酵、大规模细胞培养、浓缩等技术方面进行了大量的投入，这同时也为兽用基因工程疫苗的研究与转化奠定了基础[22]。
3.2加快产业升级
国内禽用弱毒疫苗用量很大，目前由哈尔滨维科生物技术开发公司生产的禽流感、新城疫重组二联活疫苗(rL H5株)全部采用SPF鸡胚，这加快了国内禽用弱毒疫苗的SPF化进程。继禽流感(H5 +H9)二价灭活疫苗(H5N1Re-1株+H9N2Re-2株)联苗注册成功之后，衍生的以禽流感H9亚型为主研发的联苗陆续上市，这促进了浓缩技术的发展。对基因工程亚单位疫苗的研发促进了细菌发酵以及蛋白浓缩与纯化技术的发展，对重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗(rH5N3株)细胞苗的研发促进了大规模细胞培养技术的发展。基因工程产品的商品化带动了行业的整体发展，而对基因工程产品的市场需求量增大同时
也推动了对基因工程产品的开发。
3.3加强诊断液的研发
现有的基因工程疫苗比如基因缺失疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗以及DNA疫苗等在某种程度上都可以称为标记疫苗。这些疫苗的共同特征是都带有可供鉴别诊断的标记，据此可以建立区别疫苗免疫和自然感染的血清学方法。比如伪狂犬病g E ELISA试剂盒可用于区别疫苗免疫和自然感染猪，对猪场伪狂犬病的净化起着重要的作用。在重组禽流感病毒灭活疫苗由Re-1株到Re-4及Re-5株疫苗升级时，均需要升级特异性抗原进行效力评价。我国也针对口蹄疫基因工程疫苗研制了配套的用于检测免疫效果的诊断试剂盒。研制配套的用于鉴别诊断的基因工程诊断试剂同时也是疫苗效力评价的需求，这也符合疫苗效力检验中对实验动物福利中3Rs的要求。加强诊断液研发在某种意义上也是构建基因工程疫苗研发的平台。
3.4构建新型基因工程疫苗研发平台
从兽用基因工程疫苗研发现状看，我国已经取得了一定的进展，但整体上还需要进一步的改进与提高。虽然预防疾病的病原涉及到细菌、病毒、寄生虫和衣原体，但预防疾病的重点主要集中于禽病与猪病，产品研发的种类相对单一。比如我国还没有以商品化痘病毒为载体的非复制型疫苗以及火鸡疱疹病毒载体活疫苗。随着对病原体结构与功能基础研究的进一步深入，对于所有的病毒载体比如禽痘
、火鸡疱疹病毒基因组已全面解析，可以构建更新的载体系统或平台。哈尔滨兽医研究所现在已经成功地构建了火鸡疱疹病毒和马立克病病毒的细菌人工染体系统[23-24]，刘思国等正在进行新型/菌影0疫苗的研究[25-26]，这些新型系统将为我国兽用基因工程疫苗的研发奠定基础。
4小结与展望
我国目前已在兽用基因工程疫苗的研究与转化上具备一定的基础，可以充分利用我国在基因工程上游操作的优势，对现有的基因工程疫苗载体系统进一步开发利用或者再构建新系统，同时开发新型分子佐剂和免疫增强剂等，平衡制品的种类与结构。进一步提升和加强企业下游应用的能力，构建好产品转化平台。以基因工程疫苗的研发为龙头，加大集成创新力度，逐步扩大基因工程疫苗的应用，提升行业核心竞争力。国家在应用层面加强管理，构建完善的疫病防御体系，保障我国畜牧业的健康发展。参考文献:
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