这时目标物被较强的吸附在填料上，而杂质和基体物质不被吸附或仅有微弱吸附。为了增加目标物的吸附，防止目标物的流失，溶解样品的溶剂的强度应该很弱，不至于起到洗脱液的作用而将目标物冲出萃取柱。在反相固相萃取中，通常用水和缓冲液作溶解样品的溶剂，为了增加有机物的溶解，可以在水相溶液中加入少量的有机溶剂（如不超过10%的甲醇）。为了避免上样过程中目标物的流失，可以减少样品体积、增加填料量、用弱溶剂稀释样品或选择对目标物吸附更强的填料。SPE柱选定后可以通过实验测定出其对特定样品溶液的穿透体积。若目标组分和基体组分都竞争吸附位置，则对于不同基体的样品溶液将观察到目标物不同的穿透行为。在进行穿透实验时，选择目标物的浓度为实际试样中预期的最大浓度。最后选定的上样体积（上样量）应该小于测定的穿透体积，以防止在后续洗脱杂质的操作步骤中将目标物洗脱出来。 阿米什人
干扰物洗脱通常用相对比较弱的溶剂（清洗剂）通过萃取柱，将弱保留的杂质或基体物质洗脱出来，而目标物仍然保留在萃取柱中。对于反相固相萃取，通常用含适当浓度有机溶剂的水（缓冲）溶液洗脱干扰物质。在此步骤中，应根据需要选择合适的洗脱液强度和洗脱体积，
尽可能多的将干扰物质洗脱掉。为了确定最佳清洗溶剂和体积，可以将样品上柱后，用5~10倍柱床体积的清洗剂洗脱，并依次收集和分析流出物，得到清洗溶剂对目标物的洗脱曲线。依次增加清洗溶剂强度，根据不同溶剂强度下的洗脱曲线，决定合适的清洗剂浓度和体积。
目标物洗脱操作是用相对较强的洗脱液，将吸附在萃取柱中的目标物全部洗脱出来，同时，尽可能使部分强烈吸附在萃取柱上的杂质或基体物质仍然留在萃取柱上。关键还是选择合适的洗脱液浓度和体积。可以加样于SPE柱上，改变洗脱液的强度和体积，测定目标物的回收率，用以确定最佳洗脱溶剂的强度和体积。洗脱下来的样品可能对于后续分析而言浓度太低，或者洗脱溶剂不适合后续分析，通常需将洗脱下来的样品溶液用氮气吹干（有与固相萃取仪配套的浓缩仪），再用适合后续分析的溶剂进行复溶。
对于以除去特定干扰物为目的的固相萃取操作，通常是干扰物较强的吸附在萃取柱上，而目标物和大部分基体物质在萃取柱中不保留或者仅仅微弱保留。这时的操作程序就和上述步骤有所不同，但分离的原理是相同的。 以硅胶作为载体的固相萃取填料占多数，硅胶载体上的残余硅醇基具有不利的一面，但有
时也可以加以利用。硅胶载体的非极性固定相通常采用封尾技术将硅胶表面的残余硅醇基屏蔽，但极性或离子交换固定相通常不封尾。封尾程度非常重要，因为残余硅醇基对化合物的保留和洗脱起着不可忽视的作用。即使采用最严格的封尾方法，也只能将键合相形成后剩余的硅醇基团的70%封住。因此，那些残余硅醇基还会在待测组分的分离中发挥作用。
残余硅醇基的作用表现在：在pH<2时，硅醇基不带电荷；pH>2时,硅醇基逐渐离解而带负电荷，从而影响萃取。静电相互作用比疏水相互作用更强，因此，如果存在混合保留机理，必须采取措施减小或扩大残余硅醇基的影响。例如，固相萃取法萃取胺时，带正电荷的胺与带负电荷的硅醇基形成非共价键，很难离解。为了降低硅醇基的影响，最好选择封尾的固定相。残余硅醇基可用三乙胺或醋酸铵等竞争碱来屏蔽。
残余硅醇基有时可以利用。使用没有封尾的固定相和pH≥4的缓冲溶液以保证残余硅醇基离子化。推荐采用缓冲溶液作为二级调节溶剂是因为水的pH是波动的，而且没有缓冲能力。一个利用残余硅醇基的实例是血浆中舒喘宁测定的样品预处理。采用未封尾的硅胶萃取小柱，先用甲醇和水活化萃取柱，血浆流经萃取柱，戴正电荷的输出安宁通过与贵春季的相
互作用而被萃取在柱上。先用水然后用乙腈冲洗固定相以消除有可能，最后用含有0.5%醋酸铵的甲醇溶液将舒喘宁从萃取柱上洗脱下来，作为后续分析的样品。
唐吉田如果从相互作用的角度来考虑溶质与固定相之间的作用，可以认为待测组分通过氢键、偶极-偶极相互作用、疏水相互作用等机理保留到固定相上。在萃取中，这些作用机理可能单
多少人败给了一个等字独存在，也可能多种分离机理同时存在。了解是哪些力在起作用，有利于制订特效的分离方法。各种键合力的能量相差较大：疏水键合能（偶极-偶极、偶极-诱导偶极、扩散相互作用）为1~10kcal/mol；极性基团间的氢键为5~10kcal/mol，这种类型的相互作用在硅胶表面发生的机会较多；相反电荷间的离子或静电相互作用为50~200kcal/mol。
soa 案例
有机高分子聚合物填料在固相萃取中也常常用到。溶质与这种填料也是利用范德华力、氢键、离子相互作用、偶极-偶极相互吸引等机理进行分离的。与硅胶载体的固定相相反，有机聚合物固定相没有由硅烷醇或痕量金属引起的附加效应干扰待测组分在固定相表面的吸附。非极性物质，如脂肪、蜡、碳氢化合物、类脂类和芳香类化合物，可以强烈地吸附在这类固定相上，如果采用温和的洗脱条件，上述非极性物质可以与极性或离子性污染物分离。如果抑制离子型化合物的离解，使它们成为“电中性”的，它们也能在有机聚合物萃取
柱上保留，然后通过改变淋洗液的pH将它们从洗脱柱上洗脱下来。
5.5.3固相萃取的应用
近年来随着生物医药等学科的快速发展，固相萃取这一新的样品前处理技术得到了飞速发展，在药物、临床、食品和环境分析等诸多领域都有应用。例如，环境水样中有机物含量低，采用传统的溶剂萃取不仅误差大，而且操作繁琐，若采用SPE进行富集，简单有效，而且节省溶剂。目前美国标准方法（EPA）已经允许采用SPE法代替溶剂萃取作为水样前处理方法，富集水样等环境样品中的微量有机污染物。又如在生物样品分析中，大量蛋白质的存在会干扰后续分析，必须预先除去，多数情况下采用C18柱即可分离蛋白质，目标组分的回收率大多能达到80%以上。
企业年度检验办法5.5双水相萃取
随着生物化学工程等新型学科的发展，一些含量微小、具有生理活性又极有价值的生物物质的分离提纯成了十分关键的技术课题。换句话说，生物化学工程的发展在很大程度上依赖于生物分离技术的开拓和发展。例如，生物界已经存在的酶有2500种之多，但又有100
多种酶的工业性分离提取有过文献报道。显而易见，生物工程的产品分离问题，即生物工程的下游技术的开发是极为重要的。众所周知，生物物质多是有生理活性的。使用常规的分离技术来处理这类对象往往会带来处理量小、流程长、易失活、收率低和成本高等缺点。开发新型的生物物质分离技术，使其适应于一定的生产规模，且经济简便、快速高效，是十分迫切的要求。双水相萃取正是作为这类新型分离技术应运而生的。
早在1896年，Beijerinek在把明胶和琼脂或可溶性淀粉混合时发现，两种亲水性的高分子聚合物并非混为一相，而是出现了两个水相旳成相现象，这种现象称为聚合物的“不相容性”。20世纪60年代，研究者们开始提出了双水相萃取技术，利用双水相成相现象及待分离物质在两相间所具有的分配系数，来实现分离提纯的目的。20世纪70年代，一些研究者开始进行了双水相萃取的应用性研究，这类研究是从发酵液中提取各种酶的实验开始的。
十多年来，双水相萃取技术取得了较大的发展，它的研究及应用领域已经逐步扩展，可对于各种酶、核酸细胞、蛋白质、细胞器和菌体进行分离。已有的研究成果表明，双水相萃取技术是一种具有独特性能、针对性很强的、有前途的分离技术。
5.5.1双水相体系
5.5.1.1双水相体系
双水相旳成相现象实际上是由于亲水高聚物之间的不相容性造成的。绝大多数天然的或合成的亲水性高聚物的水溶液在与第二种亲水性高聚物混合时，超过一定的浓度范围就能产生两相，两种高聚物则分别溶于互不相溶的两相中，形成所谓的“双水相体系”。一般认为，由于高聚物之间的不相容性，即高聚物分子的空间阻碍作用，使之相互无法渗透，出现分离的倾向。当满足一定的成相条件时，即可分为两相。近年来，又发现某些高聚物溶液有分离的倾向、某些高聚物溶液与一些无机盐溶液相混合时，同样会在一定的浓度下形成双水相体系。这就是高聚物/无机盐双水相体系。目前，许多研究者仍致力于双水相成相机理的研究，现仍无十分成熟的理论。
常见于生物产物分离的高聚物/高聚物双水相体系有乙二醇（PEG）/葡萄糖（dextran），高聚物/无机盐体系有PEG/磷酸盐和PEG/硫酸盐体系。
以PEG/dextran体系为例，图5-36所给出的体系相图可以直观的表示出体系的成相条件。PEG、dextran高聚物和水均可无限混溶。但是，当体系的组成在图5-36中的曲线上方时（M点所示），体系就可以分为两相，两相的组成和密度均不同，上相（或称轻相）组成
以点表示，主要组成为PEG；下相（或称重相）组成用B点表示，主要组成为dextran。相图
