202丨年第49卷第3期 V〇1.49. No. 3,2021
EARTH AND ENVIRONMENT325
杨小红，张瑞雪1，王敬富2’3〃，贺康康U2，陈敬安2’3，刘勇2’3
(1.贵州大学资源与环境丁.程学院，贵阳550025:2.中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室， 贵阳550081 ;3.中国科学院大学，北京100049)
摘要：磷是地表环境中重要的生命元素。由于研究手段的限制，目前有关磷生物地球化学循环过程及机制的认识仍然匮 乏。作为一种新兴示踪剂，磷酸盐氧同位素（s l80p)成为当前研究磷生物地球化学循环的潜在有效工具。本文综述了 &80p 示踪环境中磷来源与循环的基础原理，不同环境介质中s l80p的分离
纯化及测试方法的研究进展，梳理了近年来Sl80p在环境 科学领域的应用，重点是土壤、沉积物和水生生态系统（河流、湖泊和海洋）。在此基础上，提出了以8O p在未来工作上的展望：进一步扩展V8O p分析测试技术（如低磷、高溶解有机质的样品），在藻类、微生物体系中分馏效应的探索。 关键词：磷酸盐氧同位素（Sl8Op)；来源示踪；生物地球化学循环；土壤和沉积物；水生生态系统
中图分类号：X142文献标识码：A文章编号：1672-9250(2021)03-0325-11d o i：10. 14050/j. cnki. 1672-9250.2021.49.066
磷被认为是所有已知生命形式的必要营养素，参与着生物的代谢过程，是核酸（〇〜六、1^~六）、三磷 酸腺苷（ATP)和磷脂等生物大分子结构和功能的重 要组成部分:1]。在自然界，磷主要以正磷酸盐的形式广泛分布在土壤、岩石、海洋、湖泊中。随着全球 人口的增加和工业的快速发展，人类对全球磷循环产生了巨大影响，使磷在地表环境中的流动大大增强[2]。人为活动会释放出大量的磷，比如磷矿开采、化肥施用、牲畜养殖、粮食生产、人类消费和排泄物等[3_4]。磷因在这些过程中大量且持续地释放而过剩，进而在陆地土壤、河流及海洋沉积物中不断积累。过量磷的输人极易导致地表水的富营养化、低氧区的形成和生态系统的恶化[5]，磷也是很 多河流和湖泊等水体富营养化的限制因子。因此，了解磷在生态系统中的来源及地球化学循环过程，是当前全球环境变化研究的关键科学问题之一。
由于地表环境中磷主要以+5价磷酸盐（p〇r)形式存在，且只有一种稳定同位素。因此，无法利 用价态变化和磷的稳定同位素来研究磷的地球化学循环，严重制约了磷循环研究的广度和深度。磷 *酸盐氧同位素（518Op)分析测试技术的发展，为地表 磷循环的研究提供了新的、有潜力的同位素工具+7]。本文全面综述了 Sl80p技术的原理、方法和 应用，并对未来的研究重点进行展望，旨在促进S18。,，技术在地表环境研究中的应用。
1磷酸盐氧同位素可用性的基础背景1.1磷酸盐氧同位素示踪原理
磷共有23种同位素（24P~46P)，但3卞是唯一的稳定同位素，其余均为不稳定的放射性同位素，如32P(半衰期14.3天）。因磷的同位素含量低、半 衰期短，使得研究磷生物地球化学循环的手段十分有限。无法像C、N、S等元素，利用其稳定同位素组成变化来研究物质来源和生物地球化学循环过程。但在自然界中，大部分磷酸盐的磷原子通过共价键与四个氧原子紧密结合（P-0键的键能为359.8 kj/mol)。磷酸盐中氧的稳定同位素180与160的比值即为磷酸盐氧同位素，常用s18〇p表示：
S l8〇p=(尺―-1)x 1000 ( 1)
\ ^V S M O W I
收稿日期：2020-10-27；改回日期：2021-0丨-15
基金项目：中国科学院战略先导B类专项（X D B40000000)；国家自然科学基金面上项目（41977296、4丨773丨45)。第一作者简介：杨小红（1995-)，女，硕士研究生，主要研究方向为湖泊环境，E-mail: **********************. *通讯作者：王敬富（1983-)，男，博士，研究员，研究方向为湖泊环境研究，£-!1^丨：〜311#11好11@卩丨9.81^丨6§.叩.
326
地球与环境2021 年
式中，为样品的|8〇,6〇比值，尺v s _是维也纳
平均海洋水标准的18〇/6〇比值。
研究表明，在地表非生物作用条件下，p -〇键特 别稳定，磷酸盐与周围氧原子交换过程缓慢，和水 中氧原子交换的分馏效应可忽略不计[8]。在沉淀、 溶解、解吸等物理过程产生的同位素分馏甚至小于
因为环境中的磷酸盐非常稳定，可以保留
自身的同位素值。很多研究利用s l 8o p 来示踪环境 中磷的来源
1.2地表磷循环中的氧同位素分馏效应
虽然在无机条件下，S 18Op 的分馏可忽视。但是 在地表环境中，生物作用几乎参与了磷循环的所有 过程（如无机磷的同化、有机磷的矿化等）。并且生 物作用会大大加速磷酸盐和周围水之间的氧交换， 带来平衡或动力学同位素分馏:17]。对于不同来源 的f 〇,，值，会被这种生物媒介作用下的循环过程 所改变。当生物作用较强，即达到或接近平衡时， ^8〇，值就不能再反映来源的特征同位素值。相反， 可以为不同磷源与微生物之间的代谢程度提供新 的见解。因此，利用5180…示踪磷来源时应充分考 虑生物介导下的同位素分馏效应的影响，特别是酶 作用下的影响。
磷被生物循环利用的主要过程为：酶将有机磷 (P 。」催化转化为无机磷（
) , P _g 被生物吸收
利用，细胞分泌出P ,……e 以及从腐烂的生物体中释放 出P ,……s [l 7]。S 1S 0P 的同位素分馏效应主要发生在3 个生物过程中，即细胞内P _s 的代谢过程、细胞外
Pi n …r ，的吸收过程以及细胞夕卜P .,rs化合物的酶催化
水解过程。图1示意了简要的生物过程，其以〇,, 的同位素分馏特征如下：
李静轩(1)
细胞内P _s 的代谢过程：P _g 能够跨胞质
膜扩散，是生物最优先利用的磷形态。焦磷酸酶普 遍存在于生物活体细胞内，其可催化焦磷酸盐的水 解。整个反应过程迅速，磷酸盐内的氧原子可在短 时间内与周边水体中的氧原子充分交换，因此细胞 内的代谢通常被认为是平衡分馏[^19]。该平 衡受热力学控制，S ^O ,，比值是水体温度的函数，可 以利用水分子氧同位素比值和温度计算获得。 Longinelli 等在1973年发表了该同位素分馏 方程：
T (T ；) = 111.4 - 4.3 x (5l 8Op - 5,8O J (2)
式中，T 为水体温度，S l 80…为溶解磷酸盐的S l 80, S 18〇…为周围水分子的f绩效考核与绩效管理
〇。
(2)
细胞外的吸收过程：许多生物吸收过
程会造成同位素的动力学分馏效应。在实验室条 件下大肠杆菌的生长会优先利用3lP 16〇】_，导 致”P 1S C C 在细胞外环境富集[~。并且，聚胞菌在 摄取p 〇r 的过程中也会优先吸收同位素较轻 的 p |6〇r [2'】。
(3)
细胞外P …g 化合物的酶催化水解过程：在
水生生态系统中，有机物的细胞外水解是p _e 再生 的重要途径:22]。
化合物不能被生物体直接利
用[~，当生物可利用浓度较低时，生物体往往 通过向细胞外分泌磷酸酶将p …g 化合物水解成
m
1代谢过程在细胞内或细胞外环境中可能发生的同位素分馏效应示意图（改自文献[7])
Fig. 1
Schematic diagram describing the major isotope effects that can occur within the intracellular or
extracellular environment d u e to metabolic processes ( from ref. [ 7
花开花谢又是季节的转移
])
第3期杨小红等：磷酸盐氧同位索示踪环境中磷的来源与转化：原理.方法与应用327
Pi n…8，再用于生物的生长和新陈代谢。在P…g酶催 化水解过程中，P-〇键被裂解，P…s中的氧原子被周 围水分子中的氧原子替换，生成P_s，造成同位素 分馏;19]。同时，不同种类的磷酸酶以及相关的水解 路径将直接影响氧同位素交换的比例，造成不同的 5ls〇p分馏效应，如磷酸单酯在酸性磷酸酶作用下的 同位分馏为5%~7.5%c，而在碱性磷酸酶作用下同位分馏则可高达30% 1241。
2磷酸盐氧同位素前处理方法研究进展
自磷酸盐氧同位素被应用以来，对其的分析技 术一直是研究的重点和难点。分析技术又分为两部分，前处理和测试。前处理主要指去除各种介质中的杂质，将磷酸盐分离和纯化，以生成便于测试的稳定物质。早期研究者是利用BiP04作为Sl8Op 的最终沉淀物，但由于BiP04吸水性高，随后的研究 者利用Ag3P04代替BiP04进行氧同位素分析。此 后，从不同物质中分离、纯化和沉淀磷酸盐的方法逐渐得到发展。
2.1水生系统前处理方法的进展
当前，水生生态系统中Sl8〇P前处理方法的简要流程为：1)通过共沉淀的方式富集和浓缩水体样品的P_s;2)在酸性条件下溶解沉淀物；3)用阴离 子交换树脂/顺序沉淀去除潜在的氧源；4)用阳离 子交换树脂去除具有干扰性的阳离子；5)沉淀生 成 Ag3P04。
水生生态系统的前处理方法最初应用于海水，而后应用于淡水及孔隙水[~27]。表1总结了水生 生态系统主要&8〇p前处理方法。方法的最初是由 Longinelli等_:°通过附着Fe(OH)3的聚丙烯纤维从 未过滤的水中提取和富集磷，然后再通过将磷酸盐转化为磷钼酸铵和磷酸铵镁，最后再通过转化为高纯度的BiP04固体进行5180…测试。但这个方法会 吸附部分颗粒态磷和溶解态有机磷，最终导致同位 素值偏低。而后前处理方法不断发展，但具有各自 的优缺点（表1)。然而，对于磷浓度太低的样品，可 能无法获得可靠的尸(^值。通常，加大样品量来增多最终产物。但，Goldhammer等通过Mg(OH)2共沉淀
以及微萃取的方法来富集纯化海水沉积物孔隙水中的磷酸盐，对提取含量低的磷酸盐样品具有优势。随后Tcaci等[25]针对低磷淡水提 出一种Twist Spinning Mode(TSM)方案，即将水样通 过阴离子交换树脂以富集磷酸盐，而后参照Mclaughlin等|2X法处理。在国内，中科院地化所陈敬安课题组围绕淡水环境介质样品s18o p前处理方 法进行了系统研究和技术开发[29_31]。薛珂等[31]在 参照Mclaughlin的基础上，对前处理方法进行了优
化处理。通过使用M g(N03)2、避光、调节p H等操 作，提高样品的纯度，减少杂质生成。Liu等[3°]建 立了原位富集、洗脱和纯化的淡水水体前处理方法，新方法基于Zr-Oxide膜原位富集水体磷酸盐、同步去除多种杂质的特点，大幅简化了前处理操
作步骤，最终获取的高纯度的A g3P04固体和准确 可靠f〇p组成。周威[321建立了通过强碱性阴离子树脂吸附水体p〇r的方法，此方法减少了前处
ltps理的工作量，并提高了效率。
2.2 土壤/沉积物前处理方法的进展
由于土壤/沉积物本身的复杂性，其杂质含量远超水体样品，对土壤/沉积物不同磷形态的定量提取和5180…测试往往具有挑战性。根据研究目标或特定磷形态，研究者们开发了多种土壤和沉积物磷的化
学提取方法。如单一提取法和顺序提取法。目前只有少数土壤/沉积物不同磷形态的提取技术用于研究s18o p组成，主要以提取土壤/沉积物中无机磷为主要的目标。目前，在国际上，土壤常用Hedley法[361提取不同磷形态，并分析含磷提取液的518〇p。对于沉积物，其方法多样。Jaisi和Blake[37]采用了由Ruttenberg开发的SEDEX法[38]来测定不 同形态磷的5ls0p。国内，研究者针对方法也做了许 多完善与改进。如张秀梅等[39]建立了适合湖泊沉积物的Sl80p前处理方法（表2)。1^等[29]也在 Mclaughlin等[28]和Zohar等[4°]的基础上，建立了一套淡水沉积物不同磷形态的S18〇p分离纯化前处理方法。该方法提出利用“无磷活性炭”快速脱、去 除沉积物NaHC0,-P和NaOH-P提取液中有机质和大部分金属杂质，在HC1-P提取液PH~4条件下形 成Fe(0H)3-P04共沉淀、预去除大量金属阳离子和 c r等措施，大幅简化了操作步骤和避免了有机质、Cl_等杂质干扰。同时，对于同一样品，L ei等1411对 比了 Hedley法（土壤）和SEDEX法（沉积物）的磷 形态提取方法：Hedley法和SEDEX法提取的5I8〇p 值在不同磷形态之间存在较大差异。并指出Hedley 法对于分离土壤样品不同磷形态的同位素（不同来 源/生物有效性）具有很好的效率。而SEDEX法更 适用于沉积物。因此，对于不同样品我们应该选择合适的磷形态提取方法。具体见表2。
328地球与环境2021 年
表1水生生态系统主要5l8O p前处理方法
Table 1Main pretreatm ent methods of 8 O p in aquatic ecosystem
方法研究对象关键步骤优缺点
聚丙烯纤维-F e(0H)3富集磷酸盐—H N03洗富集效果好，但对水体磷含M要求高；聚丙烯纤维-Longinelli 法 ‘〇海水脱—H202/K M n04氧化有机质―多次磷钼酸F e(0H)3吸附的磷酸盐易在生物作用下造成氧同位素
铵/磷酸铵镁沉淀->B i P04沉淀分馏，造成测试值偏低；形成的BiP()4沉淀易潮解
Gruau 法[27淡水样品过滤—活性炭去除有机质—F e(()H)3富
天津中医学院第一附属医院集磷酸盐—震荡解离磷酸盐阴离子交换树
脂—A g3P04沉淀
改进了Longinelli方法，利用A g3P04沉淀替换了
B i P04沉淀，同时利用活性炭去除有机碳，成本低。
Colman 法[33海水多次M A G I C法沉淀_-H N03溶解—H L B固相
萃取柱除大分子有机质—阴/阳离子交换树脂
除有机质/N a V H C O; —80 条件下浓
缩，形成A g3P04沉淀
多次M A G I C法实验操作繁琐、费时，易造成有机质水
解；H L B固相萃取柱去除大分子有机质效果好但其价
格高且不能二次利用，实验成本较高。
2次M A G I C法沉淀—H N03溶解-阴/阳离子
Liang 法[34]海水交换树脂除有机质/H C〇i->紫外照射进一步
除有机物—A g3P04沉淀
紫外照射法造成温度较卨，可能引起氧同位素的分馏,
M g(0H)2共沉淀—H N03溶解—调节P H生缺乏专门针对有机质的去除步骤但M A G I C(1次）法Mclaughlin 法[2*海水成C e P04沉淀一►多次洗涤除H N03溶缩短了处理流程，形成C e P04沉淀并多次洗涤可较好
解-A G50X8阳离子交换树脂—A g3P04沉淀去除c r等干扰离子。
(;ol(lhammer 法.261孔隙水样品—M g(0H)2共沉淀—H N0，溶解—微萃
取—A G50X8阳离子交换树脂—A g3P04沉淀
实验操作繁琐，费时，但对十提取低含量的磷酸盐样品
具有优势，且开发用于孔隙水，
Tcaci 法[25]淡水样品—D m v e x丨X8-200阴离子交换树脂—KC1
洗脱—D A X-8树脂—M c L法
设计既便宜又简单，允许在现场部署，而不需要将大M
样品运输到实验室进行处理,
卢阳阳法1海水M S(()H)2共沉淀—硝酸+冰醋酸济解—调节
p H生成C e P04沉淀—A G50X8阳离子交换树
脂—A G1-X8阴离子交换树脂除有机质—加酸
超声鼓N2—A g3P04沉淀
通过增加阴离子树脂去除溶解冇机物，但对有机物含
特别高的样品，去除效果仍较差。
U u法淡水Z r-O x i d e膜原位富集P04 —N a O H洗脱—调节
p H 生成 C e P04沉淀—H N03溶解—A G50X8
阳离子交换树脂—A g3P04沉淀—15%H202
去除有机质—干燥
有效避免了大体积采样，大大降低了过滤和杂质去除
等步骤的难度（预富集步骤中即去除了绝大部分阴离
子、阳离子、D0C等杂质），节约了时间与经济成本。
但该方法仅适用于碱性水体。
2.3前处理过程中的注意事项
s l8〇…的前处理过程十分重要，这关系到能否获得准确的5”0,，值。分析过程中的氧源必须全部来源于磷酸盐，否则将影响数据的准确性。这要求处理过程中完全去除所有含氧污染物。包括有机物或其他含氧物质（例如A g N O,、A g O)。溶解有机物中含有高达45%的氧，已被证明会影响A g,P04的 纯度|4°]，这是天然样品前处理的一大难点。研究者针对这一问题，探索了一系列解决该问题的方法。例如：无磷活性炭吸附:27'29]，紫外辐射[~，添加树脂[421，腐殖酸沉淀[4°j和过氧化氢氧化129'403。同时公布的数据表明，这些方法不会改变磷酸盐氧同位素的原始值。这就要求我们在处理样品的过程中
确保每一步都精确的去除样品所含的杂质。例如：C e P04沉淀对p H的要求较高，其最佳的P H为5. 5, p H«3C e P04,P H>8C e(0H)3沉淀:44]。有机磷的水解也是纯化过程中需要注意的，P…f的水解可产生P i^。在操作过程中，使用强氧化性酸大幅度调节p H值或高温处理条件可能造成P..，氧化水解，P…s水解产生的会并人
A g,P04中，从而改变了原始的S180p值。自然界存在的有机磷化合物种类繁多，不同样品之间的浓度差异也很大，所以具有很多的不确定性。因此这一方面的研究还需进一步的加强。
第3期杨小红等：磷酸盐氧同位素示踪环境中磷的来源与转化：原理、方法与应用329
表2土壤/沉积物样品S I80P前处理方法
Table 2 Pretreatm ent methods of 8I8O p for soil /sedim ent samples
介质样品M样品提取主要处理过程有机质的去除引文
20-25 g1mol/L HCI 提取提取液—D A X-8树脂—沉淀一^Bi〇R a d A G50X8阳离
子交换树脂—A g3P04沉淀―15%H202浸泡—
D A X-8 树脂；15%
[42]干燥
土壤3.3 g
采用H e d l e y法对土壤不同
形态磷酸盐分级提取（心心
C03-P、N a0H-P、HCl-P)
提取液—M g(O H)2共沉淀—醋酸、硝酸溶解沉淀—
调节p H去除有机质—C e P04沉淀—Bi〇R a d A G50X8
阳离子交换树脂—A g3P04沉淀—15%H202浸泡
—干燥
调节P H< 1，使腐殖
酸沉淀；D A X-8树脂
吸附；15% H202
[40]—
阳离子交换膜富集无机态有
效磷
样品—阴离子交换膜（B D H-551642S)—H N03洗脱
—D A X-8 树脂一►CePOd 沉淀—Bi〇R a d A G50X8 阳离
子交换树脂—A g3P04沉淀—40冗烘箱内烘干
D A X-8树脂[43]
提取液—D A X-8树月旨一沉淀—沉淀->BioRad A G
30 g1mol/L HC1 提取50X8阳离子交换树脂—氨水重结晶去除无机质—
A g3P04沉淀—50 t烘干
D A X-8树脂[10]
0.5 g S E D E X 法提取液—沉淀—阳离子交换树脂—A g3P04沉淀—[37]
提取液（N a H C03-P、N a〇H-P)—无磷活性炭粉去除
有机质—C e P04沉淀—Bi〇R a d A G50X8阳离子交换
采用H e d l e y对不同形态磷
树脂—A g3P04沉淀―15%H202浸泡—冷干或
50 1烘箱内烘干网络拓扑图
提取液（14(：丨-?)-^6(0^〇3-卩034_共沉淀—8丨〇1^(1-
A G50X8阳离子交换树脂—C e P04沉淀—BioRad-
沉积物3.3 g酸盐分级提取（N a H C03-P、
N a O H-P,HC1-P)
活性炭；15%H2〇2[29]
A G50X8阳离子交换树脂—A g3P04沉淀―15%
H202浸泡—冷干或50丈烘干
2.5%N a C丨0除碳预处理—1mol/L H C丨提取—氢氧
—
1mol/L HC1 提取化镁共沉淀、磷钼酸铵+磷酸铵镁沉淀—BioRad-
A G50X8阳离子交换树脂处理—A g3P04沉淀
_[39]
注：一表示无数据
3磷酸盐氧同位素测试方法研究进展早期，s l8o p组成的测定主要通过“密度法”和“平衡法”等间接法，多针对实验室的纯化学试剂145]，这些方法不适于实际情况。随后研究者把注 意力转移到天然样品。Tudge[461借鉴硅酸盐的方法 提出了 BiP04氟化法。样品溶解并去除有机质后，通过钼酸铵和磷酸铵镁沉淀将P〇】_转化为BiP04.H20(75 ~ 175 "C 为 a-BiP04)，然后用 BrF3氟化a-BiP04，用质谱测定释放的02。但该方法存 在一定的缺陷，例如：样品处理步骤复杂，样品需求 量大（20~40 mg BiP04)，且a-BiP04极易吸水。随 后发现Ag3P04具有纯度高，稳定性好、不吸水等特 征，Wright和H〇erin g[471首次将正磷酸盐转化为Ag3P04，并用BiF5对其进行氟化来测定磷酸盐的氧 同位素组成。尽管AglP04*的氧通过氟化法可以 被完全提取，但其中涉及到危险物质BrF5或BrF3，这违背了绿发展的信念。
之后，O'N eil等[481建立了一种替代方法，将一 定量的石墨和Ag,P04密封在石英管中，在高温(1 200
弋）下裂解Ag,P04产生用于同位素分析的C02。尽管该方法更有效，但需要更多的样本量(10~20 mg)。随着热裂解元素分析仪-同位素质谱 (TC/EA-IRMS)技术的提出和发展，极大便利了S18〇p的测试，并实现了O'N e il等方法的自动化。现今，由于TC/EA-1R M S具有操作简单、测定速度快、样品用量少（2 mg)等优势，目前被广泛用于S”〇p值的测定。该部分内容，陈志刚等149]进行了 详细的总结与描述，本文不再详细赘述。
4磷酸盐氧同位素方法在环境中的应用
利用溶解无机磷的s l8〇p研究生态系统中磷的来源与循环是最新的一项工具，其研究主要集中在国外，国内处于起始阶段。自Longinelli和Nuti12"发起的开创性工作以来，S”〇p主要用于古环境研究。近年来，s18〇…在环境科学领域发展十分迅速。
