李国秀1，李建科23
(1.杨凌职业技术学院生物工程系，陕西杨凌712100;
2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062)
摘 要：以研究开发石榴皮多酚类物质的提取工艺为目的。以石榴皮粉为原料，研究了提取溶剂及其浓度、浸提温度、浸提时间和料液比对多酚提取效果的影响，并通过正交试验对四因素影响下的提取工艺进行了优化，确定了石榴皮多酚乙醇提取的最优工艺为：乙醇浓度60%、浸提温度60℃、料液比1∶20、浸提时间2h，提取两次，以此优化工艺进行实验，多酚得率为23.39%。本研究还首次采用超声波辅助提取石榴皮多酚，确定超声波处理的最佳时间为30min，提取两次，多酚得率为23.68%。该工艺具有一定的实用性和可行性。 关键词：石榴皮；多酚；提取工艺
石榴(Punica g ranat um L.)为石榴科石榴属植物，在我国栽培广泛，栽植面积达64668hm2，居世界首位，产量达38万多t，主要分布于陕西、山东、安徽、四川和云南五省[1]。石榴是一种药食两用植物，石榴果实不仅营养丰富，而且是历代药典中的重要中药，现代科学研究也证实，石榴果实在预防和心
脑血管疾病、癌症等方面有特效，而这些功效很可能来自于果实中的多酚类物质[2-4]。石榴果实的各部位，包括果皮、果肉、种子内都含有一定量的多酚类物质，其中以果皮中含量最为丰富[5]。石榴皮为石榴加工废料，目前除少数药用外，大多未加以利用，探寻石榴皮加工利用的途径和方法，具有重要的社会、经济价值。
1 材料与方法
1.1 材料
石榴皮粉：市购陕西临潼产净皮甜石榴，手工剥皮，鲜石榴皮经自然风干，粉碎后过40目筛，贮于棕瓶中，在干燥、避光的环境中保存备用。
没食子酸、无水碳酸钠、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、浓磷酸、盐酸、甲醇、无水乙醇、丙酮等均为国产分析纯试剂。
1.2 仪器设备
J FSD-70实验室粉碎磨、SHA-C恒温振荡器、TDL-4型离心机、H HW-21CU-600电热恒温水浴锅、DZF-1型真空干燥箱、WFJ2000型可见分光光度计、RE-52AA旋转蒸发器、KQ3200B型超声波清洗器、H-1微型混合器。1.3 试验方法
中国环球电视网
1.3.1 多酚含量的测定 采用Folin2Ciocalteu 比法(FC法)[6]，以没食子酸为标准。
(1)福林试剂的配制：在2000ml的磨口回流装置内加入100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml 蒸馏水,85%的浓磷酸50ml及浓盐酸100ml，充分混匀，以小火回流10h，再加入150g硫酸锂, 50ml蒸馏水，数滴溴水。然后开口继续煮沸15 min，使得溴水完全挥发为止。冷却后定容至1000ml，过滤，滤液呈黄绿，置于棕试剂瓶中，此液在冰箱中可长期保存，使用时加入1倍体积的蒸馏水稀释即可。
(2)总酚标准曲线的绘制：称取没食子酸0.0250g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，得浓度为0.025mg/ml的标准液。准确吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0ml置于25ml的棕容量瓶中，分别加入福林试剂1.0 ml，混匀，在0.5-8min内加入4ml15%的Na2CO3溶液，充分混合后定容,30℃避光放置1 h，以不加标准液的溶液为空白对照，在765nm 波长下测定吸光值，每个样品平行测定三次。以没食子酸在反应体系中的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示，所得标准曲线方程为y=0.1046x+0.0192,R2 =0.9991。
(3)样品总酚含量的测定：将样品或提取液用相应溶剂溶解或定容，吸取1ml置于25ml的棕容量瓶中，按上述标准曲线制作方法测定样品
3 收稿日期:2010204207
作者简介：李国秀(19762)，女，硕士，助教。 通讯作者：李建科。
反应液在765nm 波长下的吸光值，用回归方程计算总酚含量。1.3.2 石榴皮多酚提取方法
(1)溶剂浸提法：称取3g 石榴皮粉置于锥形瓶中，加入一定量的溶剂，用保鲜膜封口，在膜上扎一些小孔，置于水浴恒温振荡器中进行振荡提取一段时间后，真空抽滤，滤液经4000r/min 离心15min ,40℃下真空旋转蒸发回收溶剂后用蒸馏水定容、稀释，进行总酚含量的测定，计算多酚得率
:
图1 总酚含量测定标准曲线(以没食子酸为标准)
多酚得率(%)=提取液中多酚质量/原料质量×100
单因素试验考察提取溶剂及其浓度、浸提温度、浸提时间和料液比对多酚提取效果的影响。根据单因素试验结果，以有机溶剂浓度、浸提温度、料液比和浸提时间作为考察因素，采用L 9(43)正交试验考察四因素对多酚得率的影响，对石榴皮多酚提取条件进行优化。
(2)超声波辅助提取法：称取3g 石榴皮粉置于锥形瓶中，加入一定量的溶剂，用保鲜膜封口，在膜上扎一些小孔，采用溶剂浸提法正交实验所确定的溶剂浓度、提取温度和料液比，采用KQ3200B 型超声波清洗器(超声功率为120w ，超声频率为40k Hz )，分别设定处理时间10、20、30、40、50、60min 进行试验，研究在不同超声波
作用时间下石榴皮多酚的提取效果。提取液处理
方法与溶剂浸提法相同
。
图2 提取溶剂及其浓度对多酚得率的影响
1.3.3 统计分析 数据采用GPS Ver.3.01数
据处理软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 石榴皮多酚溶剂浸提法工艺研究2.1.1 单因素试验
(1)提取溶剂及其浓度的选择
甲醇、乙醇、丙酮、水均为植物多酚的常用提取溶剂，当样品为固体时，纯的有机溶剂不足以破坏样品中多酚类物质与蛋白质或其它物质的连接，多酚的提取率低，但当提取剂中水的比例过高时，糖类等水溶性杂质的浸出率也较高。实验结果如图2所示。当以纯溶剂提取时，多酚得率顺序为：甲醇>水>乙醇>丙酮。当以有机溶剂和水的复合体系作提取溶剂时，甲醇、乙醇、丙酮浓度在50%-70%之间的多酚得率较高，均高于各种纯溶剂提取时的多酚得率。混合溶剂多酚提取率高低顺序依次为:50%丙酮>70%丙酮>50%乙醇>70%甲醇>50%甲醇。考虑到丙酮具有一
定的毒性且成本较高，而50%乙醇的多酚得率与
50%丙酮相比差异并不大，因此，选用50%乙醇作为后续实验的提取溶剂。
(2)提取温度对多酚得率的影响
温度对于细胞内物质的溶出起着重要作用，温度过低，溶出速率慢，效率低，但温度过高，对于热敏性物质的性质产生影响，同时能量消耗大。本研究实验结果如图3所示。从图3中可以看出,20℃-60℃时，多酚得率随温度的升高而增大,60℃时多酚得率最高，但超过60℃时，多酚得率反而下降。因此，选择60℃进行后续实验
。
图3 提取温度对多酚得率的影响
(3)料液比对多酚得率的影响
料液比是影响原料中多酚提取的重要因素之
一。适当的料液比既可使原料中的多酚类物质得到充分提取，还可减少溶剂的消耗及回收成本。从图4可以看出，当料液比在1∶5-1∶20之间时，多酚得率增加的幅度较大，当料液比超过1∶
20时，多酚得率的增加幅度较为平缓。说明当料
豪杰超级解霸2000液比达到1∶20时，原料中的绝大多数多酚已被
提取出来，再增大料液比，多酚得率也不会明显提高。考虑到生产成本及操作难易的问题，选用1∶20的料液比较为适宜
。
图4 料液比对多酚得率的影响
(4)
提取时间对多酚得率的影响
图5 提取时间对多酚得率的影响
浸提时间长短直接影响提取效率的高低，浸提时间短，可以提高效率，但可能提取率低；提取
时间过长，生产效率低，且多酚易氧化而受损。从
图5可以看出，提取时间在2h 以内时，多酚得率随提取时间的延长而增大,2h 以后多酚得率反而下降。因此，提取时间不宜超过2h 。2.1.2 正交试验 根据单因素实验结果，发现有
机溶剂浓度、浸提温度、料液比和浸提时间等4个因素都对多酚得率有重要影响，为获得最佳的浸提工艺，采用L 9(43)正交实验考察四因素对多酚提取率的影响，结果见表1和图6
。
图6 正交试验直观分析图
从表1极差分析可知，各因素的主次顺序为
A >D >
B >
C ，即乙醇浓度>浸提时间>浸提温度>料液比。从表1和图6可看出，最优的提取工艺条件为A 3B 3C 3
D 2，但由于C 2、C 3多酚得率很接近，从节省溶剂、降低能耗等方面考虑，选择C 2比C 3更好。因此，乙醇浸提最优工艺为:A 3B 3C 2D 2，即乙醇浓度60%、浸提温度60℃、料液比1﹕20、浸提时间2h 。以此优化工艺进行实验，多酚得率为21.90%。
表1 正交试验方案及结果分析
处理号
乙醇浓度(A )
温度(B )
料液比(C )
时间(D )
总酚得率(%)
11(40%)
1(50℃)1(1∶15)1(1h )19.79212(55℃)2(1∶20)2(2h )20.86313(60℃
)3(1∶25)
3(3h )20.9442(50%)
12320.835223120.516231221.5173(60%)
13221.658321321.049332121.36
K161.5962.2762.3361.65K262.8562.4063.0464.01K364.0563.8163.1062.81R
0.82060.51160.25860.7896最优组合A3
B3
C3
D2
主次因素
A >D >
B >C
2.2 石榴皮多酚超声波辅助提取法工艺研究
超声波提取是利用超声空化作用加速改变物质组织结构和状态，使多酚大量溶出，具有能耗低、效率高和不破坏有效成分的特点。本研究采用固定功率为120w ，采用溶剂浸提法所确定的乙
醇浓度(60%)、浸提温度(60℃
)和料液比(1∶20)，研究了不同作用时间对多酚得率的影响，结果如图7所示。从图7中可以看出，在其它提取条件一定的情况下，超声波提取的最佳时间为30min ，此时多酚提取得率为22.54%。超过30min
以后，多酚得率反而迅速降低
。
图7 超声波处理时间对多酚得率的影响
眼睛渴了微电影2.3 石榴皮多酚提取次数试验及两种提取方法
的对比
将溶剂浸提法和超声波提取法分别进行提取次数试验并进行比较，结果如图8所示。两种提取方法提取两次时多酚得率增幅较大，提取率分别提高1.49%(溶剂浸提法)和1.14%(超声波辅助提取法)，多酚得率分别为23.39%和23.68%；提取三次较提取两次增幅较小，仅比提取两次多酚得率提高了0.29%(溶剂浸提法)和0.15%(超声波辅助提取法)，多酚得率分别为23.68%和23.83%。因此，综合考虑得率和成本等多方面的
因素，提取两次即可。超声波提取得率比溶剂浸提法要高，而且时间短，效率高，选用超声波提取更好
。
图8 两种提取方法多酚得率的比较
血源性病原体3 结论
(1)单因素实验和正交试验表明，乙醇浓度、
提取温度、提取时间和料液比均对石榴皮多酚提取得率有显著影响，各因素的主次顺序为乙醇浓度>浸提时间>浸提温度>料液比。正交试验确定石榴皮多酚乙醇提取的最优工艺为：乙醇浓度60%、浸提温度60℃、料液比1∶20、浸提时间2h 。以此优化工艺进行实验，一次提取多酚得率
为21.90%，两次提取多酚得率为23.39%。
(2)本研究首次采用超声波辅助提取石榴皮
多酚，确定超声波处理的最佳时间为30min ，一次提取多酚得率为22.54%，两次提取多酚得率为23.68%。超声波提取时间短，效率高，是一种快速、有效的提取方法。
4 讨论
关于石榴皮多酚类物质的提取，目前所见国内
外报道中大多采用溶剂浸提法，所用溶剂包括水、甲醇、乙醇、丙酮等。由于多酚在植物体内通常与蛋白质、多糖以氢键和疏水键形式形成稳定的化合物，而有机溶剂具有氢键断裂的作用，因此，有机溶剂与水的复合体系更有利于多酚的提取。笔者以及贾冬英等人[17]的研究结果都证实石榴多酚的提取也是如此，当有机溶剂浓度为50-70%时，多酚提取率较高，均高于相应的纯溶剂。R.P.Singh 等人[18]采用水、甲醇、乙酸乙酯为溶剂对石榴皮和石榴籽多酚进行提取，甲醇提取的多酚得率最高，石榴皮、籽多酚得率分别为4.13%和0.22%，该得率也明显低于本文研究结果。Y. F.Li [19]研究了甲醇、乙醇、丙酮溶液及其混合溶剂对石榴皮多酚类物质的提取效果，结果发现混合溶剂的提取效果最佳，对工艺进行优化以后，石榴皮提取物产率为31.5%，总酚含量为249.4mg/g ，即多酚得率为7.86%，与本研究相比，该方法所得多酚得率仍然
很低，而且混合溶剂回收再利用存在困难，溶剂浪费较大。本文采用乙醇溶液作为提取溶剂，工艺优化以后石榴皮多酚得率达23.68%，高于以往的研究报道；而且以乙醇为提取溶剂成本低、毒性低、易回收。因此，本研究所确定的方法具有一定的实用性和可行性。
超声波辅助提取法是近年来使用到天然产物
有效成分提取中的一种新方法，主要是借助于超声波对媒体产生的独特的机械振动作用和空化作
用来强化提取过程。超声波辅助提取方法在茶多酚、苹果多酚的提取研究中经常出现，但还未见到用
于石榴多酚的提取。笔者在确定溶剂浸提法工艺的基础上，进一步研究了超声波辅助提取法工艺。结果表明超声波辅助提取多酚得率比普通溶剂浸提法要高，而且所用的时间短，是一种省时、高效的提取方法。
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属于可逆过程，增加抑制剂浓度导致酶活力的下降是由于酶活力受到抑制，催化效率降低，而不是通过导致有效的酶量减少，而引起酶活力的下降。Zn2+具有络合能力，其d电子层呈全充满结构，不含易被可见光激发的自旋平行的d电子，能避免它与多酚类物质络合时产生有物质。因此，当Zn2+与红枣中的多酚类底物如绿原酸、儿茶酚发生络合反应，生成阻碍酚酶催化作用的新型结构物质后，就能抑制酶促褐变反应[4]。O2、Mn2+、Zn2+、Mg2+对PPO均有强烈激活作用, Ca2+对二者的作用都很弱,Fe2+、Cu2+对前者的作用明显强于后者。
3 讨论
(1)不同物理方法对红枣褐变的影响各不相同，同一种方法的不同强度也会使结果相差很大。有的方法能起到抑制的作用，有的方法反而加速了褐变。
(2)物理方法单独使用效果不是很理想，实际生产中应该与化学方法相结合，效果会更好。
(3)生产加工中应该考虑到金属离子对红枣褐变的影响，避免由金属离子促进的褐变。
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