食品工业 2007年第3期
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摘要从还原能力、抑制脂质体过氧化能力及清除 OH 、O 2-和DPPH 三种自由基的能力五个方面评价了黑莓渣中提取出的多酚类化合物的抗氧化活性。结果表明，从黑莓渣中提取出的多酚类化合物有较强的还原能力，能够抑制脂质体过氧化，具有清除 OH 、O 2-和DPPH 自由基的活性。而且从黑莓渣中提取出的多酚类化合物的抗氧化活性与其浓度之间有良好的量效关系。关键词黑莓渣；多酚类化合物；抗氧化活性 黑莓(blackberry)原产于北美洲，是蔷薇科悬钩子属多年生藤本植物。黑莓中含有丰富的多酚类化合物。多酚类化合物的主要功能性质是作为许多酶体系的抑
制剂或激活剂、金属螯合剂以及自由基清除剂[1,2]
。多酚类化合物通过酚羟基的离解和自由基途径产生抗氧
化作用[3]
湖北民族学院学报
，是医药、食品、化妆品中很有前景的一类天然抗氧化剂和自由基清除剂。
黑莓果汁加工过程中会产生大量废弃物黑莓渣，黑莓渣中残留了丰富的多酚类化合物，黑莓的抗氧化性与总酚的含量有很强的相关性[4]，因此对黑莓渣进行综合利用，提取分离多酚类生物活性物质不仅能减少环境污染，而且大大提高产品的附加值。
抗氧化活性有两种特性，一种是防止脂质过氧化，另一种是清除自由基。体外实验快速、灵敏，可在较短时间内初步评价一些功能性成分的抗氧化活性。本试验选用五种检测抗氧化能力的体外实验方法研究黑莓渣中提取的多酚类化合物的抗氧化活性。1材料与试剂1.1材料
黑莓渣提取物：黑莓酶解提汁后的残渣经热风干燥后，粉碎筛分，备用。将黑莓渣粉用乙醇溶液浸提，再以AB-8大孔树脂分离纯化并经减压浓缩、冷冻干燥
得到紫黑粉末，其中总酚含量为58 66%(以没食子
酸计)。1.2试剂
1,1-二苯基苦基苯肼(1,1-Dipheny -l 2-picry -l
hydrazyl):Sigma 公司;2.6-二叔丁基对甲酚(BHT)：中国医药集团上海化学试剂公司;VC：中国医药集团上海化学试剂公司；所有分析试剂均为分析纯。2实验方法
2.1总酚含量的测定
Folin-Ciocalteu 法[5]。2.2还原能力的测定
采用普鲁士兰法测定还原能力[6]。分别取不同浓度的黑莓渣提取物溶液、VC 、BHT 及茶多酚溶液0 5mL 样液于具塞试管中，加入2.5mL 0.2mol/L 、p H6 6的磷酸盐缓冲液和2 5mL 1%(W/V )的K 3Fe(CN)6溶液并混合均匀，于50 保温30min 后快速冷却，加入2.5mL 10%(W/V)的三溶液，混合后以3000r/min 离心10min 。取上清液2 5mL，加2.5mL 蒸馏水和1mL 0.1%(W/V)的FeCl 3，混合均匀，静置10min 后测定700nm 处的吸光度，吸光值越大，样品的还原能力越强。
2.3在卵磷脂脂质体中抗氧化活性的测定
结晶氯化铝Abstract In this paper,the antioxitive activities of polyphenols extracted from blackberry pomaces,including re -ducing power,ant-i lipid peroxidation,and the capacity of scavenging OH,O 2-and DPPH free radicals,were
studied.Based on the results,polyphenols had strong reducing power and inhibited lipid peroxidation.
It also exhib -ited scavenging capacities towards OH,O 2-and DPP H free radicals.Significant linear relationships were found between the antioxidative activities and the concentration of polyphenols.Keywords blackberry pomace;polyphenols;antioxidant activities Stud y on the Antioxidant Activities of Pol yp henols Extracted
from Blackberr y Pomaces
C hen Xin -xin,Xu Sh -i y in g
The School of Food Science of Southern Yangtze University
(Wuxi 214036)
基金项目：江苏省科技攻关计划(农业)项目(BE2004345)资助课题
黑莓渣提取物中多酚类化合物抗氧化活性的研究
陈欣欣，许时婴
江南大学食品学院
(无锡214036)
食品工业 2007年第3期
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A 05.7m L 120 mol/L DPPH 无水乙醇溶液+0.3mL 无水乙醇(空白对照)
A i 5.7mL 120 mol/L DPPH 无水乙醇溶液+0.3mL 试样A j
5.7mL 无水乙醇+0.3mL 试样
抑
制率/%总酚浓度/ g/m
L
吸
光值总酚VC B HT 茶多酚
总酚浓度/ g/mL
吸
光
度试剂配制:(1)脂质体磷酸缓冲液分散体系(LLS)：将300m g 卵磷脂溶解于30mL 10mmol/L p H7 4的磷酸缓冲液(PBS)中，超声波冰浴震荡;(2)三(TCA)-硫代酸(TBA)-盐酸(HCl)混合液:15g TCA,0 37g TBA,2.1mL 浓盐酸依次加入100mL 水中[7]。
测定方法：分别配制不同浓度的黑莓渣提取物溶液、BHT 及茶多酚溶液。在具塞试管中依次加入1mL LLS 、1mL400 mol/L 三氯化铁溶液(FeCl 3)、1mL 400 mol/L 抗坏血酸和1mL 样品，混匀。避光于37 水浴60min，再加入2mL TCA -TBA -HCl 混合液,100 水浴15min，迅速冷却，以2000r/min 离心10min，取上清液在532nm 测吸光值A S ，空白管以1mL 重蒸水代替1mL 样品，操作方法同上，可测得空白管的吸光度A C 。抑制率I(%)=
1002.4 OH 清除能力的测定
分别配制不同浓度的黑莓渣提取物溶液、VC 及茶多酚溶液。取1mL 2.5mmol/L 邻二氮菲溶液于试管中，依次加入2mL pH7.40PBS 和1mL 蒸馏水，充分混匀后，加入1mL2.5mmol/L 硫酸亚铁水溶液，混匀后，加入20mmol/L 过氧化氢水溶液，于37 恒温水浴中准确反应60min 后，在536nm 快速测其吸光值，所得的数据为损伤管的吸光值A 损。未损伤管以1mL 蒸馏水代替损伤管中1mL 20mmol /L 的双氧水，操作方法同损伤管，可测得536nm 未损伤管的吸光值A 未。样品管以1mL 样品代替损伤管中的1mL 蒸馏水，操作方法同损伤管，可
测得536nm 样品管的吸光值A 样[8]
。
按下式计算样品对 O H 的清除率:
清除率I(%)= 100
2.5O 2-清除能力的测定
采用邻苯三酚自氧化法测定O 2-清除能力。分别配制不同浓度的黑莓渣提取物溶液、VC 、BHT 及茶多酚溶液。于具塞试管中加入pH8 20的Tris -HCl 缓冲液(含0.1mmol/L EDTA)3mL，再加入1mL 样液(空白管以1mL 水代替)，充分混匀并于25 保温25min 后加入40 L 45mmol/L 邻苯三酚溶液，迅速混匀，在325nm 下每隔30s 读取吸光度，反应时间为5min，按下式计算清除率:
清除率I(%)= 100
其中 A 和 A 0分别表示加入样品和水后的邻苯三酚自氧化速率，即每分钟吸光度的平均变化率。2.6DPP H 清除能力的测定
根据文献报道[6,9-11]并作适当修改测定多酚类化合物DPPH 的清除能力。用无水乙醇分别配制不同浓度的黑莓渣提取物溶液、VC 、BHT 及茶多酚溶液。按表1程序加样，反应30min 后，用分光光度计在517nm 下测定各吸光度。清除率按下式计算:
清除率I(%)=1- 100表1清除DPPH 试验加样程序
3结果与讨论3.1还原能力
图1黑莓渣提取物中多酚类化合物的还原能力
图2还原能力的比较(样品浓度均为200 g/mL)从图1可以看出，还原能力随着总酚浓度的增加而提高，两者之间呈显著的量效关系，说明从黑莓渣中提取出的多酚类化合物是良好的电子供体，其供应的电
子可以使Fe 3+还原成Fe 2+
。
由图2可知，当浓度相同时，多酚类化合物的还原能力略低于VC，而明显高于BHT 和茶多酚。3.2在卵磷脂脂质体中的抗氧化活性
图3黑莓渣提取物中多酚类化合物
对脂质体过氧化的抑制率
A 0- A
A 0
A i -A j
A 0
A 样-A 损
A 未-A 损
A C -A S
A C
食品工业 2007年第3期
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图4对脂质体氧化的抑制率的比较
(样品浓度均为300 g /mL)
由图3可知，在试验的浓度范围内，多酚类化合物对由Fe 2+引发的卵磷脂PBS 分散体系过氧化的抑制能力随其浓度的增大而增大，并且浓度与过氧化抑制能力之间呈量效关系。由于VC 将Fe 3+还原为Fe 2+时产生的自由基会促进脂质体的氧化[12]，因此本试验采用BHT 和茶多酚作为对照物。由图4可知，当样品浓度均为300 g/mL 时，黑莓渣提取物中多酚类化合物对脂质体过氧化的抑制能力不及茶多酚和BHT 。3.3 OH 清除能力的测定
羟自由基( O H)清除率是反映物质抗氧化作用的重要指标。 OH 在其氧原子上含有一个未配对电子，夺取电子的能力很强，是体内最活泼的活性氧，可介导许多病理变化。产生 OH 的方法很多，其中Fen -ton 反应体系是最常用的，也是人体内产生 O H 的重要机理。在过渡金属离子催化作用下，过氧化氢可发生均裂产生羟自由基( O H)，反应式如下:
H 2O 2+Fe 2+
+H + OH+H 2O+Fe
3+
邻二氮菲-Fe 2+
是一种常用的氧化还原指示剂，其颜变化可以敏锐地反映溶液氧化还原状态的改
变。H 2O 2/Fe 2+
体系通过Fenton 反应产生 OH，邻二氮
菲-Fe 2+溶液可以被氧化为邻二氮菲-Fe 3+
，从而使邻
二氮菲-Fe 2+
在536nm 处的最大吸收峰的吸光值降低，且吸光值的降低幅度与 OH 生成量成正比关系，据此可以建立以A 536反映羟自由基氧化作用的比测定法[13]。
图5黑莓渣提取物中多酚类化合物
清除 OH 能力图6对 OH 的清除作用的比较(样品浓度均为250 g /mL)
邻二氮菲-Fe 2+氧化法在检测体外 OH 的氧化效应、筛选抗氧化剂有重要价值。从图5可以看出，在实验的浓度范围内，从黑莓渣中提取出的多酚类化合物有较强的清除 OH 的作用，并且浓度与 OH 清除能力之间呈显著的量效关系。在浓度为152 g /mL 时清除率可达到50%。
由图6可以看出，当样品浓度均为250 g/mL 时，从黑莓渣中提取出的多酚类化合物的羟自由基清除能力高于试验所用的茶多酚和VC 。3.4O 2-清除能力的测定
氧自由基和心脑血管疾病、早老性痴呆症、肝炎、糖尿病、白内障、视网膜损伤、癌症、艾滋病等疾病都有
远程教育论坛着密切关系[14]。能够产生O 2-的体系很多，其中邻苯三
酚自氧化体系所用试剂简单，稳定性和重现性好。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应，生成氧自由基和中间产物，该中间产物在325nm 处有一特征吸收峰。当在缓冲液中加入氧自由基清除剂时，氧自由基的生成受到抑制，邻苯三酚自氧化过程受阻，在325nm 处吸收减弱。故通过测定A 325值可以推断清除剂对氧自由基的清除作用，并比较不同清除剂及不同浓度的清除剂作用的相对大小。
从图7可以看出，从黑莓渣中提取出来的多酚类化
合物具有清除O 2-的活性，其浓度与O 2-清除率之间呈显著的量效关系。清除率为50%时多酚类化合物的浓度为500 g/mL 。由图8可以看出，当浓度为200 g/mL 时，从黑莓渣中提取出来的多酚类化合物清除O 2-的能力明显高于茶多酚但远低于VC 和BHT,VC 清除O 2-的能力最强。
图7黑莓渣提取物中多酚类化合物
清除O 2-
的能力
抑
制率/%清
除率/
%总酚浓度/ g/m L
清
除率/
%清
除率/%总酚浓度/ g/mL
总酚VC 茶多酚
食品工业 2007年第3期戈登模型
6
D
P P H 自由基清除率/%
剂量/ g
V C BHT 总酚茶多酚
FI 图8O 2-的清除能力的比较(样品浓度均为200 g /mL)
慢性再生障碍性贫血3.5DPP H 清除能力的测定
二苯基苦基苯肼自由基(1,1-Di p hen y l -2-p icr y l -h y draz y l，简称DPPH )分光测定法，在国内外广泛用于清除自由基物质性质的研究与天然抗氧化剂的筛选。DPPH 是一种稳定的自由基，其乙醇溶液显紫，在517nm 处有最大吸收，当有自由基清除剂存在时,DPPH 的单电子由于被配对,DPP H 浓度减小而使其颜变浅，在517nm 处的吸光度值变小，这种颜变浅的程度与配对电子数成化学计量关系，因而可用比法进行定量分析[10]。清除剂直接作用于DPPH 自由基，反应时间仅需20min 左右，用一般的分光光度计即可测定，故该方法操作简单、直接、灵敏、快速。
图9DPPH 的清除能力的比较
由图9可知，在实验的浓度范围内，几种样品清除DPPH 的能力都与剂量成明显的量效关系。四者的DPPH 50%清除剂量分别为:VC 26.23 g ,BHT 98.60 g ，茶多酚28.41 g ，黑莓渣多酚26.88 g 。从黑莓渣中提取出的多酚类化合物清除DPPH 的能力与茶多酚及VC 相当，而远高于人工合成的抗氧化剂BHT 。4结论
本试验采用五种体外抗氧化实验模型，研究了从黑莓渣中提取出的多酚类化合物的还原能力、抑制脂
质体氧化能力及清除 OH 、O 2-和DPPH 三种自由基的能力以评价其抗氧化性。结果表明，从黑莓渣中提取出的多酚类化合物有较强的还原能力，能够抑制脂质体过氧化，有清除 OH 、O 2-和DPPH 自由基的活性。而且在各个体系中，从黑莓渣中提取出的多酚类化合物的抗氧化活性与其浓度之间均有良好的量效关系。因此，黑莓渣提取物具有良好的抗氧化活性，可进一步研究开发为抗氧化功能性食品。
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