成永忠;姜慧琳;金红艳
【摘 要】目的 探讨PKM2对鼻咽癌细胞增殖、凋亡、糖酵解及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响.方法 检测鼻咽上皮细胞(NP69)和鼻咽癌细胞(CNE-1、5-8F、HONE-1)中PKM2的表达水平.HONE-1细胞转染PKM2 siRNA1、PKM2siRNA2,采用RT-qPCR和Western blot检测干扰效果.细胞增殖、凋亡及细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平,同时检测细胞ROS水平、HK活性、ATP含量和培养液上清中乳酸含量.结果 鼻咽癌细胞中PKM2表达水平高于NP69细胞,且HONE-1细胞中PKM2 mRNA和蛋白水平最高,选用HONE-1细胞继续研究.转染PKM2 siRNA1、PKM2 siRNA2后均能够下调HONE-1细胞中PKM2水平,且PKM2 siRNA2下调效果较好.转染PKM2 siRNA2后的细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3水平、Cleaved Caspase-9水平、ROS水平明显升高,而细胞增殖活性、HK活性、ATP含量和上清液中乳酸含量明显降低(P＜0.05).结论 下调鼻咽癌细胞中PKM2表达可以抑制鼻咽癌细胞糖酵解和增殖,诱导鼻咽癌细胞凋亡. 【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】吸波2018(034)009
【总页数】5页(P1000-1004)
【关键词】鼻咽肿瘤;增殖;凋亡;糖酵解;PKM2
【作 者】成永忠;姜慧琳;金红艳
【作者单位】中国质量万里行武汉市普仁医院肿瘤科,武汉430081;武汉市普仁医院肿瘤科,武汉430081;武汉市普仁医院肿瘤科,武汉430081
【正文语种】中 文
【中图分类】R735.4
鼻咽癌发病隐匿、不易察觉，因其与鼻窦、颅内等相邻，临床症状各异，研究鼻咽癌的发病机制，寻有效的靶基因鼻咽癌成为目前的热点[1]。肿瘤细胞有着与正常细胞不同的能量代谢途径，不论是常氧还是乏(缺)氧状态下都优先以糖酵解为主要供能方式[2]。研究表明，PKM2参与肿瘤细胞的生长、凋亡、糖酵解等过程，在肝癌、膀胱癌等多种肿瘤
组织中表达上调[3-5]。目前对于PKM2在鼻咽癌细胞生长、凋亡、糖酵解中的作用尚不明确，本文通过探讨PKM2对鼻咽癌细胞的作用，为研究鼻咽癌的发病机制奠定基础，为靶向基因鼻咽癌提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料 鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞CNE-1、5-8F、HONE-1；CNE-1、5-8F、HONE-1细胞购自美国ATCC公司。二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)法活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒、RNA提取试剂盒为美国Sigma公司产品；己糖激酶(hexokinase, HK)活性检测试剂盒为上海铭博生物公司产品；一抗Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9均购自于美国Abcam公司；ATP含量测定检测试剂盒购自于北京索莱宝公司；PKM2小干扰RNA1(PKM2 siRNA1)、PKM2小干扰RNA2(PKM2 siRNA2)和小干扰RNA阴性对照(siRNA-control)由上海吉凯公司合成。
1.2 RT-qPCR检测PKM2在鼻咽癌细胞中的表达 用RNA提取试剂盒提取鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞CNE-1、5-8F、HONE-1细胞中的RNA，逆转录合成cDNA，荧光定量PCR，以GAPDH为内参，分析PKM2水平。引物：PKM2上游5′-ATTATTTGAGGAACTCC
GCCGCCT-3′，下游5′-ATTCCGGGTCACAGCAATGATGG-3′；GAPDH上游5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。
1.3 Western blot检测PKM2在鼻咽癌细胞中的表达 提取鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞CNE-1、5-8F、HONE-1的细胞蛋白。100 V恒压凝胶电泳。100 V电压转膜。5%牛血清白蛋白封闭，与1 ∶800稀释PKM2一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗结合以后，ECL显，Image Pro Plus 6.0分析目的条带与GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的相对表达水平。
1.4 细胞分组及转染 HONE-1细胞分为Control、siRNA-NC、PKM2 siRNA1、PKM2 siRNA2，其中PKM2 siRNA1、PKM2 siRNA2为转染PKM2 siRNA1和PKM2 siRNA2的HONE-1细胞，siRNA-NC为转染siRNA-control的HONE-1细胞，Control为空白对照组。HONE-1细胞转染步骤参照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明。细胞转染后培养24 h，分别用RT-qPCR和Western blot检测细胞中PKM2水平，步骤同1.2和1.3。
1.5 CCK-8检测细胞增殖 Control、siRNA-NC、PKM2 siRNA2细胞接种至96孔板，分别在培养24、48、72 h取出细胞培养板，添加CCK8溶液，酶标仪检测每孔450 nm的A值。实
验重复3次，取均值。
1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 Control、siRNA-NC、PKM2 siRNA2细胞培养72 h，加入PI和Annexin V-FITC各5 μL，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。同时用Western blot检测细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表达水平，步骤同1.3。实验重复3次，取均值。
1.7 DCFH-DA法检测ROS水平 Control、siRNA-NC、PKM2 siRNA2细胞培养72 h以后，收集细胞培养液上清和细胞，检测细胞中的ROS水平，步骤参照ROS检测试剂盒(DCFH-DA法)，用乳酸含量检测试剂盒检测上清中乳酸水平，HK活性检测试剂盒检测细胞中HK活性，ATP含量检测试剂盒检测细胞中ATP水平。
1.8 统计学分析 所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料用表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
外师造化中得心源
2.1 PKM2在鼻咽癌细胞中的表达 鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞CNE-1、5-8F、HONE-1中PKM2 mRNA水平分别为：1.00、1.50±0.22、2.38±0.19、3.29±0.17，蛋白水平分别为：0.16±0.04、0.36±0.03、0.51±0.06、0.65±0.07。NP69和CNE-1、5-8F、HONE-1细胞中PKM2 mRNA和蛋白水平比较差异有统计学意义(FmRNA=107.629，PmRNA<0.001；F蛋白=48.073，P蛋白<0.001)。CNE-1、5-8F、HONE-1细胞中PKM2 mRNA和蛋白水平明显高于NP69细胞(tmRNA-1=3.637，tmRNA-2=10.038，tmRNA-3=16.657，t蛋白1=4.671，t蛋白2=8.174，t蛋白3=11.444，P均<0.05)。5-8F、HONE-1细胞中mRNA水平和蛋白水平明显高于CNE-1细胞(tmRNA-1=6.401，tmRNA-2=13.020,t蛋白1=3.503,t蛋白2=6.773，P均<0.05)。HONE-1细胞中mRNA和蛋白水平均明显高于5-8F(tmRNA=6.619，t蛋白=3.270，P<0.05)。PKM2在HONE-1细胞中的表达水平最高，因此选用HONE-1细胞进行后续实验。上述实验结果提示PKM2在鼻咽癌细胞中表达上调(图1)。
图1 Western blot检测PKM2在鼻咽癌细胞CNE-1、5-8F、HONE-1和鼻咽上皮细胞NP69中的表达
2.2 转染后细胞中PKM2的表达水平 Control、siRNA-NC、PKM2 siRNA1、PKM2 siRNA2细胞中PKM2 mRNA水平依次为：1.00、0.99±0.06、0.55±0.07、0.31±0.07，蛋白水平依次为：0.93±0.06、0.95±0.03、0.37±0.08、0.17±0.06。四组细胞中PKM2 mRNA和蛋白水平比较差异有统计学意义(FmRNA=103.903，F蛋白=129.407，P均<0.001)。PKM2 siRNA1、PKM2 siRNA2细胞中mRNA和蛋白水平明显低于Control组(tmRNA-1=9.522，tmRNA-2=14.601，t蛋白1=11.392，t蛋白2=15.460，P均<0.05)。PKM2 siRNA2细胞中mRNA水平和蛋白水平明显低于PKM2 siRNA1组(tmRNA=5.079，t蛋白=4.068，P均<0.05)。PKM2 siRNA1较PKM2 siRNA2干扰效率高，后续选用PKM2 siRNA2继续实验(图2)。
图2 Western blot检测PKM2在转染后细胞中的表达
2.3 PKM2表达下调抑制鼻咽癌细胞增殖 Control、siRNA-NC、PKM2 siRNA2细胞在0 h的A值依次为：0.25±0.03、0.24±0.04、0.24±0.06，24 h的A值依次为：0.47±0.06、0.46±0.04、0.32±0.04，48 h的A值依次为：0.84±0.07、0.86±0.06、0.48±0.06，72 h的A值依次为：1.14±0.07、1.10±0.12、0.57±0.05。三组细胞在0 h的A值比较差异无统计学意
义(F0 h=0.049，P0 h=0.952)，三组细胞在24、48、72 h的A值比较差异有统计学意义(F24 h=9.309，P24 h=0.015；F48 h=34.017，P48 h=0.001；F72 h=41.974，P72 h<0.001)。PKM2 siRNA2组细胞在24、48、72 h的A值明显低于Control组(t24 h=3.859,t48 h=6.943,t72 h=8.189，P均<0.05)。siRNA-NC组细胞在24、48、72 h的A值与Control组相比差异无统计学意义(t24 h=0.257、t48 h=0.386、t72 h=0.575，P>0.05)。上述结果提示PKM2 siRNA2抑制鼻咽癌细胞增殖(图3)。
图3 各组细胞的生长曲线四川卫视两天一夜
与Control组相比，aP<0.05，eP>0.05
2.4 下调PKM2促进鼻咽癌细胞凋亡 Control、siRNA-NC、PKM2 siRNA2细胞凋亡率依次为：(7.37±1.11)%、(6.94±1.52)%、(22.72±2.42)%，Cleaved Caspase-3水平依次为：0.18±0.02、0.19±0.04、0.89±0.08，Cleaved Caspase-9水平依次为：0.13±0.06、0.14±0.02、0.99±0.13(图5)。三组细胞的凋亡率、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9水平比较差异有统计学意义(F凋亡率=77.373，P凋亡率<0.001；FCleaved Caspase-3=177.536，PCleaved Caspase-3<0.001；FCleaved Caspase-9=104.943，PC
leaved Caspase-9<0.001)。PKM2 siRNA2细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9水平明显高于Control组(t凋亡率=10.621、tCleaved Caspase-3=16.433、tCleaved Caspase-9=12.619，P<0.05)。上述结果显示PKM2 siRNA2可诱导鼻咽癌细胞凋亡。
