Chinese Journal of Tissue Engineering Research ｜Vol 25｜No.25｜September 2021｜4013
陆定贵，姚顺晗，唐乾利，唐毓金
文题释义：
骨髓间充质干细胞归巢：骨髓间充质干细胞是一种多能成体干细胞，主要存在于骨髓腔干骺端，在适宜条件下可分化为软骨细胞、血管内皮细胞等。软骨损伤修复过程需要有足够数量骨髓间充质干细胞归巢到损伤区域。
巨噬细胞移动抑制因子：是一种表达于多种类型细胞的细胞因子，主要作为细胞间的通讯载体，在细胞间传递生物活性脂质、核酸和蛋白质。巨噬细胞移动抑制因子表达改变与多种疾病相关，趋化实验显示膀胱癌细胞系在体外通过CXCL2/MIF-CXCR2信号通路诱导肿瘤细胞迁移。前期研究中，课题组发现膝关节软骨急性损伤后关节液及软骨组织内巨噬细胞移动抑制因子含量升高。 摘要
背景：软骨缺乏血管、神经，自我修复能力有限。青年人的软骨修复主要方法有软骨下骨钻孔术、微骨
折术，其目的是打通软骨下骨板，使骨髓腔受到炎症刺激从而动员骨髓间充质干细胞归巢到损伤区域分化为软骨细胞、成纤维细胞，从而发挥修复作用。微骨折术后的软骨生长取决于损伤区归巢干细胞的数量，因此，提高干细胞归巢数量可提高手术成功的机会。目的：探讨巨噬细胞移动抑制因子对骨髓间充质干细胞归巢软骨急性损伤的影响。
方法：由人股骨骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞，并检测其分化为软骨细胞的能力。采用免疫组化方法测定骨髓间充质干细胞和成软骨细胞的CXCR2表达，采用细胞划痕实验探讨巨噬细胞移动抑制因子对骨髓间充质干细胞迁移动力学的影响。制作大鼠急性膝关节软骨损伤模型，造模后第1，2，3天关节内注射巨噬细胞移动抑制因子，造模后第7天采用免疫化学荧光染和流式细胞术检测损伤区域PECAM-1阳性细胞(血管内皮细胞)数量，采用DAPI 染检测损伤区域单核细胞数量。
结果与结论：①骨髓间充质干细胞表面标记物CD166、CD29阳性，CD34阴性；②骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞后CXCR2抗体表型退化、消失，而Ⅱ型胶原抗体表型呈阳性；③巨噬细胞移动抑制因子可促进骨髓间充质干细胞迁移，阻断CXCR2受体后巨噬细胞移动抑制因子促进骨髓间充质干细胞迁移的作用被抑制；④在动物模型中，DAPI 染结果提示巨噬细胞移动抑制因子组损伤区有核细胞数明显高于对照组，免疫化学荧光染及流式细胞术显示巨噬细胞移动抑制因子组修复损伤区域PECAM-1阳性细胞明显高于对照组；⑤以上结果表明，巨噬细胞移动抑制因子可促进骨髓间充质干细胞归巢修复急性软骨损伤。
关键词：干细胞；骨髓间充质干细胞；巨噬细胞移动抑制因子；膝关节；软骨损伤；细胞归巢
缩略语：骨髓间充质干细胞：bone mesenchymal stem cell ，BMSCs ；巨噬细胞移动抑制因子：macrophage migration inhibitory factor ，MIF
Macrophage migration inhibition factor promotes bone marrow mesenchymal stem cells homing to repair acute knee cartilage injury
Lu Dinggui, Yao Shunhan, Tang Qianli, Tang Yujin
Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
/10.12307.2021.013 投稿日期：2020-09-02送审日期：2020-09-04采用日期：2020-10-16在线日期：2020-12-31中图分类号： R446；R496；R318文章编号：
2095-4344(2021)25-04013-06文献标识码：B
右江民族医学院附属医院，广西壮族自治区百市 533000
第一作者：陆定贵，男，1983年生，2020年暨南大学毕业，博士，副主任医师，主要从事创伤骨科疾病的预防与研究。通讯作者：唐毓金，博士，主任医师，右江民族医学院附属医院，广西壮族自治区百市 530021/0000-0003-2298-6598(陆定贵)
基金资助：广西高校中青年教师基础能力提升项目(2018KY0449)，项目负责人：陆定贵；广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研项目(Z20170243)，项目负责人：陆定贵；百市科学研究与技术开发计划项目(20170512)，项目负责人：陆定贵；广西重点研发项目(桂科A18050008)，项目负责人：唐毓金
引用本文：陆定贵，姚顺晗，唐乾利，唐毓金. 巨噬细胞移动抑制因子促进骨髓间充质干细胞归巢修复急性膝关节软骨损伤[J].中国组织工程研究，2021，25(25):4013-4018.
研究原著
人股骨骨髓液SD 大鼠膝关节软骨急性损伤模型
间充质干细胞
巨噬细胞移动抑制因子膝关节注射
(1)细胞表型鉴定；
(2)成软骨分化诱导鉴定；(3)巨噬细胞移动抑制因子干预后划痕实验。
免疫化学荧光染
DAPI 染流式细胞仪检测
Research Article
0 引言 Introduction
关节软骨缺乏血管、神经，自我修复能力有限[1]。临床发现> 3 mm的缺损，无法完成透明软骨修复[2]。青年人的软骨修复方法主要是软骨下骨钻孔术，其目的是打通软骨下骨板，通过炎症作用刺激骨髓腔里的骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)和炎症细胞趋化、定植于损伤区[3]。
BMSCs在适宜条件下分化为软骨细胞、成纤维细胞，从而发挥修复作用[4]。组织修复过程需要有足够数量细胞归巢到靶组织，然而不论是外源还是骨髓迁移途径，仅有少量移植细胞能到达靶组织且早期凋亡率极高[5-7]。因此，如何调控细胞的归巢效能，使其发挥分化、抗炎、修复作用，需要基础研究进一步挖掘[8]。
巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种表达于多种细胞类型的细胞因子，主要作为细胞间的通讯载体，在细胞间传递生物活性脂质、核酸和蛋白质[9]。MIF表达改变与多种疾病相关，从炎症性疾病如败血症、狼疮和类风湿关节炎，到器官病变如心力衰竭、心肌梗死、急性肾损伤和一些恶性肿瘤[10-12]。MIF在癌细胞浸润过程中扮演着重要的角[12]，MIF可在癌微环境中诱导肿瘤细胞积累和扩展。体外趋化实验显示，MIF通过CXCL2/ MIF-CXCR2信号通路诱导多种肿瘤细胞迁移。因此CXCL2/ MIF-CXCR2轴是肿瘤细胞招募的重要中介，是肿瘤患者的预测因子和潜在靶点[13]。
目前，已知MIF对单核细胞、T细胞和B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞有明显趋化迁移作用[15]，但MIF对BMSCs是否具有趋化作用尚无相关研究。GALVAO等[14]发现急性痛风小鼠模型建立早期膝关节中的MIF蛋白水平明显升高，而KITAYAM等[15]研究人员发现MIF基因缺陷小鼠发生膝关节内侧副韧带损伤后自我修复能力降低，表现出组织肥大增生、血管和细胞形态畸形。由此，课题组假设MIF蛋白对急性膝关节损伤的早期修复有积极作用。作者前期研究发现软骨损伤后的关节滑液和软骨
组织内MIF表达明显升高，该研究拟通过细胞和动物实验探讨MIF蛋白是否有效调控BMSCs向急性软骨损伤区域迁移发挥修复作用。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计对比观察实验。
1.2 时间及地点实验于2019年1至12月在右江民族医学院实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法从人股骨骨髓液中分离提取骨髓间充质干细胞，股骨骨髓液来源于在右江民族医学院附属医院进行全髋关节置换的患者，年龄为40-65岁，均征得患者知情同意，并经过右江民族医学院伦理委员会的批准。
1.3.2 实验动物 8周龄 SD大鼠16只，雌雄不限，由右江
Lu Dinggui, MD, Associate chief physician, Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Corresponding author: Tang Yujin, MD, Chief physician, Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Abstract
BACKGROUND: Cartilage lacks blood vessels and nerves, so its ability to repair itself is limited. The main method of young people’s cartilage repair is subchondral bone drilling and microfracture surgery. The purpose is to open up the subchondral bone plate and make bone marrow mesenchymal stem
cells home to the injured area. Bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into chondrocytes and fibroblasts to play a repair role. The growth rate
of cartilage after microfracture surgery depends on the number of stem cells in the injured area. Therefore, increasing the number of stem cells homing can increase the chance of successful surgery.
OBJECTIVE: To explore the effect of macrophage migration inhibition factor on bone marrow mesenchymal stem cells homing treatment of acute cartilage injury.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were obtained from the bone marrow of the human femur, and then cultured. The ability of bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into chondrocytes was tested. The CXCR2 receptor expression of bone marrow mesenchymal stem cells
钱基博
and chondrocytes was measured by immunohistochemical method. The effect of macrophage migration inhibition factor on the migration kinetics of bone marrow mesenchymal stem cells was investigated by cell scratch test. A rat model of acute knee articular cartilage injury was made, and macrophage migration inhibition factor was injected intra-articularly at 1, 2, and 3 days after model establishment. Immunofluorescence staining and flow cytometry were used to detect the number of PECAM-1 positive cells (vascular endothelial cells) in the injured area, and DAPI staining was used to detect the number of monocytes in the damaged area.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The surface markers of bone marrow mesenchymal stem cells were positive for CD166, CD29, and negative for CD34. (2) The CXCR2 antibody phenotype degenerated and disappeared after bone marrow mesenchymal stem cells differentiated into chondrocytes, while the phenotype expression of type 2 collagen antibody was positive. (3) Macrophage migration inhibition factor could promote the migration of bone marrow mesenchymal st
em cells. After blocking the CXCR2 receptor of bone marrow mesenchymal stem cells, the effect of macrophage migration inhibition factor on promoting the migration of bone marrow mesenchymal stem cells was inhibited. (4) In animal models, the results of DAPI staining indicated that the number of nucleated cells in the injured area of the macrophage migration inhibition factor group was higher than that of the control group. Immunofluorescence staining and flow cytometry showed that the number of PECAM-1 positive cells in the repaired area of the macrophage migration inhibition factor group was higher than that of the control group. (5) The above results show that overexpression of macrophage migration inhibition factor promotes bone marrow mesenchymal stem cells to homing and repair acute cartilage damage.
Key words: stem cells; bone marrow mesenchymal stem cells; macrophage migration inhibition factor; knee joint; cartilage injury; cell homing
Funding: Basic Ability improvement Project of Young and Middle-Aged Teachers from guangxi Colleges and Universities, No. 2018KY0449 (to LDg); Self-Financing Scientific Research Project of health and Family Planning Commission of guangxi Zhuang Autonomous Region, No. Z20170243 (to LDg); Scientific Research and Technology Development Plan Project of Baise City, No. 20170512 (to LDg); guangxi Key Research and Development Project, No. A18050008 (to TYJ)
How to cite this article: LU Dg, YAo Sh, TANg QL, TANg YJ. Macrophage migration inhibition factor promotes bone marrow mesenchymal stem cells homing to repair acute knee cartilage injury. Zhongguo Zuzhi gongcheng Yanjiu. 2021;25(25):4013-4018.
4014｜中国组织工程研究｜第25卷｜第25期｜2021年9月
民族医学院实验动物中心提供，许可证号SCXK(桂) 2014-0002。
1.3.3 实验用主要仪器与试剂低糖、高糖DMEM培养液(Hyclone，USA)；间充质干细胞培养基(ScienCeU，USA )；小牛血清去蛋白液、胰蛋白酶消化液(奥德金公司，中国)；CD166抗体、CD29抗体、CD34抗体、PECAM-1抗体(英国Abcam公司)；Ⅱ型胶原蛋白免疫抗体(上海倍卓生物科技有限公司)；CXCR2拮抗剂(北京百奥莱博科技有限公司)；DAPI染液(南京森贝伽生物公司)；rh-MIF(北京碧橙蓝生物公司)；倒置相差显微镜(LEICA DMI 3000 B，Germany)；Aria II型流式细胞仪(BD，USA)；Light Cycler@480实时荧光定量PCR仪(Roche，Switzerland)；紫外凝胶成像系统(UVe BioSpectrum，USA)；PCR仪(Applied Biosystems 2720，USA)；Mini-PRO TEAN Tetra电泳槽、电泳转印槽及电源(Bio-Rad，USA)。
1.4 实验方法
1.4.1 BMSCs提取与培养将获取的骨髓液5 mL用等体积的PBS稀释，随后再加入等体积的密度梯度分离液；将液体注入50 mL无菌离心管后离心，出现明显分层后小心吸取白膜层细胞到15 mL洁净离心管中，用5 mL PBS或细胞清洗液重悬细胞，低速离心弃去上层血水和血浆液，取离心管底部沉淀物，用L-DMEM培养基重悬细胞，按1 x105/cm2的密度接种于10 cm2培养皿中，置于37 ℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养，细胞贴壁后更换新的培养液继续培养，以后每隔2 d更换细胞培养基，待贴壁细胞融合> 90%，按1∶2比例传代。化学脑中毒
1.4.2 BMSCs免疫组化法鉴定取生长状态良好的第3代BMSCs，当细胞铺满爬片达80%后将爬片置入固定透膜液于4 ℃冰箱内固定透膜20 min，取出爬片置于载玻片用内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min，小心用PBS洗去阻断剂后，按免疫组化试剂盒说明书依次滴加试剂A(蓝液体)、细胞表面标记物抗体(CD166抗体、CD29抗体、CD34抗体)、试剂B孵育，孵育后将标本晾干、盖片观察。
1.4.3 BMSCs成软骨能力检测选取生长良好的第3代BMSCs，以1×105个/孔的密度接种在6孔板上，待细胞融合达到80%，加入成软骨诱导培养基(地塞米松+体积分数为1%胎牛血清+脯氨酸+维生素C+转化生长因子β1+DMEM 高糖溶液)培养，持续诱导14 d后按供应商提供的试剂盒说明书进行甲苯胺蓝染以及Ⅱ型胶原蛋白、CXCR2免疫组化染，随后在荧光倒置显微镜下观察并拍照。
1.4.4 细胞毒性实验将第3代BMSCs以5×103个/孔接种于96孔培养板，培养24 h后更换含有不同质量
浓度MIF(0，5，10，20，40，80 μg/L)的L-DMEM培养基干预培养48 h，按MTT试剂盒说明书进行细胞毒性实验，比较各孔在490 nm 处吸光度值。
1.4.5 细胞划痕实验先用标记笔在培养皿底部背面均匀地划竖线，大约每隔5 mm画1条线，至少5条线。选取生长良好的第3代BMSCs，以1×105个/皿的密度接种在培养皿上，细胞融合达到80%时，用微量头垂直于培养皿背面的竖线划痕(注意头要垂直，不能倾斜)，PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，实验组加入无血清L-DMEM培养基+rh-MIF 20 μg/L，对照组加入无血清培养基+等量的PBS，放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱继续培养，培养后0，12，24 h时间点拍照，使用 Image J软件打开图片后，随机划取1或5条线到中线，计算3个视野下细胞数的均值，并进行两组比较。
1.4.6 CXCR2阻断后细胞划痕实验在使用rh-MIF干预前先向细胞培养皿中加入人疱疹病毒8的巨噬细胞炎性蛋白(viralmacrophage inflammatory proteins，vMIP)培养6 h从而封闭CXCR2受体，余操作与1.4.5相同。
1.4.7 大鼠软骨损伤模型的建立将16只SD大鼠随机分为MIF组及对照组，每组8只。麻醉消毒后使用直径3 mm克氏针穿刺一侧股骨远端关节面，深约3 mm直至见新鲜血液向关节腔渗出，以此作为全层软骨损伤的标志。MIF组在造模第1，2，3天，每只大鼠关节腔内注射rh-MIF(100 ng/kg)，对照组给予等量生理盐水，造模第7天收集MIF组和对照组膝关节股骨远端标本，以软骨损伤修复区为中心，取5 mm× 5 mm×4 mm的组织块，制作冰冻切片。
1.4.8 免疫化学荧光染及DAPI染免疫荧光染：用PBS/1%BSA室温封闭切片，1×PBS洗涤3次，加入一抗PECAM-1抗体作为抗原(1∶1 000)，4℃孵育过夜，1×PBS洗涤3次，加荧光标记二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，1×PBS 洗涤3次，封固，荧光显微镜下观察修复区内PECAM-1 阳性细胞数。DAPI染：冰冻切片用PBS洗3遍，然后用微量加样器加入50 mg/L的DAPI，使用倒置荧光显微镜观察修复区内细胞核蓝染数量。
1.4.9 流式细胞术收集软骨损伤修复区域组织，剪成小碎块置入试管中，加入胰蛋白酶在恒温箱中消化20-30 min，期间间断振荡吹打组织块，终止消化后收集悬液，过滤、离心，弃上清，用PBS重悬细胞，然后加入血管表皮细胞抗体(PECAM-1)进行荧光标记，上机检测PECAM-1所占细胞数比例。
1.5 主要观察指标①BMSCs表型及成软骨能力；②MIF对BMSCs爬行迁移的影响；③实验动物软骨修复区有核细胞数量；④实验动物软骨修复区PECAM-1阳性细胞数。
骨髓间充质干细胞的培养
细胞来源：人股骨骨髓液
原代培养方法：密度梯度离心法结合贴壁筛选法
基础培养基：L-DMEM培养基
添加材料：体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素
原代培养时间：原代细胞培养48 h后开始换液，之后两三天换液1次
细胞传代：细胞融合至80%-90%用胰酶消化后按 1∶2比例传代，取第3
代细胞进行实验研究
伦理学批准：实验方案经右江民族医学院动物实验伦理委员会批准(批准号
为201903018)
Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 25｜No.25｜September 2021｜4015
研究原著
1.6 统计学分析应用SPSS 19.0统计学软件，用x-±s表示计量数据，采用单因素方差分析进行组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 BMSCs培养与鉴定结果获取的BMSCs呈贴壁生长，细胞排列成集落状、漩涡状生长，间充质干细胞表面标记物CD166、CD29阳性，而造血系干细胞表面标记物CD34阴性，见图1。
2.2 BMSCs成软骨能力检测结果 BMSCs经成软骨诱导培养2周后，甲苯胺蓝染可见细胞质和细胞核呈蓝染，且强表达Ⅱ型胶原蛋白。BMSCs表达CXCR2，而经过诱导分化为软骨细胞后不再表达CXCR2受体，见图2。
2.3 生物相容性细胞毒性实验结果显示，与0 μg/L组相比，MIF在5-40 μg/L范围内显示出低细胞毒性，在20 μg/L时明显促进BMSCs活性(P < 0.05)，在80 μg/L时对BMSCs活性有抑制作用(P < 0.05)，见图3。因此，选择20 μg/L MIF进行下一步研究。
2.4 MIF对BMSCs迁移的影响细胞划痕实验表明，添加rh-MIF后，BMSCs迁移明显增快，24 h细胞迁移达到80%，而且细胞活性未见减退，而拮抗CXCR2后，细胞迁移明显受到抑制，见图4。
2.5 MIF对损伤区血管内皮细胞的影响如图5所示，关节腔内注射rh-MIF后，促进修复区PECAM-1阳性细胞生成，修复区域PECAM-1表达升高，DAPI染见修复区域有核细胞明显增多。
2.6 流式细胞仪检测损伤区血管内皮细胞比例如图6所示，关节腔内注射rh-MIF后，流式细胞仪计数显示修复组织血管内皮细胞占比明显升高(P < 0.05)。
3 讨论 Discussion
关节软骨自我修复能力较弱，主要原因之一是缺乏营养血管。有研究表明促进损伤软骨血管的发生，可促进损伤区的修复[16]，而具有多向分化潜能的BMSCs在适宜条件下可分化为软骨细胞和血管内皮细胞等[17]，因此干细胞移植软骨缺损既可直接补充软骨细胞修复软骨，又可促进滋养血管生成促进软骨修复。
目前对BMSCs的分离培养方法主要有：全血细胞贴壁筛选法、密度梯度离心法、免疫磁珠分离法及流式细胞仪分选法[18-19]，前2种方法简单易行，但分离的细胞纯度不高；后2种可获得高纯度的BMSCs，但需要专业人员操作，成本高[20]。该研究采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法获取细胞，此法获取的BMSCs生长旺盛、呈集落样生长，传代后的BMSCs高表达 BMSCs标记物CD166、CD29，而不表达造血干细胞表面标记物CD34，加入成软骨诱导培养基，BMSCs 能分化为软骨细胞。因此，密度梯度离心法结合贴壁筛选法获得BMSCs的方法简单易学，细胞纯度高。
MIF是最早发现的细胞因子之一[9]，具有多种生物学功能[21-25]。有研究发现在软骨细胞培养物中加入MIF后，Ⅱ型胶原蛋白表达增加，表明MIF可以促进软骨细胞的成熟[26]。在该研究中，课题组通过体外实验探讨MIF对BMSCs的趋化作用，实验结果显示：添加MIF干预后BMSCs迁移能力明显增强；而抑制BMSCs的CXCR2受体后，MIF促进BMSCs 迁移的能力明显被抑制，由此表明MIF蛋白可能通
过CXCL2/ MIF-CXCR2通路介导BMSCs趋化、迁移。通过动物实验探讨MIF对急性软骨损伤的修复作用，急性膝关节软骨损伤模型大鼠关节腔内注射MIF后，其损伤区单核细胞聚集明显，血管内皮细胞(PECAM-1阳性)数量显著高于对照组。微血管的形成有利于损伤软骨的修复，同时血管内皮细胞主要由间充质干细胞分化而来，其细胞数目增多则可能意味着BMSCs 归巢增多。以上数据表明MIF干预可能促进BMSCs趋化至急性软骨损伤区域发挥修复作用。白介素1
该研究发现MIF促进BMSCs的趋化和迁移，机制可能涉及MIF-CXCR2通路。有研究表明MIF激发CXCR2轴后可激活多条信号传导途径，调控细胞迁移、增殖、存活等不同的生物学效应[27-30]。例如，MIF干预能激活BMSCs自噬使其在心肌梗死后生成更多血管从而改善心脏功能和细胞生存[31]；MIF可增强BMSCs抵抗严重氧化应激的能力，从而提高移植后细胞存活率，显著抑制细胞凋亡[32-33]。目前尚未明确激发MIF-CXCR2轴后的传导途径，有待后续进一步研究。
综上所述，该研究发现MIF可能通过CXCR2通路途径促进BMSCs归巢修复急性软骨损伤。
作者贡献：实验设计为唐毓金，实验实施为陆定贵，实验评估为唐毓金、唐乾利，资料收集为姚顺晗。
经费支持：该文章接受了“广西高校中青年教师基础能力提升项目(2018KY0449)”“广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研项目(Z20170243)”“百市科学研究与技术开发计划项目(20170512)”
及“广西重点研发项目(桂科A18050008)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程不存在利益冲突。
机构伦理问题：实验方案经右江民族医学院动物实验伦理委员会批准，批准号为201903018。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
后妈的幸福生活
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。
文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。
生物统计学声明：文章统计学方法已经通过广西医科大学生物统计学专家审核。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。
开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。
4016｜中国组织工程研究｜第25卷｜第25期｜2021年9月
Chinese Journal of Tissue Engineering Research ｜Vol 25｜No.25｜September 2021｜4017
B A D
C 图注：图中A 为获取的骨髓间充质干细胞；B -
农民肺D 分别为CD34免疫组化染显示骨髓间充质干细胞CD166CD34阴性表达
图1｜免疫组化实验鉴定骨髓间充质干细胞
Figure 1｜Bone marrow mesenchymal stem cells identified by immunohistochemistry
B
A D
C 图注：图中A 为骨髓间充质干细胞成软骨诱导2周后甲苯胺蓝染，可见细胞质和细胞核呈蓝染；B 为骨髓间充质干细胞成软骨诱导Ⅱ型胶原免疫组化染，且强阳性表达；C 为骨髓间充质干细胞免疫组化染，呈阳性表达；
D 为骨髓间充质干细胞成软骨诱导CXCR2免疫组化染，未见表达
三星p30笔记本图2｜骨髓间充质干细胞成软骨检测
Figure 2｜Detection of the ability of bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into chondrocytes
1.00.80.60.40.20
490 n m 处吸光度值
0 5 10 20 40 80
MIF 质量浓度(μg/L)
a
a
ab
ac
acd
图注：MIF 在5-40 μg/L 范围内显时明显提高骨髓间充质干细胞活性充质干细胞活性有抑制作用(P < 0.05)10 μg/L 组比较，b P < 0.05，与20 μg/L 组比较，d
P < 0.05。MIF ：巨噬细胞移动抑制因子
图3｜MTT 实验分析不同质量浓度 0 h 12 h 24 h
M I F 组
MIF 组对照组
CXCR2抑制组
CXCR2抑制+MIF a
b b
图注：MIF 干预后，骨髓间充质干细胞迁移明显增强；而抑制MIF 促进骨髓间充质干细胞迁移的作用被抑制。柱状图为各组迁移面积
统计，与对照组比较，a P < 0.05，与MIF 4｜巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对骨髓间充质干细胞迁移的影响(×10)
Figure 4｜Impact of macrophage migration inhibition factor on the migration of bone marrow mesenchymal stem cells (×10)
对照组 MIF 组
对照组 MIF 组
P E C A M -1
150100500
P E C A M -1细胞计数
a
血管内皮细胞 有核细胞
对照组 MIF 组
PECAM-1
DAPI
100
80604020
细胞计数
a
a
对照组MIF 组图注：MIF 组修复区(白虚线内对照组，修复区再血管化活跃；线内)有核细胞数明显多于对照组。柱状图为各组细胞数
目统计，与对照组比较，a
P 制因子
图5｜免疫化学荧光染及内皮细胞、有核细胞数目
Figure 5｜Number of vascular endothelial cells and nucleated cells in injured cartilage detected by immunofluorescence staining and DAPI staining
图注：MIF 组修复区域的血管内皮细胞占比为
