医学临床研究2021年3月第38卷第3期J Clin Res,Mar.2O21,Vol38,No3・437・人Rh(D)血型抗原模拟表位筛选及鉴定的临床意义 张勤
(郑州颐和医院检验医学中心，河南郑州450047)
［摘要目的】探讨人Rh(D)血型抗原模拟表位筛选及鉴定的临床意义。【方法】以抗Rh(D)单克隆抗体 作为固相筛选分子，随机选取35个进行克隆.经噬菌体酶联免疫吸附测定法(ELISA)及交叉试验，确定阳性 克隆，采用蛋白石免疫印迹法(Western blot)对噬菌体行抗原性分析。【结果JDNA序列测序及竞争抑制实验
在11个克隆的噬菌体所展示的外源多肽中有4个克隆无共性.可能是非特异性结合。7个具有克隆氨基酸
序列均含有相同的脯氨酸(P)、氨酸(W)、谷氨酸(Q)结构(-WP-Q-)，超过40%的抑制率。Western blot分
析表明，被选定的噬菌体能被抗Rh(D)血清特异识别，抗原性与Rh(D)蛋白相类似。【结论】利用抗Rh(D)单
克隆抗体筛选噬菌体随机肽库，可获得具有(-WP-Q-)结构的Rh(D)抗原模拟表位。
［关键词］RhD抗原；筛选效率；序列分析；医学鉴定
帐棚
Clinical significance of Screening and Identification of Human Rh(D)Blood Group Antigen
Mimotopes ZHANG Qin(Laboratory Medicine Center,Zhengzhou Yihe Hospital,Zhengzhou
450047,China)
[Abstract J[Objective]To investigate the clinical significance of screening and identification of mimic
epitopes of human Rh(d)blood group antigen.[Methods!Anti Rh(d)monoclonal antibodies were used as sol
id phase screening molecules,and35of them were randomly selected for cloning.The positive clones were i-
dentified by phage enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and cross test.The antigenicity of phage was
analyzed by Western blot.LResultsJThe results of DNA sequencing and competitive inhibition test showed that
four of the11phages displayed foreign polypeptides had no common characteristics,which might be non-spe
cific binding.All of the seven cloned amino acid sequences contained the same structure(-WP-Q-)of proline
(P),tryptophan(W)and glutamic acid(Q),with an inhibition rate of more than40%.Western blot analysis
showed that the selected phage could be specifically recognized by anti Rh(D)serum,and its antigenicity was
similar to that of Rh(D)protein.[Conclusion]Using anti-Rh(D)monoclonal antibody to screen the phage
random peptide library
lotus培训*the Rh(D)antigen mimotope with(-WP-Q-)structure can be obtained.
[Key words]RhD Antigen；Screening Efficiency；Sequence Analysis；Medical Evaluation
[中图分类号]R457.1[文献标识码]A[doi：10.3969力.issn.l671-7171.2021.03.034][文章编号]1671-7171(2021)03-0437-04
Rh(D)血型的不融合会造成溶血病，国内外医学学者虽然在不断研究有关溶血疾病的及预防，但却没有得到较好的研究成果丄。因此目前需要探索该疾病的特异疫苗及有效的方法弘巳研究蛋白质抗原间相互作用常使用噬菌体肽库技术进行筛选，模拟表位则是指该技术能有效筛选出线性表位及与原始序列具有相似功能的构像表位。本研究通过使用Rh(D)单隆抗体筛选噬菌体随机十二肽库，依据模拟表位原理，对Rh(D)抗原进行筛选和鉴定，现将结果报道如下。1材料与方法
1.1材料选取滴度为1.5X1013PFU/mL的十二肽噬菌体展示库，采用来自美国NEB公司的大肠杆菌受体菌及随机多样性
2.7X10"转化子；选取来自华美生物技术公司的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)；选取产自德国抗Rh (D)单克隆抗体；选自来自瑞典Pharmacia公司的HRP标记的抗M13单克隆抗体.其余试剂依据实验需求进行具体配置。
1.2方法
.438・医学临床研究2021年3月第38卷第3期J Clin Res,Mar.2O21,Vol38,N q3
1.2.1生物淘洗随机肽库经过多次生物淘洗，使用抗Rh(D)单克隆抗体(100pig/mL)微孔板包被，并用2%牛血清白蛋白(BSA)为封闭。通过TBST ［150mmol/L氯化钠(NaCl),50mmol/L三轻基氨基甲烷盐酸盐(pH=7.5Tris-HCl),0.1%Tweeen-20］进行6次洗涤，并加入100m L TBST稀释的噬菌体肽库，在室温下进行1h反应，使用TBST进行10次洗涤后加入1000.2mmol/L甘氨酸-盐酸洗脱，室温下缓慢摇动9min，立即进行中和洗脱液，中和洗脱采用15piL,1mol/L Tris-HCl(pH= 9.1)。少量洗脱物进行滴度测量，将剩余的洗脱物加到20mL,l:100稀释的过夜培养物中，在37"C 剧烈摇动并进行4.5h的培养，培养物在4C6600X g进行20min离心。取上清液并加入1/6体积的聚乙二醇(PEG)/NaCI,4C环境下过夜，4C6600X g 彳亍15min离心。使用1mL TBS［50mmol/L Tros-HC1(pH=7.5),15O mmol/L NaCl］重悬，加入167“的PEG/NaCl冰上行1h孵育。4'C6600Xg行20min离心，取200“L TBS重悬。下一轮淘洗的噬菌体选用测定扩增后的滴度，计算每轮淘洗后的噬菌体产率，通过以上过程进行3次的淘洗，并将Tween-20的浓度增大。在第3轮淘选噬菌体感染ER2738后，平板中铺LB/异丙基-p-D硫代半乳糖昔(IPTG)/5-^-4-氯-3-眄|喙-卩-D半乳糖#(X-Gal)，将随机挑选的35个蓝噬菌斑接种至稀释后的ER2738夜培养物中，在37C环境下剧烈摇动培养4.5h,4C6600Xg离心10min，收集上清噬菌体液，4°C保存。噬菌体产率=100%X(洗脱的噬菌体数/用以淘洗的噬菌体数)。
1.2.2使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)鉴定噬菌体克隆使用100的50pg/ml.的抗Rh(D)单克隆抗体将微孔板进行包被，使用2%BSA进行封闭。将上述100“L噬菌体液加入后于37C下进行1h反应，使用PBST(PBS,0.5%Tween-20)行5次洗板，加入1:5000稀释的HRP标记的鼠抗体-M13抗体，室温下进行1h震荡。反复操作洗板5次后，每个孔分别加入100m L底物3,3\5,5■-四甲基联苯胺(TMB)溶液，在室温下作用10min，对450 mm处的吸光度值(A450)进行测定。观察BSA与噬菌体交叉反应的具体情况，且将2%BSA包被微孔板作为对照。
1.2.3测定并分析DNA序列依据ELISA实验结果，发行被识别为抗Rh(D)单克隆抗体的特异性克隆具有11个，提取500m L含有噬菌体的上清液，加入200的PEG/NaCl，在4C下放置10min, 6600Xg进行10min离心，沉淀物均彻底重悬于400m L碘化物缓冲液中，加入250的乙醇后在室温下温育10min,10min离心操作，沉淀物溶解于30piL TE口0mmol/L Tris-HCl(pH=&0),1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)］中。在GenBank 数据库中输入测定的结果且进行同源性对比M13噬菌体基因组。基于编码链中噬菌体PII1基因的阅读框，计算推导出与PIII蛋白融合的外源多肽序列。
1.2.4竞争抑制实验抑制率=100%X［(抑制前A450—抑制后A450)/抑制前A450］。通过100
10jzg/mL的抗Rh(D)单克隆抗体包被微孔板，用2%BSA封闭，并将游离的单克隆抗体作竞争抑制剂，加入50心抗Rh(D)单克隆抗体(100M g/mL)与50“L噬菌体(2X10“PFU/mL)混合液后进行60min的反应，行5次TBST(0.5%Tween-20)洗涤，添加稀释后的100iiL HRP-鼠抗M13抗体，检测A450。
1.2.5分析抗原性阳性噬菌体蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)依据蛋白质免疫印迹法进行，再将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，并用2%的Tween-20封闭该膜，然后在4C下与稀释后的含Rh(D)抗体的患者血清混合24 h，并用TBST洗涤，将未结合抗体添加至辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG中，并在室温下反应2h，并将3,3•-二氨基联苯胺加入至洗膜后TBST中显。2结果
2.1生物淘洗噬菌体肽库固相筛选分子选用RH
(D)单克隆抗体，通过3轮“吸附-洗脱-扩增”噬菌体十二肽库的筛选。在淘洗过程中被Rh(D)抗体捕获的噬菌体(计量单位：PFU)得到了大量富集，见表1»
表1噬菌体生物淘洗结果
2.2使用EI.1SA鉴定及检测噬菌体克隆随机选取35个在第3轮的淘洗中所得到的噬菌斑并进行扩增，通过EL1SA对上清液中噬菌体与抗Rh(D)抗体结合特性检测。20株A45O值大于0.5；通过对噬淘洗次数加入量(PFU)产出量(PFU)回收率(％)
1 2.01X1011 4.45X105 2.3X10—4
2 2.01X1011&42X106 4.21X10-3
3 2.01X1011 6.51X108 3.32X10-】
医学临床研究 2021年3月 第38卷 第3期 J Clin Res,Mar.2O21. Vol 38, W3・439・
菌体进一步的BSA 交叉反应试验，有11株BSA 反 应较弱,A450的值低于0.22，结果提示在筛选的十
二肽内可能具有单克隆抗体结合位点，见图1。
□ EUSA
■ BSA < </</•■
15
20
19
图1 11个阳性噬菌体克隆ELISA 法与BSA 交叉反应吸光度值比
较
2.3阳性克隆DNA 序列测定及编码氨基酸分析
噬菌体克隆所展示的十二肽氨基酸序列进行分析.
确定“-WP Q ”序列为氨基酸保守序列，见表2。表 中氨基酸序列各种氨基酸用英文字母大写表示(K ：
赖氨酸；Y ：酪氨酸；H ：组氨酸；S ：丝氨酸；E ：谷氨
酸丄：亮氨酸；F ：苯丙氨酸；C ：半胱氨酸；T ：苏氨酸；
A ：丙氨酸；W ：氨酸；1：异亮氨酸；P ：脯氨酸；V ：颂
氨酸；M ：蛋氨酸；Q ：谷氨酰胺；G ：甘氨酸；N ：天冬 氨酸；R ：精氨酸)。
表2
M13噬菌体展示的十二肽氨基酸序列
噬菌体克隆号
氨基酸序列
噬菌体克隆号氨基酸序列
19YSLTWPVQGHFL 3ASWPPQSVSAMV 27
SNMWPCQLWVGG 25KRSVLWTEALFE
30SWPGQLGATFER 4,20WFPWPEQANFVS
9GLFTSRSAFNLM
13
IWPAQGIVANAG
22
SLGVAGTCLPSW 15TVHALGARSCLP
2.4抗体竞争抑制实验25 »、22号、15号及9号 噬菌体克隆抑制率较低，可能是非特异性结合；20、
30、27、4、3、19及13号阳性噬菌体克隆与单克隆抗 体进行竞争抑制实验，均有40%以上的抑制率；提 示游离单克隆抗体能竞争抑制筛选肽与固相包被单 可隆抗体的反应，见图2。
(H S 5#
1 4 13
19
20
27
30
9 15 22 25
1
1匸f F
图2抗Rh(D)单克隆抗体的竞争抑制实验结果
□ ■
3 讨论
胎儿溶血疾病是与妊娠相关的临床综合征，其 主要原因是由于Rh(D)抗体所致。Rh(D)抗原蛋白 是一种具有多个糖基位点的跨膜糖蛋白，可导致新
生儿死亡。因此需要对Rh(D)蛋白抗原的结构及 功能进行研究，分析Rh(D)蛋白抗原表位的表
位"S 国外已有研究发现噬菌体肽库能用于鉴定
包括RhE 、Fya 及Fybl2等拟微球蛋白的血型抗
原⑺切。噬菌体肽库是一种体外抗原选择技术，其
有助于将融合的蛋白展示在噬菌体暴露的表面上。 本研究中，通过筛选了噬菌体肽库，以研究并模仿
Rh(D)抗原表位肽库的诊断价值。国内外据有研究
诺冠中国
表明该技术能对多种肿瘤抗原的模拟表位进行筛
选，并能筛选到多种病毒抗原，且进一步证实了有一 些表位具有较强的免疫原性，所以该技术是Rh(D) 蛋白抗原表位筛选较为可行的方法之一⑴⑷。
对噬菌体肽库中Rh(D)蛋白单克隆抗体的随 机筛选后，进行三次的淘洗，每轮均富集了特定的噬 菌体克隆，为获得具有较高亲和力及特异性的阳性
噬菌体富集，减少非特异性噬菌体克隆的富集，在操 作过程中增加了 TBST 浓度。通过结合交叉反应
及
ELISA 试验最后得出阳性克隆11个。经过测序
后，发现有7个克隆具有“-WP-Q ”共同结构，此发 现提示筛选到的短肽为构象表位，并非线性表位，进
而得出了 Rh(D)抗原的结构域。在竞争抑制实验 中证实了 7个克隆含有“-WP Q-”共同结构，且其7 个“ WP-Q ”结构与Rh(D)蛋白单克隆抗体具有
40%以上的抑制率，具有较强的特异性及结合活性, 导致抑制率较低的主要原因是由于在试验过程中加 入的并不是纯的特异性蛋白。通过对表位深入探
讨，提示其有助于研究Rh(D)血型不合溶血病 新的诊断方法及手段。在后期还应进一步对
Rh(D)抗原结构及生物学进行进一步研究。
［参考文献］
［1］ 奴云蕾.俞露，许德义，等.新的Rh 血型弱D 变异体一例［J ］.
申华医学遗传学杂志,2019,36(7):731-733.
［2］ 张宾宾，刘翔琪，董瑞，等.D 二聚体水平在肝母细胞瘤中的
临床意义探讨［J ］.申华小儿外科杂志.2018, 39(5):335-339.
［3］ 朱于莉.胡彬，韩斌.等.因妊娠产生抗-D 的Rh 部分D 型基因
分析 附3例报告［J ］.中国输血杂志,2018,31(10): 1139-
1142.
［4］ 张红玲，李苗苗.夏为书.等.88例Rh(D)阴性血妊娠晚期孕
・440•医学临床研究2021年3月第38卷第3期J Clin Res,Mar.2O21,Vol38,N q3
妇储存式自体输血的效果分析[J].重庆医学，2019,48(6)：
1055-1057.
[5]罗观文，梁栋立，洪好武，等.Rh阴性抗-D人免疫球蛋白的研
究进展[J].华西药学杂志，2019,34(2):179-182.
[6]易中梅，喻荷莲，蒋秋容，等.PDCA模式在降低ABO及RH
(D)血型初筛错误中的效果分析[J].重庆医学，2018,47(13)：
1819-1821.
[7]Wang J,Song J,Zhou S»et al.Screening and identification
of RhD antigen mimic epitopes from a phage display random
peptide library for the serodiagnosis of haemolytic disease of
the foetus and newborn[J].Blood Transfus,2019,17(1)：53-
59.
[8]张薇薇，左琴琴，毛娟•等.西安地区Rh阴性献血者抗原分布
及D变异型分子机制的研究[J].中国输血杂志,2018,31
(11):1223-1225.
[9]Wang Y,Wang Q.Wu AH,et al.Isolation of a peptide from
Ph.D.-C7C phage display library for detection of CrylAb[J].
Anal Biochem,2017
*31(2):29-32.
[10]廖昭平，徐慧英，刘春华，等.中国汉族人中发现一例Rh血
型弱D59型[J].中华医学遗传学杂志,2018,35(2):261-264.
[11]Alvise Sernicola,Irene Russo,Andrea Saponeri,et al.Bio(上接第436页)
综上所述，血清DCN水平能反映IPF患者疾病严重程度，且与IPF患者预后密切相关。
kones
[参考文献]
[1]黄任远，宋远园，殷寒秋.中性粒细胞水平对不同类型间质性
肺病的鉴别价值[J].医学临床研究,2020,37(8):1210-1212.
[2]郭治，李娜，陈媛媛.等.6分钟步行试验在评价特发性肺纤维
化病死率中的作用[J].国际呼吸杂志,2018,38(4):270-275.
[3]Cocconcelli E,Balestro E,Biondini D,et al.High-resolution
computed tomography(HRCT)reflects disease progression
in patients with idiopathic pulmonary fibrosis(IPF):rela
tionship with lung pathologyEJ].J Clin Med,2019,8(3)：
399.
[4]王伟铭•陈楠，董德长.肾组织核心蛋白聚糖和转化生长因子-
P1的表达与肾间质纤维化的关系[J]•肾脏病与透析腎移植杂
轻兵器俱乐部志，2002,11(2):124-128.
[5]Travis WD,Costabel U,Hansell DM,et al.An official A-
merican Thoracic Society/European Respiratory Society
社会调剂是什么意思
statement:update of the international multidisciplinary clas
sification of the idiopathic interstitial pneumonias[J].Am J
chip detection of BP180autoantibodies in blister fluid for the
serodiagnosis of bullous pemphigoid：A pilot study[J].
Medicine,2019,98(7)：el4514.
[12]徐晨悦，甘荣昌，张志刚，等.母亲为Rh阴性血型的重度新生
儿溶血症尸检一例[J].中华病理学杂志,2019,48(8):645-
647.
[13]Zwiers C,van Kamp I,Oepkes D,Lopriore E.Intrauterine
transfusion and non-invasive treatment options for hemolytic
disease of the fetus and newborn-review on current manage
ment and outcome[J].Expert Rev Hematol,2017,10(20):
337-344.
[14]吴筱莹，李剑平，伍昌林.等.Rh阴性孕妇产前抗-D抗体阳性
率分析[J].中国现代医学杂志,2017,27(7):50-53.
[15]周雪丽，解金辉，刘振云，等.急性白血病致Rh血型系统D抗
原减弱1例[J].中国输血杂志,2017,30(3):307-308.
口6]Arifin N,Yunus MH.Nolan TJ,et al.Identification and Preliminary Evaluation of a Novel Recombinant Protein for
Serodiagnosis of Strongyloidiasis]」].Am J Trop Med Hyg.
2018,98(4):1165-1170.
(本文编辑：詹道友)[收稿日期]2020-10-12
Respir Crit Care Med,2013,188(6):733-748.
[6]中华医学会呼吸病学分会间质性肺疾病学组.特发性肺纤维
化诊断和中国专家共识[J].中华结核和呼吸杂志，2016,
39(6):427-432.
[7]苏奕亮，翁东，周瑛，等.血清LN.W C、P DI NP.HA与特发
性肺纤维化严重度和预后的相关性[J].中华急诊医学杂志，
2018,27(2):188-193.
[8]Bensadoun ES,Burke AK,Hogg JC,et al.Proteoglycan
deposition in pulmonary fibrosis[J].Am J Respir Crit Care
Med.1996,154(6Pt1)：1819-1828.
[9]Danielson KG.Targeted disruption of decorin leads to abnor
mal collagen fibril morphology and skin fragility[J],J Cell
Biol,1997,136(3):729-743.
[10]Giri SN,Hyde DM,Braun RK,et al.Antifibrotic effect of
decorin in a bleomycin hamster model of lung fibrosis[J].
Biochem Pharmacol,1997,54(11):1205-1216.
[11]陈起航.胸部高分辨率CT新分型对特发性肺纤维化早期诊
断的影响[J].中国实用内科杂志,2018,38(11):1005-1008. [12]白艳玲.血管生成素对特发性肺纤维化预后的预测价值[J].
中华危重病急救医学，2017,29(9):789-793.
(本文编辑：邓丽萍)[收稿日期]2019-09-26
