谢帝芝;刘臻;王赏初;张建设;肖调义;鲁双庆
【摘 要】根据GenBank数据库中登记的青鱼(Mylopharyngodon picens)生长激素(bcGH)基因序列(AF389238)设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增青鱼生长激素cDNA编码区,并通过定向插入含强启动子AOX I的表达载体pPIC3.5k、电击转入毕赤酵母GS115菌株、G418多克隆子筛选和测序验证等步骤进行了重组生长激素酵母菌诱导表达等相关实验,成功获得重组生长激素酵母菌(pPIC3.5k-bcGH重组酵母菌).蛋白表达产物经SDS-PAGE和ELISA检测,在23 kD处发现一条与预期蛋白分子量大小一致的特异性条带,并且目的蛋白能与青鱼生长激素多克隆抗体特异性结合,说明bcGH在酵母胞内得到正确表达.表达条件优化过程中发现,诱导24h已有重组蛋白表达,pH值4.5 ～7.0之间都能表达重组蛋白.在pH值6.5、0.5％甲醇、温度30℃和培养时间72 h的优化条件下,目的蛋白的表达量高达893mg/L.%In order to amplify the cDNA of black carp growth hormone, the primers were designed according to the Gen Bank sequence of black carp growth hormone gene( AF389238). The black carp growth hormone (bcGH) cDNA was ori ently inserted into pPIC3. 5 k which contains AOXI promoter and Pich
ia wild-type gene coding for histidinol dehydrogenase. The recombinant plasmid pPIC3.5k-bcGH was linearized by restriction endonucleases Sal I, then transformed into HIS4 mutant yeast GS115 by electroporation, the recombinant growth hormone yeasts were certified by the screening of G418 and sequencing. SDS-PAGE and ELISA analysis showed that bcGH gene expression product appeared in intracellular solution. Under the optimization of fermentation conditions, the recombinant protein can be expressed in induction time 24 h and pH 4. 5 ~ 7.0. Under the optimized conditions of 30 ℃, pH 6. 5, fermentation time 72 hours and induced concentration 0. 5% , the yield is 893 mg/L.
【期刊名称】《淡水渔业》
【年(卷),期】2011(041)006
【总页数】6页(P19-24)
【关键词】青鱼(Mylopharyngodon picens);生长激素;毕赤酵母;表达
小学品德与社会论文
【作 者】谢帝芝;刘臻;王赏初;张建设;肖调义;鲁双庆
【作者单位】长沙学院生物工程与环境科学系,长沙410003;湖南农业大学动物科技学院,长沙410128;长沙学院生物工程与环境科学系,长沙410003;长沙学院生物技术与营养研究所,长沙410003;长沙学院生物工程与环境科学系,长沙410003;湖南农业大学动物科技学院,长沙410128;长沙学院生物工程与环境科学系,长沙410003;湖南农业大学动物科技学院,长沙410128;长沙学院生物工程与环境科学系,长沙410003;长沙学院生物技术与营养研究所,长沙410003 【正文语种】中 文
【中图分类】S917
青鱼生长激素(black carp growth hormone,bc GH)是由脑垂体前叶分泌的一种单链多肽激素,由211个氨基酸组成,分子量23 kD左右[1]，能促进鱼体生长发育,加速蛋白质的合成,促进脂类降解等[2-4]。基因工程技术和现代发酵技术实现了重组鱼类GH 体外高效表达生产。目前国内外已报道了上百种鱼类的GH基因cDNA序列被分离和克隆，其中许多种类已在细菌，藻类或动植物细胞中高效表达，其目的蛋白表现出明显促生长活性[5-7]。
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国内外研究表明，酵母对水产动物具有促生长作用，同时又可提高机体免疫，是水产动物理想的饲料蛋白质源[8-13]；毕赤酵母 (Pichia pastoris)生长周期短，易于遗传操作，亦为外源基因的理想表达受体系统[14]。因此，本研究拟将青鱼生长激素基因重组到毕赤酵母中，使之成为活性蛋白酵母，进一步提高鱼类的生长速度、增重率和免疫力，降低饲料系数和减少氮磷的排放对环境造成的污染，为研发绿、安全、高效的新型微生物渔用配合饲料奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验鱼
本实验所需要的2年龄青鱼(M.picens)购自湖南省水产科学研究所青鱼养殖场。
1.1.2 菌株和质粒
大肠杆菌DH5α和毕赤酵母GS115均购自Invitrogen公司；克隆载体PEASY-T1 Simple cloning、表达载体pPIC3.5K均购自Invitrogen公司。
1.1.3 主要药品和试剂
PCR TaqMix、T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒购自Fermentas公司；限制性内切酶购自大连宝生物工程公司；抗生素G418和酵母氮源(YNB)均购于Invitrogen公司；Ni Sepharose High Performance购于QIAGEN公司；一抗：鼠抗青鱼生长激素由中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室提供；二抗：羊抗鼠lgG购于北京成文免疫化学研究室；显底物3′3′5′5′ -四甲基联苯胺(TMB)购于北京美迪科生物技术公司；其它试剂除特别注明均为国产分析纯；引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
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1.1.4 培养基
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用于酵母表达的的YPD、MD、MM、BMGY及BMMY培养基均按照Easy select TM Pichia expression kit 方法配制。
1.2 方法
1.2.1 引物设计
根据GenBank数据库中登记的青鱼GH基因序列(AF389238)和表达载体pPIC 3.5K多克隆位点，运用Seqencer软件设计两对特异性引物(如表1)。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
表1 引物序列信息Tab.1 Sequences of the primers引物名序 列GHF5'-ATGGCT AGAGCATTAGTGCT-3'GHR5'-CTACAGGGTGCAGTTGGA AT-3'pPIC3.5K-GHF5'-GTCGAATTCACCATGGCTAGAG-CATTAGTG-3'pPIC3.5K-GHR5'-TATGCGGCCGCTTAATGATGAT-GATGATGATGCAGGGTGCAGTTGGAAT-3'
注：表中下划线标记的序列分别是EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位点。
1.2.2 青鱼GH-cDNA的克隆
按Trizol reagent说明书提取青鱼脑垂体总RNA，按以下程序进行cDNA第一链合成：1 μg/μL RNA 模板5 μL、0.5 μg/μL oligo(dT) 18引物1 μL、DEPC 处理的ddH2O 补足12 μL，65 ℃水浴5 min。简短离心立即放在冰上1 min，再依次加入5×Reaction Buffer 4 μL、40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL、10 mM dNTP Mix 2 μL、Transcriptase 1 μL，简短离心，立即
放在42 ℃水浴60 min，70 ℃终止反应5 min，准备PCR扩增。反应体系如下：cDNA 1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol MgCl2 1.5 μL，引物GHF，GHR各1 μL,10 mmol dNTP 1 μL，5 U/μL的Taq DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 16 μL；PCR 反应流程为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃ 10 min。
PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测后，经PCR纯化试剂盒纯化，然后运用TA克隆法将已纯化的目的片段快速连接到载体pEASY-T1载体上，反应体系如下：2× T4 DNA Ligase buffer 1 μL，PCR 回收产物(目的片段)1 μL，PEASY-T1载体1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，ddH2O 6 μL，室温反应5 min，再置于冰上终止反应。转入大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选，挑取白克隆扩大培养。经菌落PCR验证，将验证过的阳性克隆质粒送交上海生工测序分析。
1.2.3 pPIC3.5K-bcGH表达载体的构建
以合成的cDNA第一链为模板，用引物pPIC3.5K-GHF，pPIC3.5K-GHR进行PCR扩增。PCR体系：2×PCR TaqMix 12.5 μL，引物各1 μL，cDNA 2 μL，添加dd H2O至25 μL。PC
R扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃ 10 min。PCR产物经凝胶回收试剂盒纯化后，用EcoR I和Not I双酶切PCR产物，经酚氯仿抽提后，与同样进行双酶切且经碱性磷酸酶处理的pPIC3.5K载体片段连接，转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，菌落PCR，EcoR I和Not I双酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆进一步测序分析。将获得的阳性重组质粒命名为pPIC3.5K-bcGH。
符号图形1.2.4 pPIC3.5K-bcGH载体转化、转化子筛选及菌落检测
酵母感受态的制备参考文献[15]。pPIC3.5K-bcGH重组载体经 Sal I线性化，同时酶切空载体pPIC3.5K做对照。经电穿孔法转入GS115，电击后的酵母菌涂MD平板，30 ℃培养3～4 d。把MD平板上的pPIC3.5K-bcGH毕赤酵母转化子进行遗传霉素(G418)筛选高拷贝的阳性菌株(G418的浓度分别为1.0、2.0和3.0 mg/mL)。把在最高遗传霉素浓度的YPD 平板上生长良好的高抗性转化子通过PCR法筛选阳性转化子。
1.2.5 重组酵母诱导表达及其检测
挑取阳性酵母单菌落，接种至BMGY培养基中，30 ℃，300 r/min培养至OD600nm达到2～6,离心收菌,并重悬于BMMY培养基(pH为6.5)，30 ℃，300 r/min,培养4 d，每24 h补加终浓度为1%(体积比)的甲醇。在下列的各个时间点：0、12、24、48、72、96 h，取1 mL 培养基至1.5 mL 离心管，室温、13 000 r/min、5 min收集菌体存于-80℃用于进行SDS-PAGE分析。
