刘盼;吴仲恒;李立博;乔鸿飞;袁海峰;杜成学;张巧俊
【摘 要】目的 探索大鼠中脑双侧腹侧被盖区头端(anterior ventral tegmental area,aVTA)在抑郁行为发生机制中的作用.方法 以6-OHDA损毁aVTA模型大鼠为研究对象,采用行为学方法(旷场实验、强迫游泳实验和蔗糖偏好实验)观察术后大鼠行格数、直立次数、不动时间、蔗糖消耗百分比的变化;以TH阳性神经元计数观察损毁组大鼠双侧aVTA和SNc的DA神经元损毁程度;通过高压液相在线递质测量技术测定大鼠相关脑区DA、5-HT和NA的含量变化,并与假手术组进行比较.结果 ①损毁组大鼠的穿行格数、直立次数显著降低,不动时间显著延长,蔗糖消耗百分比显著降低,差异均有统计学意义(P值均＜0.001);②损毁组大鼠aVTA及SNc的DA能神经元数目显著减少(P值均＜0.001);③损毁组大鼠的内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex,mPFC)、纹状体(striatum,STr)、腹侧海马(ventral hippocampus,VHPC)、外侧缰核(lateral habenula,LHb)中5-HT和NA的含量明显下降(P＜0.001);STr中DA含量明显下降(P＜0.001),而mPFC、LHb、VHPC中的DA含量变化没有统计学差异(P＞0.05).结论 大鼠腹侧被盖区头端参与抑郁行为的发生,腹侧被盖区及其相关脑区单胺类神经递质的改变可能是其原因. 【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2019(040)004
【总页数】5页(P564-568)
【关键词】腹侧被盖区头端;行为学;抑郁;神经递质
【作 者】刘盼;吴仲恒;李立博;乔鸿飞;袁海峰;杜成学;张巧俊
【作者单位】西安交通大学第二附属医院康复医学科,陕西西安710004;西安交通大学第二附属医院康复医学科,陕西西安710004;西安交通大学第二附属医院康复医学科,陕西西安710004;西安交通大学第二附属医院康复医学科,陕西西安710004;西安交通大学第二附属医院康复医学科,陕西西安710004;西安交通大学第二附属医院康复医学科,陕西西安710004;西安交通大学第二附属医院康复医学科,陕西西安710004
【正文语种】中 文
【中图分类】R338.2
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种好发于中老年人的、以黑质-纹状体通路多巴胺(dopamine, DA)能神经元进行性缺失为主要病理特点的神经系统变性疾病，其非运动系统症状表现为抑郁、焦虑、睡眠紊乱、认知障碍等[1]。抑郁既可以是PD的非运动系统症状的临床表现，也是PD的一个合并症，可出现在PD诊断的前后。PD及PD相关抑郁的机制尚不明确。当PD患者出现抑郁时，往往效果不佳，因此对抑郁相关的神经生物学的研究具有重要意义。
腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)属中脑的一个脑区，位于黑质内侧、红核腹侧。基础研究中常将VTA分为头区与尾区进行研究，即腹侧被盖区头端(anterior ventral tegmental area, aVTA)和腹侧被盖区尾端(posterior ventral tegmental area, pVTA)。头尾区神经元构成不同，头区多为DA能神经元，而尾区GABA能神经元较多，故头尾区功能也存在差异。对抑郁症患者进行脑功能影像学检查发现，该类患者内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex, mPFC)、外侧缰核(lateral habenula, LHb)、纹状体(striatum, STr)、腹侧海马(ventral hippocampus, VHPC)等区域存在功能异常[2-3]，上述脑组织结构与aVTA之间又存在丰富的神经环路[4-5]。既往对于aVTA主要集中于奖赏机制的研究[6]，然而aVTA是否同样参与抑郁行为的发生鲜有报道。基于以上问题，本研究选择含DA能神经元丰富的
aVTA头端，以6-羟基多巴(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)进行损毁[7]，观察损毁后大鼠行为学变化和相关脑区单胺类神经递质的变化，进一步探索抑郁的发病机制。
1 材料与方法
1.1 动物模型建立与分组 实验动物为健康雄性SD大鼠，体质量260～320 g，由西安交通大学实验动物中心提供。大鼠在标准的饲养条件下饲养，自由摄食饮水。实验中遵守实验动物使用的相关规定，执行动物伦理学原则。大鼠被随机分为损毁组和假手术组，每组大鼠40只。
婚恋问题
模型制备：适应环境3～5 d后，用40 g/L水合氯醛麻醉(400 mg/kg, i.p.)，头部固定于脑立体定位仪上，调整耳棒使前囟两侧旁开4 mm处于同一水平线；调节门齿夹使大鼠前、后囟处于同一水平线(误差不超过0.2 mm)。备皮后，碘伏消毒头部皮肤，剪开头皮，暴露头骨，依据Paxinos-Watson大鼠脑立体定位图谱确定aVTA坐标位置：AP 5.0 mm，L±1.0 mm，D 7.8 mm，用微型电钻于一侧aVTA上方颅骨表面钻开直径约2 mm小孔；将连有玻璃微电极的10 μL微量注射器进针至aVTA坐标位置，缓慢注入6-OHDA溶液6 μg(6 mg/mL，1 μL/min)，先一侧，后另一侧。6-OHDA注射前30 min给予地昔帕明溶液(5 mg/k
g,i.p.)以保护NA能神经元。假手术组大鼠给予同体积的生理盐水(含0.2 g/L的维生素C)代替6-OHDA溶液。术后注射青霉素(8万U/只大鼠，i.p.)防止感染。
1.2 主要试剂 蔗糖(西安化学制剂厂)；6-羟基多巴、多巴胺盐酸盐、去甲肾上腺素酒石酸盐、5-HT盐酸盐、辛基磺酸钠、乙腈、三乙胺、乙二胺四乙酸(美国Sigma公司)；酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)(美国Chemicon公司)；生物素化二抗工作液、辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液(S-A/HRP)(中国中杉试剂公司)。
1.3 大鼠行为学检测 旷场实验：用来评估大鼠自发运动能力的一种行为学方法，于手术后的第4周进行。自发运动即将大鼠放置于旷场的中心，记录5 min内大鼠横穿方格数目(crossing)及用后肢站立的次数(rearing)，记录中大鼠整个身子均爬过方格方可纳入统计，其减少提示抑郁行为的改变。
蔗糖偏好：造模后第4周，大鼠单笼喂养并练习双瓶饮水24 h，期间双瓶水位置随机更换。训练完成后禁水24 h，之后同时给予水和10 g/L蔗糖溶液各1瓶，大鼠自由饮用2 h，期间双瓶位置随机更换。称量测试前后的水瓶重量来计算2 h内的液体消耗量。计算每组大鼠的蔗糖消耗百分比=糖水消耗(g)/[糖水消耗(g)+水消耗(g)]×100。蔗糖消耗降低提示快感缺乏，
这是抑郁的主要症状。
强迫游泳：强迫游泳实验同样作为抑郁行为的检测方法之一，于手术后的第4周进行，观察的主要指标是不动时间，不动时间的延长可说明研究对象的动机缺乏。实验分2天进行，第1天预实验15 min，24 h后进行5 min实验，双盲法观察大鼠5 min内的不动时间，记录每组大鼠的不动时间。
1.4 TH阳性神经元计数 采用酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)免疫染，观察6-OHDA损毁后aVTA和SNc内DA能神经元的损毁程度。行为学检测结束后，大鼠在过量麻醉下，开胸充分暴露心脏及主动脉根部，经过一系列实验方法处理后，取脑组织并放入40 g/L多聚甲醛后固定2 h，转入300 g/L蔗糖溶液至沉底。修块切片后，用于TH免疫组织化学染。显微照相系统(BX51Olympus，Olympus公司，日本)分别拍摄低倍及高倍镜下SNc、aVTA区图片，在高倍镜下观察6-OHDA注射后aVTA/SNc中DA能神经元毁损的程度，并计数大鼠aVTA和sNc区DA神经元数目，每只大鼠选取3张切片进行计数并计算其平均值，以损毁同侧占假手术组侧神经元计数百分比为统计指标。
1.5 高效液相法检测相关脑区中单胺类神经递质的含量 采用高效液相谱-电化学检测法(H
PLC-ED)(美国ESA公司)，测定两组大鼠mPFC、STr、LHb、VHPC中DA、5-HT和NA 3种单胺类神经递质的含量[8]。有线电视解码器
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1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0软件进行分析。计数资料以表示，两组大鼠行为学数据及TH阳性神经元数据均采用Paired Student’s t检验。两组大鼠mPFC、LHb和VHPC单胺类递质含量的比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
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马兰士cd60032 结 果
2.1 两组大鼠行为学特点的比较 假手术组和损毁组大鼠分别行旷场实验、蔗糖偏好实验、强迫游泳实验。结果显示，损毁组大鼠的水平运动和垂直运动减少、蔗糖消耗百分比明显降低、游泳不动时间明显延长，与假手术组对比差异有统计学意义(P<0.001，图1、图2)。
2.2 两组大鼠SNc和aVTA内DA能神经元阳性计数的比较 两组各取10只大鼠行TH染，计数各组大鼠aVTA和SNc中TH阳性神经元数量。结果显示，损毁组大鼠aVTA中的TH阳性神经元部分缺失，SNc中的TH阳性神经元亦大部分缺失，双侧aVTA损毁组同侧aVTA中的TH阳性细胞缺失程度较假手术组相比达(80±2)%，其同侧SNc中的TH阳性细胞缺失程度较假手术组相比达(85±2)%，与假手术组相比差异具有统计学意义(P<0.001，图3、图4)。
图1 假手术组和损毁组大鼠旷场实验结果
Fig.1 Histograms showing the results of the open field test
A：两组大鼠爬行格数；B：两组大鼠直立次数；与Sham组相比，*P<0.001；Paired Student’s t检验；n=10。
图2 假手术组和损毁组大鼠蔗糖偏好实验和强迫游泳实验结果
Fig.2 Histograms of the sucrose preference test and the forced swim test
A：蔗糖偏好实验；B：强迫游泳实验；与Sham组相比，*P<0.001；Paired Student’s t检验；n=10。
图3 损毁组和假手术组大鼠aVTA区TH免疫组织化学染
Fig.3 Photomicrographs of TH immune-histochemical staining in the two groups
王德彬A、C：lesioned；B、D：sham；A、B标尺：400 μm；C、D标尺：100 μm；MTN：内侧终核。
