怎样提取脐血单核细胞的（明胶法）怎样提取脐血单核细胞的（明胶法） 分离脐血单个核细胞。我们现在总结出最好的方法是按以下步骤1)先用生理盐水配3%的明胶，高压后用之前再溶化，至37度左右，与脐血等量混合，约30分钟，取上清液 2)2000rpm离心，浓宿细胞 3)用10ml离心管，加入4ml左右的Ficoll分离液后，加浓缩细胞液，2000rpm离心， 4)取中间的白膜层，即为单个核细胞此法是经过我室多种方法的比较后得出的。不会丢失单个核细胞 。 3%明胶和HES的作用应该是一样的，均可加速红细胞沉淀。明胶的作用就是沉淀大量的红细胞. 平均约50ML的脐血最终可以得到单个核细胞2X10E8个细胞这个数量级我想不管做什么实验都足够了.丢失的细胞约1X10E6,几乎不会损失. 赛宾反馈抑制器
随脐血应用范围的逐渐扩大,脐血库的建立事在必行。减小脐血体积最简单的方法是在冻存前去除红细胞。研究发现,明胶沉降法的造血祖细胞回收率较高,同时可去除超过95 %的红细胞。Pick 等[[ 8 ] Pick M, Nagler A , Grisaru D , et al . Expansion of megakaryocyte progenitors from human umbilical cord blood using a new two2step separation procedure[J ] . Br J Haematol ,1998 ,103 (3) :639 - 650. ]设计了一种新的两步法。第一步,用明胶去除大部分红细胞华安现金富利, 第二步,用Ficoll 去除残余的红细胞和中性粒细胞。结果发现,与单用明胶相比,采用明胶+ Ficoll 法在几乎完全去除红细胞的同时,对CD34 + 细胞没有太大影响,而且巨核系祖细胞得到了富集。本实 验采用这种方法效果较好第十八章 血细胞分离技术 (Separation technique of the blood cell) 一,原理在体外进行细胞免疫检测时,首先必须进行淋巴细胞的分离.分离淋巴细胞的方法很多,但不管采用哪种方法,均要求分离的淋巴细胞纯度高,产量多,而且不丧失活性,同时也要求分离技术简单,操作方便. 外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一,两类细胞的大小和密度不同,其沉降速度也就不同.红细胞的自然沉降率较快,加入高分子量的聚合物,如明胶,右旋糖酐等还可以加速其凝聚.利用自然沉降法,密度梯度离心法或二者结合,可以将淋巴细胞从血液中分离出来.这种分离出的淋巴细胞一般包括单核细胞.除去单核细胞,可以利用单核细胞的吸附功能,如铁颗粒,玻璃面或尼龙网等,除去(或分离)单核细胞,从而提纯淋巴细胞. 二,采血 (一)材料与试剂 1.抗凝剂 (1)肝素:肝素是含硫酸基的粘多糖,常用其钠盐或钾盐,它能阻止凝血酶原转化为凝血酶,进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白,从而阻止血液凝固.常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml,市售肝素多为100U~126U/mg. (2)乙二胺四乙酸(EDTA):是一种螯合剂.用生理盐水配制成4%的溶液备用. (3)阿氏液(Alsever液),配方如下: 枸橼酸钠(Na3C6H5O7·5H2O) 0.80g 枸橼酸 0.0325g 葡萄糖 2.05g 氯化钠 0.42g H2O 加至 100.00ml 混匀溶解后,114.3℃高压蒸汽灭菌10min备用. 阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂,又含有细胞生存的营养,所以它既可做抗凝剂,又可做血细胞的保存液. 2.针头 根据不同动 物和采血部位,采用不同型号的针头,用前必须灭菌或消毒. 3.采血容器 注射器或三角瓶等. 4.采血动物. (二)操作方法 1.茶杯门采血法 各种动物采血方法不一.马,牛,羊等大动物一般从颈静脉采血,猪从颈静脉,前腔静脉或耳静脉采血,家禽由翼下静脉或心脏采血,兔由心脏或耳静脉采血,犬由颈静脉或四肢静脉采血,豚鼠由心脏采血,小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血. 2.抗凝 采集血液最关键的问题是抗凝,采用什么方法进行抗凝,则根据实验的要求和条件而定.最常用的方法如下: (1)肝素抗凝:采血时,使每ml血液含15U~20U肝素即可.计算采集的血液量,按1 000U/ml的量加入肝素,直接放入采血容器中,采血时,边采血边轻轻摇动,使抗凝剂和血液混匀.对于采少量的血液或小动物采血,可直接用注射器抽取一定量的肝素液,再采血直接抗凝. (2)EDTA抗凝:采血前,用灭菌生理盐水将EDTA配制成4%溶液,然后按预采血液的量,以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液体量于采血容器内.采血,并不断摇动采血容器,使之混匀. (3)玻璃珠法:预先将适量的玻璃珠(根据采血量多少而定)清洗后,装入采血容器中,灭菌后备用.采血过程中,边采边摇采血瓶,以使小玻璃珠在血液中滚动,以机械地除去纤维蛋白,使血液不能凝固.本法虽较麻烦,但对淋巴细胞的活性影响最小,且可减少血小板的混杂. (4)阿氏液采血:以阿氏液和采血量以1∶1比例采集血液,边采边轻轻摇动采血瓶,使之混匀.用阿氏液采血,除了抗凝外,多用于红细胞的保存.一般在4℃条件下,阿氏液中保存的红细
胞2周其活性和特性不变. 三,红细胞的分离技术 (一)材料与试剂 1.肝素等抗凝剂 2.3%明胶液 取明胶3g,溶于0.9%灭菌盐水100ml中,114.3℃灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存.临用时,37℃预热10min. 3.阿氏液 (二)操作方法 1.采血抗凝,即为红细胞.由于红细胞与白细胞的比例相差悬殊,一般白细胞混杂在其中,忽略不计. 2.根据红细胞的用途,可做进一步的处理.如计算红细胞,可直接稀释计数.如需做补体结合反应,或其它溶红细胞反应,则需将红细胞进行充分的清洗,以除去附着在红细胞膜表面的血浆.一般用等渗的稀释液连续清洗,2 000r/min离心10min,重复3~4次. 3.如需储藏备用,则以阿氏液做抗凝剂采血,混匀后置4℃冰箱保存,可保存2周,其活性尚可. 四,淋巴细胞的分离技术 (一)材料与试剂 1.淋巴细胞分层液有两种: (1)聚蔗糖—泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成40±1%(W/V)水溶液,也有干粉出售.应用时,用蒸馏水配制9%溶液.泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名Vrografin,结构式为3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇.含量为60%或75%,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影.应用时,取60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺. 1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制: 9%聚蔗糖液 24份 33.9%泛影葡胺液 10份混合即可.必要时,可测比重.需要备用,可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min,4℃保存.一般可保存3个月. 如要配制不同比例的分层液,
可按下列公式计算: 式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重,V1和V2分别为它们的体积.如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液,则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为100∶46.3. (2)泛影葡胺—右旋糖酐(dextran)液 34%泛影葡胺液 10份 60%右旋糖酐液 12.5份混合,即为比重1.07～1.09的分层液.分装于棕瓶中,4℃冰箱保存备用. 2. 3%的明胶液 称取明胶3g,溶于0.9%的灭菌生理盐水,终体积100ml,114.3℃高压灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存,临用时37℃预热10min. 3.Hank's液. (二)操作方法 1.取抗凝血,自然沉降,如是马属动物的血液,可直接直立试管架上,让其自然沉降1h,取上层血浆.如是牛,羊血液,由于其血沉速度非常慢,可加等量3%明胶液,混匀后让其自然沉降,1h后取上层血浆. 2.2 000r/min离心10min,弃上清. 3.沉淀用Hank's液混悬后,再2 000r/min离心10min. 4.重复步骤3一次,再用细胞营养液将白细胞制成悬液.此液含有整个白细胞,包括粒细胞,淋巴细胞,单核细胞和部分红细胞.可供白细胞计数用. 5.取2ml细胞分层液于离心管内,同时用毛细吸管吸取约2ml的血浆(自然沉降1h的上层血浆)轻轻加入分层液上,直接加抗凝血也可. 6.以水平转子离心机2 000r/min离心20min.离心后,可见分成多层,最下层是红细胞,中间层是分层液,最上层是血浆.在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白层,即为单个核细胞层. 7.用毛细吸管插入到单个核细胞层并吸取该层,放入另一试管中. 8.
以Hank's液洗涤,离心,最后配制成适当的白细胞浓度.必要时可计数. (三)注意事项 1.血浆或血液加入分层液中时要小心,缓慢不要打乱液层,不要摇动.也可以将分层液加入到血浆的上层. 2.保持淋巴细胞的活性是非常重要的,所以一般情况下,是现采血,马上进行分离. 3.经过分层液分离的淋巴细胞层,实际上是单个核细胞层,包括单核细胞,不包括粒细胞.欲分离出纯的淋巴细胞,则按下法除去单核细胞,或收获单核细胞. 五,单核细胞分离技术 (一)铁粉吸附法 1.材料及试剂 (1)铁粉或羰基铁粉(Atomergic chemetals)99%的纯度,颗粒小于60 m(Goodfellow Metals). (2)强磁铁(马蹄形). (3)一块小棒状磁铁(约1cm长). (4)毛细吸管等. 2.操作方法 (1)称取一定量的铁粉,一般为10g,用100ml生理盐水洗涤4次,去除任何可溶性有毒物质.在倒去盐水时,用强磁铁吸住铁粉. (2)用50ml生理盐水混悬铁粉.摇匀后,分装于10个瓶中,包扎瓶口,121℃灭菌20min,拿出后立即轻轻摇匀,防止铁粉结块,储藏备用. (3)临用前,倒去瓶中的生理盐水,加入适量的单个核细胞悬液(3ml～5ml,细胞总数为8×107个/瓶).37℃温育45min,中间不时晃动,使铁粉悬浮起来. (4)加入一块小磁铁棒于瓶中,让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的细胞. (5)倒出悬液,此悬液主要是淋巴细胞,离心,收集. 在铁粉瓶内倒入一定量的Hank's液,用力振摇后,以强磁铁吸附,几分钟后,倒出液体. (7)2 000r/min离心液体,管底即为单核细胞. (二)玻璃板吸附法将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内,置37℃ 3 0 min～40min,用毛细吸管轻轻吸取悬液,即为淋巴细胞.用适量的Hank's液冲洗平皿,收获即为单核细胞悬液. 六,T淋巴细胞的分离技术 (一)原理 混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时,B细胞,浆细胞,单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上,而多数T细胞则通过尼龙毛柱,这是获得富含T细胞的有效方法. (二)材料及试剂 1.尼龙毛(Femwall Laboratories,LP-1 Leukoqak leukocyte Filters). 2.烧杯,铝箔,漏斗,一次性手套等. 3.装填尼龙毛柱,一次性注射器. 4.取自然沉降的上层血浆,过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后,获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层. (三)操作方法 1.尼龙毛的清洗与干燥 (1)戴上已经洗去滑石粉的一次性手套,将尼龙毛(1包或2包,每包35g)放入烧杯中,加入蒸馏水或去离子水,用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min. (2)冷却至常温,倒入漏斗内,使水滴干. (3)重复(1),(2)步骤6次. (4)将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内,37℃温箱干燥2～3天后,贮藏在带盖的方盘内. 2.装尼龙毛柱 (1)取50ml玻璃注射器,屠波拔去注射芯,在注射器头上套一段带夹子的胶管. (2)将尼龙毛梳理,并适当折叠,以适应注射器的直径,填入注射器内,约20ml的体积. (3)将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好,高压灭菌. 3.细胞分离 (1)将注射器固定在支架上,倒入37℃的细胞培养液,关闭阀门一定时间,然后打开阀门,放掉细胞培养液,以清洗几次尼龙毛,关上阀门. (2)将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度,约5.00×107个细胞/ml. (3)将细胞液倒
入注射器内,氧气雾化吸入使之没过尼龙毛柱.盖上注射器,37℃温育45min 至1h. (4)打开下口,缓慢放流(1滴/min),收集于离心管中. (5)离心,即获所需的T淋巴细胞. 关闭注射器下口,于注射器内加入0.85%冰冷生理盐水,振荡,并套上注射器芯,打开下口,使劲推出注射器内液体,即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞,浆细胞,巨噬细胞等. (四)注意事项 1.此种分离法,T淋巴细胞也常有一部分被吸附宝应县机关幼儿园,吸附的多少与尼龙毛的质量有关,与装柱的松紧也有关系. 2.此法的T淋巴细胞的回收率约20%～30%. 3.用过的尼龙毛可回收,以盐水洗涤,然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜,然后再同前法清洗. · ·
