张玉英1,2，李薇1，潘卫松3
1.广州市药品检验所，广东省药监局缓控释制剂质量分析重点实验室，广东 广州 510160；
2.暨南大学药学院，广东 广州 510632；
3.武汉药品医疗器械检验所，湖北 武汉 430074
人体工程学在室内设计中的应用［摘要］本文综述了近年来国内外药品杂质遗传毒性评价的进展。药品遗传毒性评价的结果直接关系到药品杂质限度的制定，各种杂质的遗传毒性评价方法的研究进展迅猛，在现阶段条件下，使用计算机预测药品杂质的遗传毒性；探索以γH2AX为代表的生物标志物检测替代传统的体内外遗传毒性检测体系；并使用斑马鱼模式动物对其遗传毒性进行验证是行之有效的杂质遗传毒性评价策略。建立从计算机预测（in silico）、体外生物标志物（in vitro）到体内验证（in vivo）的药品杂质遗传毒性评价平台，有助于建立科学的杂质控制标准，提高药品质量的科学性，药品杂质遗传毒性评价水平的提升对于建设药品关键质量属性评价平台水平意义重大。
［关键词］药品杂质；γH2AX；遗传毒性；安全性评价；综述
DOI: 10.19939/jki.1672-2809.2021.04.04
Review on the Evaluation of Genotoxcity for Drug Impurities
ZHANG Yuying1,2, LI Wei1, PAN Weisong3
1. Guangzhou Institute for Drug Control, GDMPA Key Laboratory for Quality Analysis of Sustained and Controlled Release Preparations, Guangzhou Guangdong 510160, China;
2. College of Pharmacy Jinan University, Guangzhou Guangdong 510632, China;
3. Wuhan Institute for Medical Products Control, Wuhan Hubei 430074, China.
[Abstract] This article reviews the progress in the evaluation of genetic toxicity of pharmaceutical impurities in recent years.
·综述·
基金项目：广东省药品监督管理局科研项目（2020ZDB06）
作者简介：张玉英，主任药师。研究方向：药品质量标准研究。E-mail：*******************
主要依靠多次重复测算来设置，如何合理设置阈值得深入探讨。
综上所述，建立预测模型，挖掘康艾注射液ADR发生特点、影响因素关联性，有助于科学客观地解读中药注射剂ADR发生规律，为临床合理使用、安全使用中药注射剂提供参考，为药品上市后再评价提供数据支持。
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收稿日期：2021-01-15……定稿日期：2021-02-11
杂质是指在药品生产、运输、贮藏等过程中产生或引入影响药物纯度的物质。遗传毒性是指遗传毒性物质中任何有害变化引起的毒性，而不考虑诱发该变化的机制，又称为基因毒性。遗传毒性杂质（genotoxic impurities，GTIs）是指能引起遗传毒性的杂质。《中国药典》2020年版四部中专门收录了“遗传毒性杂质控制指导原则”［1］。遗传毒性杂质是药品中很特殊的一类杂质，系特指有着重大安全风险，极微量水平即能诱发DNA突变的杂质。因此药品质量标准的科学性和监管要求都对杂质的遗传毒性评价和限度控制提出了很高的挑战。
1 药品杂质控制的法规依据
人用药品注册技术要求国际协调会（international conference on harmonization，ICH）颁布的原料药、制剂杂质研究指导原则（ICH Q3A，ICH Q3B），残留溶剂研究指导原则（ICH Q3C），元素杂质研究指导原则（ICH Q3D） 和遗传毒性杂质研究指导原则［assessment and control of dNA reactive（Mutagenic）Impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk, ICH M7］是指导创新化学药物研发中杂质研究的指南性文件［2］。《中国药
典》自2005年版起，附录中设有“药品杂质分析指导原则”，2020年版四部收录了“遗传毒性杂质控制指导原则”。从杂质来源分析，完全除去产品中的杂质，既不可能，也没有必要［3］，根据杂质风险等级，对其进行有效控制则是值得思考和探讨的。
2 药品杂质毒性评价思路
理想的“杂质谱控制（impurity profiling）”应当针对药品中的每一个杂质，依据其生理活性制定相应的质控限度［4］。通常情况下根据化学药品杂质毒性的性质, 可将其分为三类：遗传毒性杂质, 普通毒性杂质和普通杂质。
遗传毒性杂质具有重大的遗传毒性安全风险，极微量水平即能诱发 DNA 突变，是需要重点控制
的杂质，对其控制的水平直接体现了药品质量标准的水平［5］。理论上对于遗传毒性杂质的毒性评价应当使用杂质纯品, 利用体外细菌致突变试验（Ames 试验） 对其进行评估。但实际上，美国食品药品管理局（FDA） 和欧洲药品管理局（EMA） 均认可在对杂质结构进行准确鉴定的基础上利用定量结构-活性关系（QSAR）模型对其进行评价的方法，即首先通过计算机预测杂质是否具有“警示结构”。如果计算机预测该杂质不具有“警示结构”，则可判断该杂质不具有遗传毒性；如果判断该杂质具有“警示结构”，则可通过 Ames试验进行确认，若 Ames试验结果为阳性，该杂质按 MIs 控制；若为阴性，则判断其不具有遗传毒性。 对于遗传毒性杂质，需要严格根据其毒性大小控制其限
度水平；对普通毒性杂质通常需要对其是否具有特定毒性作用作进一步评估, 以便在杂质谱控制中确定是否将其作为特定毒性杂质进行控制［6］；普通杂质按照ICH指南中的一般杂质控制方法控制即可。
3 遗传毒性杂质的分类系统
美国药品研究和制造专家组（PhRMA）提出的遗传毒性杂质五级分类系统［5-6］，见图
1。
图1 遗传毒性杂质五级分类系统
The results of drug genotoxcity evaluation are of great significance to the formulation of drug impurity limits. The research on the genotoxcity evaluation methods of various impurities is progressing rapidly. Under the current conditions, it is an effective impurity genotoxcity evaluation strategy that the computer is used to predict the genotoxcity of drug impurities; while the γH2AX biomarker testing method is explored to replace the traditional and genotoxcity testing system; and then zebrafish model animals are used to verify its genotoxcity. Establishing a platform for evaluating the genotoxcity of drug impurities from computer prediction , in vitro biomarkers to verification will help establish scientific impurity control standards and improve the scientific nature of drug quality. The improvement of the evaluation level of impurity genotoxcity is of great significance to the construction of a technical evaluation platform for key quality attributes of drugs.
[Key Words] Drug impurities; γH2AX; Genotoxcity; Safety evaluation; Review
4 确定遗传毒性杂质限值的依据
确定遗传毒性杂质限值的主要参考依据是可接受摄入量。可接受摄入量的获得有化合物特异性风险评估计算、通过毒理学关注阈值（threshold of toxicological concern，TTC）计算和根据给药周期调整计算等等。化合物特异风险评估计算法主要针对有明确毒理学风险监测数据的化合物，应用该方法需要对化合物进行较为充分的毒理学风险监控；对于有致癌性数据的遗传毒性杂质，可采用啮齿类动物50%（TD50）或25%（TD25）肿瘤发生率线性外推法；对于毒-量关系不呈线性关系但存在毒性实际阈值可采用不确定因子来计算每日允许暴露量。对于无毒理学研究数据的杂质可采用TTC来计算可接受摄入量，TTC是指没有显著致癌性或其他毒性作用的化合物的可接受摄入量，通过概率的方法来控制风险［7］。此概念最早由FDA提出，主要用于食品添加剂的限度规定，限度为1.5 μg/d。通过TTC评估原料药遗传毒性杂质的限度，每天摄入1.5 μg的遗传毒性杂质被认为是可以接受的风险 。由于临床试验的持续时间不可能无限延长，且总体暴露量相对较低，故进一步引入分期TTC的概念，其基本思路是根据剂量和临床试验的持续时间对TTC进行调整，使得当临床试验剂量增加时TTC降低，持续时间较短时TTC提高。TTC的概念不能应用于强效致癌物。
TTC是以低剂量终生用药的风险而计算出来的限值，多数药物并不需要终身服用，因此可以根据药物实际的给药周期来调整计算可接受摄入量。
5 遗传毒性评价中新技术应用的进展
综上所述，药品杂质的实际遗传毒性评价数据对于制定其杂质的限度意义重大，药品杂质的遗传毒性评价是药品安全性评价的重要组成部分。系统的非临床遗传毒性评价包括鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames）、小鼠微核试验（MN）、小鼠染体畸变（CA）和彗星试验等［8-15］。由于动物实验与人体反应存在种属差异，且这些试验检测操作烦琐、耗时漫长且影响因素众多，对于药品安全评价实验室具有较高的要求。为了提高药品遗传毒性评价的效率和准确性，学界对于遗传毒性评价试验方法开展了众多有益的尝试。
5.1 直接使用对人细胞系进行遗传毒性评价
Kahaliw W等［16］使用彗星试验评估星状翼蕨（Pterolobium stellatum），整骨耳麦（Otostegia integrifolia）和扁桃核根（Vernonia amygdalina）
提取物对人肝癌细胞（HepG2）的遗传毒性作用，Çadirci K等［17］则使用人外周血培养单核细胞（PMBC）评价了利格列汀（LNG）致染体畸变的能力，Štampar M等［18］开发了HepG2三维培养细胞模型并应用彗星试验评价多环芳烃化合物的遗传毒性，结果显示新开发的HepG2 3D模型对遗传毒性检测表现出更高的灵敏度。这些试验的体内外结果相关性尚有待进一步试验数据的支持。
5.2 使用高通量高含量（HTHC）CometChip技术和基准剂量（BMD）定量方法相结合进行遗传毒性评价Seo J E等［19］使用高通量高含量（HTHC）CometChip技术和基准剂量（BMD）定量方法
相结合的方法，用28种已知具有不同遗传毒性和致癌作用模式（MoAs）的化合物对人肝癌细胞（HepaRG）和HepG2两种细胞系中DNA损伤能力进行了定量研究，并与目前的细菌或非代谢活性哺乳动物细胞系统相比，结果显示分化的HepaRG细胞比HepG2细胞具有更高水平的细胞素P450活性；采用代谢活性人类细胞的体外遗传毒性测试可能更适合于评估人类体内遗传毒性；BMD的遗传毒性效能估算值可用于定量评估CometChip分析数据。
5.3 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）在遗传毒性评价中的应用
Bhinder P等［20］以库克斯奎库斯蚊（culex quinquefasciatus）为实验模型，通过PCR-RFLP试验评估了乙酰丙酮和丙泊磷农药的遗传毒性。用杀虫剂LC20对第二龄幼虫处理24小时后根据PacI 和PsiI限制性内切核酸酶产生的限制性图谱研究线粒体16S rRNA基因序列的诱导突变。序列比对数据发现突变引起被个体基因序列的破坏和限制性位点的产生，表明两种农药均具有诱导库克斯奎库斯蚊16S基因突变的能力。
5.4 体外细胞转化检测方法替代致癌试验
评估化学物质的致癌潜力是遗传毒性评价的重要内容。由于体内致癌性研究耗时昂贵，需要使用大量动物并且不能高通量筛选，因此需要开发有效的体外细胞转化检测方法。Steinberg P［21］综述了体内外致癌性测试的方法，表明可以使用三种经过广泛评估的体外测试系统（BALB / c 3T3细胞
转化测定，Bhas 42细胞转化测定和叙利亚仓鼠胚胎测定），作为体外遗传毒性测试的备选补充方法，用于鉴定非遗传毒性致癌物，以限制需要进行体内致癌性测试化学药品的数量，从而大大减少实验动物的数量。
5.5 γH2AX的原位检测作为遗传毒性生物标志物的研究进展
γH2AX是H2AX组蛋白的139位丝氨酸被磷酸化的形式，是DNA双链被打开（DNA double-strand breaks，DSB）的标志性蛋白，在临床上曾被用于肿瘤患者的放化疗损伤监测的生物标志物，近年来被提出应用于新药研发的非临床安全性评价的生物标志物。γH2AX的诱导表达是DNA双链损伤（DDR）中最早的标志性事件，在该过程中起核心作用并诱导DNA损伤的自我修复。Kopp B［22］系统综述了对该生物标记物进行的检测结果并与不同方法检测化学物的遗传毒性进行了比较，结果表明体外γH2AX检测以及其他遗传毒性终点（Ames试验，微核，HPRT基因突变和彗星试验）评估的相关性良好（91％的可预测性）。γH2AX的分析具有灵敏、准确和高效的特点，免疫组化检测和流式细胞术都可以对其进行定量检测，既能够适用于贴壁细胞也适用于悬浮细胞的检测，对其进行定量分析能够做到自动化和连续化，可以作为遗传毒性高通量检测的分析手段，虽然尚未有法规批准γH2AX检测方法用于遗传毒性评价，但显然该生物标志物应用于遗传毒性风险评估的前景无量［23-25］。
6 杂质毒性识别判定的流程
由上可见，化学药品中毒性杂质的识别和判定一直是杂质安全性评价和限度控制的难点。一般而言毒性杂质的识别判定大致分为如下三个部分。6.1 利用计算机（in silico）预测杂质毒性
在对杂质结构进行鉴定的基础上, 可利用定量结构-活性关系（QSAR）模 型, 首先通过计算机预测杂质是否具有“警示结构”； 定量构效关系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型是借助数学模型、人工智能等计算机技术，利用化学、生物学、统计学、 毒理学等综合学科的知识，依据药物的分子结构参数来推测药物的生物活性。FDA也曾使用一系列软件对低于ICH阈值 的杂质进行相关毒性预测。QSAR预测结果同样存在假阴性结果，这可能与所选择的模型、 模型适用范围以及数据处理不当有关，也可能因为空间位阻或保护基团减轻了毒性基团的效力，导致预测结果不准确［26］。目前QSAR主要用于小分子化合物的毒性预测，对于大分子化合物（分子量大于1 000）和植物来源化合物的毒性预测尚需要进一步的方法研究与验证［27-28］。毒性功能基团空间构型的差异也能影响其在体内的毒性作用，通过计算化学方法获得药物
在水溶液中的最稳定构象，进而计算分子的空间极性表面积（topological polar surface area，TPSA），可以预测药物分子的主要毒性功能基团以及机体对不同药物分子的吸收难易。目前国内已经广泛用于计算机预测的软件有：Toxtree软件，Leadscope 软件，DRAGON软件，ADMET Predictor软件，Gastroplus 软件，Volsurf软件，Pallas软件，Derek Nexus软件，Sarah Nexus软件等，这些软件大部分已经商业化，具有相当的应用经验，可以为计算机预测提供较高可行性的技术
支撑。
6.2 体外试验（in vitro）验证杂质遗传毒性
药物杂质的毒性反应被认为与其干扰机体的正常信号通路有明确的因果关系，使得利用体外模型在分子水平上探讨化合物的毒性反应机制，进而外推其在机体中的不良反应成为可能，如前所述，γH2AX原位检测是一种有希望的高通量遗传毒性筛选测定方法并有望成为监管机构进行风险评估新的实用工具。 体外测试方法的进展将有望帮助解决将药物/杂质毒理学信息与药物临床不良反应相关联和将不良反应信息与产品质量相关联等杂质谱控制相关的难题。
6.3 体内试验（in vivo）确证杂质毒性
在对药物微量杂质的体内毒性评价方面，国内已经广泛开展利用模式生物斑马鱼进行药物胚胎毒性评价［29］，与此同时也建立起药物心脏毒性评价模型、药物肝脏毒性评价模型 、药物神经毒性评价模型、药物耳毒性评价模型和药物骨骼毒性评价模型，通过评价杂质与药物活性成分（API）的相对毒性，以评估药物杂质的危害性。以上工作为杂质谱控制中系统评估药物杂质的毒性作用, 进而制定合理的杂质限度提供了解决方案。
7 结论
在现阶段条件下，探索以γH2AX为代表的生物标志物检测替代传统的体内外遗传毒性检测体系；以计算机预测药品杂质的毒性；并使用斑马鱼模式动物对其遗传毒性进行验证是可行的，建立从计算机预测（in silico）、体外生物标志物（in vitro）到体内（in vivo）的药品杂质毒性评价平台，对建立科学的杂质控制标准，提高药品质量的安全性水平具有重要的意义，药品杂质遗传毒性评价的能力直接影响药品关键质量属性评价平台的水平。
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