(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910426726.4
(22)申请日 2019.05.22
(71)申请人 华东理工大学
四水硝酸钙地址 200137 上海市徐汇区梅陇路130号
(72)发明人 李碧璇 左鹏 叶邦策
(74)专利代理机构 上海顺华专利代理有限责任
公司 31203
代理人 顾兰芳
(51)Int.Cl.
B01J 20/24(2006.01)
B01J 20/28(2006.01)
B01J 13/02(2006.01)
B01J 20/30(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
氧氯化锆
上海市公安局长落网记C12Q 1/6806(2018.01)
C12Q 1/6851(2018.01)
(54)发明名称
球的制备方法及其应用
(57)摘要
pax本发明涉及一种基于凝胶微流控体系的磁
胶溶液与磁流体混合的悬浊液，经过超声及混合
均匀，通过在芯片中加入吐温试剂防止悬浊液粘
壁，并以适当的流速比通入分散相，使其在两相
交界面被快速均匀的切割成包含有磁流体的凝
一经融化，常温下保持溶液状态，低温冷凝后发
生溶胶-凝胶转变，可将微液滴制成微球；通过微
流控芯片制备磁性微球。本发明在生物检测、临
床医学等方面都有广阔的应用前景。权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 110292913 A 2019.10.01
C N 110292913
A
1.一种基于凝胶微流控体系的磁性琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，分散相为凝胶溶液与磁流体混合的悬浊液，经过超声及混合均匀，通过在芯片中加入吐温试剂防止悬浊液粘壁，并以适当的流速比通入分散相，使其在两相交界面被快速均匀的切割成包含有磁流体的凝胶液滴；其中凝胶为低凝胶度琼脂糖，该琼脂糖一经融化，常温下保持溶液状态，低温冷凝后发生溶胶-凝胶转变，可将微液滴制成微球；通过微流控芯片制备磁性微球；所述微流控芯片，是通过光刻将设计好的芯片通道刻制在硅片上，通过浇筑PDMS得到带有凹图形的PDMS膜，再通过与玻璃片等离子建和得到完整微流控芯片。
2.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于，所述琼脂糖溶液浓度是1～2％(重量百分比)。
3.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于，所述磁流体为Fe 3O 4磁流体。
4.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于，所述微球的直径在50μm -60μm。
5.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于，在100μL分散相经历2h可制备出约200W个包含磁流体的凝胶液滴，经冷冻后制成微球。
6.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于，微球除油清洗采用有机溶液，按照异丙醇、石油醚、乙醇顺序依次清洗，并保存于乙醇溶液中。
7.一种如权利要求1基于凝胶微流控体系的磁性琼脂糖微球的制备方法制得的微球，在血清中miRNA富集检测中的应用。
8.一种根据权利要求书7所述的应用方法，其特征在于，所述富集分离miRNA的方法包括以下步骤：
(1)磁性琼脂糖微球表面活化连接抗体富集血清中的miRNA蛋白复合体；将琼脂糖磁性微球活化用于偶联抗体，通过抗原抗体免疫反应富集血清中的miRNA蛋白复合体；
(2)通过磁铁吸附微球，将富集到的miRNA蛋白复合体从血清复杂环境中分离出来；通过高温加热将miRNA裂解出来，琼脂糖微球熔化作为底物溶液，磁流体通过磁铁收集，无须洗脱步骤。
9.根据权利要求8所述的应用方法，其特征在于，所述抗体是Ago2抗体，所富集miRNA为Ago2-miRNA蛋白复合物。
10.一种根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，miRNA检测方法是将目标miRNA 转录为cDNA后再包裹成琼脂糖液滴，通过数字液滴PCR方法进行定量。
权 利 要 求 书1/1页CN 110292913 A
一种基于凝胶微流控体系的磁性琼脂糖微球的制备方法及其女死囚犯
应用
技术领域
[0001]本发明涉及微流控及样品分离富集技术领域，尤其是一种制备磁性琼脂糖微球的方法，且可用于富集检测血清中miRNA的水凝胶微流控平台。
背景技术
[0002]血清中的RNA含量十分少，而miRNA的的含量很少，只占总RNA的一小部分，而且实际样本中成分非常复杂，蕴含的杂质含量也比较多，若是直接对血清样本的miRNA的进行检测，无法得出较为准确的结果。因此，检测实际样本的miRNA的之前，通常会进行一些操作，如分离富集，纯化等，使的miRNA的含量和纯度增加，以便于得出更准确的结论。如今市面上已有的分离富集试剂盒大都价格昂贵，并且针对的是全血总RNA，没有针对某一特定类型的miRNA富集试剂盒。并且商品化的功能性磁珠富集效率并不理想。除了通过磁珠富集以外，磁性高分子微球也是富集分离常用的一种载体。
[0003]磁性高分子微球是指通过一定的方法将磁性材料和化学、生物等高分子材料结合而形成的一种直径在纳米至微米级且具有磁响应性的高分子复合型微球。由于其粒径小，比表面积大，可偶联的生物分子容量大，且能分散在系中不易沉降，因此，他们被广泛应用在生物技术和生物医药工程方面。
最常见的即为琼脂糖磁性微球。琼脂糖是一种线性多聚物，基本结构是1,3连接的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L半乳糖交替连接起来的长链，具有多孔性、亲水性等优良特性同时又因为其多孔性，可以偶联多种功能性结构用于富集各种目标分子。然而传统的磁性琼脂糖微球制备方法包括包埋法、聚合法等。制备出的微球大都形态大小不均一。而本实验通过液滴微流控来制备，解决了上述问题。
[0004]近年来，微流控领域的研究十分繁荣，各种新技术与新应用不断涌现。液滴微流控作为微流控的重要分支，为微流控技术的研究与发展打开了一扇新的大口。液滴微流控包含互不相容的两相液体(通常为油相液体和水相液体)，利用连续相液体对分散相液体的剪切力作用，在微流通道内最快以上千赫兹的速率产生大小均一、可控、体积仅为皮升量级的微液滴。而琼指糖具有＂固－液＂转换特性。以超低凝胶点琼脂糖为例，将液态的琼脂糖注入微流控芯片并大量产生液滴后，仅需简单将其冷却至17℃下，即可将液态液滴转变为凝胶微珠。
[0005]通过本方法制备的琼脂糖微球形态美观，大小均一且直径可控。可被磁力架在3秒内迅速吸附，并且经历清洗、震荡、离心等操作依旧能保持良好的形态特征和机械性不发生形变。琼脂糖磁性微球完成富集后无需洗脱，直接通过加热利用琼脂糖溶胶的特性，转换为液态。目标分子直接包含于琼脂糖溶液中进行后续检测，Fe3O4通过磁铁吸附回收。并且所制备的琼脂糖微液滴无论在低温或者是经历PCR高温热循环后依旧能保持分散性及形态大小不发生改变。因此可以将目标分子或目标检测物包裹在单液滴中进行反应，既保证了每个液滴为一个隔离的反应器实现了高通量，又可在反应结束后经
历冷冻将液滴分离出来保存或进行各种下游分析。该琼脂糖磁性微球除了用于miRMA富集检测外，还有许多其他应用。
由于琼脂糖的生物相容性，它可以轻松的偶联各种小分子进行高效富集实验。除了与蛋白反应，该微球还可与探针、DNA适配体等多项生物分子进行偶联并用于其他生物检测分析。
发明内容：
[0006]本发明的第一个目的是提供一种基于水凝胶微流控体系的用于富集血清中miRNA 的磁性琼脂糖微球制备方法，包括以下步骤：
[0007](1)根据实验需要，设计微流控图形并打印掩膜，芯片设计为曲管十字型；[0008](2)利用光刻技术将掩膜图形刻制到硅片上，浇筑制备PDMS膜并与玻璃片键合制备完整芯片。
[0009](3)液滴芯片实验，两相优化，分散相选用1～2％，具体采用1％、1.5％、2％浓度的低凝胶度琼脂糖溶液，其中1％、1.5％能稳定制备均一液滴，1％浓度液滴冷冻成微球后易发生形变，2％浓度琼脂糖粘度过大，形成液滴大小不均一且冷冻成微球易粘连。如图2所示。因此分散相以1.5％浓度为最佳。连续相选定EM90加液体石蜡确保微球的稳定性及分散性。
[0010](4)液滴芯片实验，流速优化，确定两相流速比为1：15时液滴产生速率、大小最佳。如图3所示，
制备的液滴大小均一，并且经历高温冷冻都能保持良好的形态和分散性。[0011](5)琼脂糖溶液与磁流体经过超声，混合均匀。石蜡油中加入Tween20。在液滴产生芯片中以1:15的流速制备包含Fe3O4的琼脂糖液滴。
[0012](6)收集液滴4℃下冷冻成球，显微镜观察微球具有良好形态且分散性良好，直径均在50-60μm。
[0013](7)通过异丙醇、石油醚依次清洗，彻底除去油相及表面活性剂，磁铁吸附微球，最终保存在2％乙醇中，微球能完好保持最多2-3周。
[0014](8)超纯水清洗微球，并用NaIO4活化微球，常温反应30min。
[0015](9)清洗微球，吸附微球除去缓冲液，加入Ago2抗体与微球37℃下孵育4-6。[0016](10)清洗微球两次后换管清洗，重悬微球，与血清样本混合孵育一段时间富集miRNA-Ago2复合体。
[0017](11)磁铁吸附微球，除去上层血清溶液，将miRNA蛋白复合体从血清中分离出来。[0018](12)清洗微球后换入新管，将微球分成两部分。一部分洗脱蛋白进行WB实验验证是否富集到蛋白，一部分高温裂解释放miRNA。
[0019](13)微球融化，磁铁收集Fe3O4磁流体，miRNA通过试剂盒反转录。
[0020](14)转录完成的cDNA溶液经芯片再次包裹形成液滴，然后进行数字液滴PCR对miRNA进行定量。
[0021]本发明通过微流控芯片来制备磁性琼脂糖微球，利用凝胶溶胶-凝胶的转变的特性将芯片制备的液滴转变为微球，并对芯片及两相进行了优化以制出大小均一分散性机械性良好的琼脂糖磁性微球；制备出的微球，通过活化在其表面偶联抗体，可以特异性免疫捕获人体血清中的miRNA蛋白复合体；高温裂解出miRNA可通过芯片再次包裹成液滴采用数字液滴PCR进行定量。本发明的技术效果是通过微流控芯片能够快速高效制备大量大小均一的微球，相比与商业化磁珠，大大节约了实验成本；相比于传统的磁性琼脂糖微球制备方法，微流控方法更加快速高效无污染，制备的微球更加美观。并且由于琼脂糖天然的多孔结
构，可偶联各种功能分子，对各种生物小分子进行富集并通过磁性吸附快速分离，在生物检测、临床医学等方面都有广阔的应用前景。
附图说明
[0022]图1为液滴微流控芯片通道图及实物图。
[0023]图2从左至右依次为1％、1.5％、2％浓度分散相制备的琼脂糖微球。
[0024]图3为芯片制备的琼脂糖液滴从左至右依次在常温、冷冻、高温下的形态。[0025]图4为液滴芯片制备的磁性琼脂糖微球及乙醇溶液中保存的微球形态。(其中A芯片制备的磁性琼脂糖微球；B乙醇中保存2周的磁性琼脂糖微球)
[0026]图5为富集血清中Ago2-miRNA的Western Blot实验结果。
[0027]图6为富集并检测血清中miRNA的ddPCR实验结果。
[0028]图7为检测计算miRNA转录的cDNA拷贝数。
具体实施方式
[0029]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不为本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明步骤或条件有所修改，均属于本发明的范围。
[0030]实施例中所用仪器和试剂：低凝胶度琼脂糖(Sigma)；抗Ago2兔单克隆抗体(ab186733，Abcam，美国)；Ago2蛋白(北京义翘神州，中国)；Mir-X TM miRNA FirstStrand Synthesis(Takara，日本)；有机灌封胶(道康宁，美国)；Sample Mixer孵育器(Invitrogen公司，美国)；QX200Droplet Digital PCR(ddPCR TM)(Bio-Rad，美国)其余试剂均为常规试剂。
[0031]实施例1——富集血清中的miRNA蛋白复合物并检测miRNA
[0032]1磁性琼脂糖微球制备：
[0033] 1.1以1.5％低凝胶度琼脂糖混合Fe3O4作为分散相，超声混合均匀。液体石蜡加EM90加2％Tween20作为连续相，以1:15的流速制备包含Fe3O4的琼脂糖液滴，可以高效快速的产生大小均一的液滴。
[0034] 1.2收集液滴，4℃下冷冻成球，通过异丙醇、石油醚清洗去除油相并保存在2％乙醇溶液中。微球经清洗、震荡、离心等一系列操作后仍能保持原有形态，并且能在乙醇溶液中长时间贮存。微球在显微镜下的形态特征如图4所示，形态美观大小均一，微球直径均在50-60μm，经长时间浸泡后微球有轻微的溶胀但不影响后续使用。
[0035] 1.3用1％NaIO4活化微球表面。清洗后通过席夫碱反应连接Ago2兔单克隆抗体，37℃孵育器中反应4-6h。
[0036] 1.4使用200μL PBST缓冲液清洗微球两次，每次轻轻振荡1min，防止微球凝结，同时除去多余抗体并移入新的离心管。
[0037]2磁性琼脂糖微球富集血清中miRNA蛋白复合物并检测miRNA(微球未连接抗体进行实验作为阴性对照)
液氮机[0038] 2.1分别设置2.5mg微球加5μg抗体和5mg微球加10μg抗体两组用于富集800μL血清中的Ago2-miRNA复合体。每组两个平行样以及一组未连接抗体的空白对照。
[0039] 2.2将五组样品置于孵育器上常温孵育60min，利用磁铁吸附微球除去残余血清，
