学报
Journal of China Pharmaceutical University2021，52（4）：447-454
张文典1，崔杰2，夏一帆2，张欣2，段少峰2*
耐万古霉素肠球菌欧洲或爆发最严重难民危机（1河南大学第一附属医院，开封457001；2河南大学药学院，开封457001）
摘要合成叶酸偶联物并将其应用于叶酸靶向脂质体制备，考察其在体外肝癌HepG2细胞中的靶向性。通过酰胺反应将叶酸、胆固醇琥珀酸单酯与两种不同相对分子质量的聚氧乙烯二胺材料连接，合成两种两亲性的叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯（Folate-PEG2000-CHEMS和Folate-PEG4000-CHEMS），并利用核磁共振氢谱（1H NMR）和超高分辨率复杂体分离鉴定质谱系统对其进行了结构表征。选取钙黄绿素为模型药物，采用薄膜分散法分别利用Folate-PEG2000-CHEMS和Folate-PEG4000-CHEMS制备了钙黄绿素脂质体FA-PEG2000-L与FA-PEG4000-L。利用激光粒度仪检测FA-PEG2000-L与FA-PEG4000-L的粒径、Zeta电位；利用流式细胞仪和激光共聚焦扫描显微镜，考察了脂质体FA-PEG2000-L与FA-PEG4000-L在HepG2细胞体外摄取实验中的药物递送效果。结果显示，钙黄绿素脂质体的平均粒径为（205.8±10.2）nm，经电位测试脂质体的Zeta电位为-（1.19±0.31）m V。FA-PEG4000-L靶向脂质体的荧光强度分别约为普通脂质体、FA-PEG2000-L的3.6和3.1倍（P< 0.01），FA-PEG4000-L在HepG2细胞中的递送效率明显高于FA-PEG2000-L与非靶向组，说明Folate-PEG4000-CHEMS可应用于脂质体制备，并可促进体外HepG2细胞对脂质体的摄取。
关键词脂质体；叶酸；聚乙二醇；肝癌；细胞摄取；偶联物
中图分类号R944文献标志码A文章编号1000-5048（2021）04-0447-08
doi：10.11665/j.issn.1000-5048.20210407
引用本文张文典，崔杰，夏一帆，等.两种叶酸偶联物的合成及体外靶向性研究［J］.中国药科大学学报，2021，52（4）：447–454.
Cite this article as：ZHANG Wendian，CUI Jie，XIA Yifan，et al.Synthesis of two folate conjugates and their targeting effect in vitro［J］.J China Pharm Univ，2021，52（4）：447–454.
Synthesis of two folate conjugates and their targeting effect in vitro ZHANG Wendian1,CUI Jie2,XIA Yifan2,ZHANG Xin2,DUAN Shaofeng2*
1The First Affiliated Hospital of Henan University,Kaifeng475001;2School of Pharmacy,Henan University,Kaifeng475001,China
Abstract The aim of this study was to study the synthesis of two folate conjugates and their application in the preparation of folate targeted liposome,and to investigate their targeting effect in hepatocellular carcinoma HepG2cell line in vitro.In this study,Folate-PEG-Cholesteryl hemisuccinate(Folate-PEG2000-CHEMS and Folate-PEG4000-CHEMS)were synthesized by linking folate and cholesterol succinate with two kinds of PEG mate⁃rials.Structures of Folate-PEG2000-CHEMS and Folate-PEG4000-CHEMS were characterized by1H NMR and ultra-high resolution mass spectrometry.Calcein was selected as the model drug,and calcein liposomes FA-PEG2000-L and FA-PEG4000-L were prepared by film dispersion method using Folate-PEG2000-CHEMS and Folate-PEG4000-CHEMS,respectively.The particle size and Zeta potential of FA-PEG2000-L and FA-PEG4000-L were measured by laser particle size analyzer.The drug delivery effect of FA-PEG2000-L and FA-PEG4000-L was evaluated by cellular uptake experiment in HepG2cell line in vitro.Flow cytometry and laser confocal scanning microscope were used to determine fluorescence in HepG2cells in vitro.The results showed that the average particle size of calcein liposome was(205.8±10.2)nm,and the Zeta potential of calcein liposome was-(1.19±0.31)mV.There was no significant difference in particle size and Zeta potential between FA-PEG2000-L and FA-PEG4000-L.The fluores⁃cence intensity of FA-PEG4000-L liposome group was about3.6and3.1times higher than that of non-targeted
农业部农药检定所收稿日期2021-01-14*通信作者Tel：0371-********E-mail：sduan@henu.edu
基金项目河南省医学科技攻关计划联合共建项目资助（No.2018020306）；开封市科技发展计划项目资助（No.1903024）
学报Journal of China Pharmaceutical University2021，52（4）：447-454第52卷liposome group and FA-PEG2000-L liposome group,with statistically significant difference(P<0.01).The drug delivery efficiency of FA-PEG4000-L group in HepG2cells was higher than that in FA-PEG2000-L and non-targeted groups,and the results indicated that Folate-PEG4000-CHEMS can promote the uptake of liposome by HepG2cells in vitro.All in all,Folate-PEG4000-CHEMS could be applied in the preparation of folate targeted liposome,which could promote the uptake of liposome by HepG2cells.
Key words liposome;folate;PEG;hepatocellular carcinoma;cellular uptake experiment;conjugate
This study was supported by the Joint Construction Project of Henan Medical Science and Technology Research Project (No.2018020306);and the Program of Kaifeng Science and Technology Development Project(No.1903024)
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，由于其恶性程度高和易产生抗药性，临床常用化学药物遇到了种种困难，如药物毒性、药物分布不规则、药物溶解度小、体内半衰期短等等。研究人员一直致力于研发更为精准有效的方法，利用纳米材料靶向递送药物就是研究热点之一［1-2］。
叶酸在靶向递送系统中是一个非常具有潜力的配体。叶酸受体在大多数人体正常组织极少表达，而在多种人类肿瘤细胞例如乳腺癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、鼻咽癌等肿瘤细胞中存在过度表达，叶酸与叶酸受体具有高亲和力，因此以叶酸为靶向分子的药物递送系统可以经叶酸受体介导的细胞内吞作用而呈现出特定的靶向性。此外，叶酸也因其可应用性强、高稳定性和无免疫原性而被研究者广泛关注［3］。Yen等［4］研究发现，用叶酸修饰的金纳米粒在HepG2细胞中的摄取效率远高于无叶酸修饰的金纳米粒。Yang等［5］研究发现，由
Folate-PEG3000-PLA2000制备的叶酸靶向姜黄素胶束对MCF-7和HepG2细胞的入胞效率和体外细胞毒性显著增强。Yuan等［6］通过在石墨烯纳米复合物（GGMPN）上连接单抗P-糖蛋白（P-gp）抗体、叶酸（FA）和miR-122制备的金纳米粒子联合递送系统，具有药物靶向性和控释特性，能够显著促进耐药HepG2细胞凋亡。
脂质体作为一种经典的药物递送系统，其具有载药性能强、实用性好、生物相容性好、完全生物降解性、无毒性、无免疫原性和可以控制药物释放等众多优势，这使其在药物载体的制备中的应用备受关
注［7-9］。研究者对脂质体进行了诸多改造，研究发现利用聚乙二醇（PEG）和叶酸对脂质体表面进行化学修饰，可以使脂质体通过叶酸受体介导的内吞作用，达到靶向递送药物的目的［10］。
然而在对脂质体结构进行靶向性设计时，PEG的相对分子质量、链长、构象、覆盖度等都会对递送效率产生影响，因此在设计含PEG的配方时，需要仔细考虑这些因素［11］。为了探索能够实现肝癌靶向递送的叶酸偶联物，本研究将叶酸、胆固醇琥珀酸单酯与不同相对分子质量的PEG材料连接，合成了两种叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯
Folate-PEG-CHEMS材料（Folate-PEG2000-CHEMS和Folate-PEG4000-CHEMS），Folate-PEG-CHEMS材料的结构特点使其具有较好的稳定性和两亲性，在靶向递送药物至肝癌细胞方面的应用潜力值得探索。利用核磁共振氢谱氢谱（1H NMR）和超高分辨率复杂体分离鉴定质谱系统对终产物进行了表征。将两者应用于脂质体制备，以钙黄绿素为荧光标记，制备了钙黄绿素脂质体，通过体外细胞摄取实验评价Folate-PEG2000-CHEMS和Folate-PEG4000-CHEMS在脂质体药物递送所起到的作用。1材料
1.1药品与试剂
钙黄绿素（calcein）、胆固醇琥珀酸单酯（cho⁃lesteryl hemisuccinate，CHEMS）、聚氧乙烯二胺MW2000D（H2N-PEG2000-NH2）、聚氧乙烯二胺MW4000D（H2N-PEG4000-NH2）均购于上海阿
拉丁生化科技股份有限公司；胆固醇（cholesterol，BBI life sciences corporation）；氢化大豆磷脂（HSPC）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE-PEG2000均购置于上海艾韦特医药科技有限公司；叶酸（folic acid，FA，百灵威科技有限公司）；Sephadex G-25凝胶、CL-4B凝胶（上海源叶生物科技有限公司）；RPMI1640（美国Sigma-aldrich公司）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。
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第52卷第4期张文典，等：两种叶酸偶联物的合成及体外靶向性研究
1.2仪器
ZEN3690激光粒度仪（英国马尔文公司）；UV-2000型紫外可见分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］；超高分辨率复杂体分离鉴定质谱系统（Q Exactive Plus，美国赛默飞世尔科技有限公司）；Ziss880型激光共聚焦扫描显微镜（德国卡尔·蔡司股份公司）；CytoFLEX型流式细胞仪［贝克曼库尔特生物科技（苏州）有限公司］。
2方法
2.1叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯(Folate-PEG-CHEMS)的合成
2.1.1叶酸-聚乙二醇-胺(Folate-PEG-amine)的合成将叶酸0.06mmol溶于DMSO1mL，后依次加入EDC0.08mmol、NHS0.07mmol以及三乙醇胺34.8μL，通入氩气保护，室温避光搅拌反应约1h，加入H2N-PEG2000-NH2或H2N-PEG4000-NH2 0.05mmol，避光搅拌过夜。加入Na2CO3水溶液（50mmol/L）5mL，于20000r/min离心后去除不溶物，将剩余溶液过Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱，去除未反应的小分子副产物，纯化后的溶液冷冻干燥24h，得黄蓬松固体。
2.1.2胆固醇琥珀酸单酯活化物(CHEMS-NHS)的合成将CHEMS1mmol、NHS2mmol共溶于四氢呋喃10mL中，取DCC
3.2mmol溶于四氢呋喃5mL中，将两溶液混合后室温搅拌过夜。将反应液过滤弃滤渣，将滤液转移至梨形瓶中，35℃水浴下，减压旋蒸除尽溶剂四氢呋喃，残余物以异丙醇和四氢呋喃混合溶液溶解后重结晶，将重结晶产物真空干燥24h，得白粉状固体。
2.1.3叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯(Folate-PEG-CHEMS)的合成将Folate-PEG-amine20μmol、CHEMS-NHS50μmol共溶于氯仿50mL中，室温下避光搅拌过夜。反应结束后，35℃水浴下，减压旋蒸除尽溶剂氯仿，残余物加入NaCO3水溶液（50mmol/L）5mL，室温下水化30min，再于20000r/min离心10min后，将上清液转移入8kD透析袋于蒸馏水中透析72h纯化产物，透析后产物冷冻干燥48h，得黄蓬松固体。
2.2叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯的表征2.2.11H NMR表征分别称取FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS各5mg，以CDCl3为溶剂将产物溶解，利用核磁共振仪进行1H NMR 表征。
2.2.2质谱表征分别取适量FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS溶于甲醇1mL，过滤后，利用超高分辨率复杂体分离鉴定质谱系统分析产物，对终产物进行结构验证。
2.3脂质体的制备与表征
学周刊2.3.1钙黄绿素脂质体的制备本研究采用薄膜分散水化法制备钙黄绿素脂质体。首先合成靶向脂质体，按物质的量比55∶40∶4.5∶0.5称取HSPC/CHOL/DSPE-PEG2000/FA-PEG2000-CHEMS（或FA-PEG4000-CHEMS）置于梨形瓶中，溶于适量氯仿，置于旋转蒸发仪上，于37℃减压旋转蒸发约1h，后加入适量钙黄绿素水溶液（250mmol/L）与PBS（pH7.4），60℃水化约30min，经过450nm、220nm薄膜各5次进行整粒。以PBS（pH7.4）为洗脱剂，过CL-4B琼脂糖凝胶柱分离纯化脂质体，即得叶酸靶向钙黄绿素脂质体（FA-PEG2000-L与FA-PEG4000-L）。非靶向钙黄绿素脂质体（C-L）的制备同上，仅不加FA-PEG2000-CHEMS或FA-PEG4000-CHEMS。
2.3.2钙黄绿素浓度的测定样品中钙黄绿素的质量浓度利用紫外分光光度法计算而得，检测波长为491nm。配制质量浓度为1，2，3，5，8μg/mL 的钙黄绿素水溶液，测定各浓度吸收度，绘制标准曲线。
2.3.3钙黄绿素脂质体包封率的测定取纯化后钙黄绿素脂质体100μL，加入10%Triton X-100 100μL，超声振荡破膜，利用紫外分光光度法测定脂质体中药物含量，计算包封率（%，脂质体中药物含量/总投料量×100）。
2.3.4平均粒径、分散系数(PDI)和Zeta电位的测定取适量脂质体，用适量PBS（pH7.4）稀释后，采用激光粒度仪测定脂质体粒径、分散系数和Zeta 电位。
2.4脂质体的体外细胞摄取实验
FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS靶向递送效率通过体外细胞摄取实验来评价。2.4.1HepG2细胞的培养HepG2细胞培养瓶中加入含有1%青霉素链霉素和10%FBS的无叶酸RPMI1640培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。取处于对数生长期的细胞用于体外细
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学报Journal of China Pharmaceutical University 2021，52（4）：447-454第52卷
胞摄取实验。2.4.2
体外细胞摄取实验取对数生长期
HepG2细胞经胰酶消化为混悬状态后转移入无菌离心管中，1000r/min 离心5min ，离心后的细胞溶液弃去上清液，加入新鲜培养基，等份分装入4个无菌EP 管中。空白组不做加药处理，给药组分别加入非靶向钙黄绿素脂质体（C -L ）或靶向钙黄绿素脂质体（FA -PEG 2000-L 或FA -PEG 4000-L ），37℃下孵育1h 。孵育结束后，将细胞用冷的PBS 洗3遍以除去未结合的脂质体。利用激光共聚焦扫描显微镜或流式细胞仪检测HepG2细胞内荧光强度。2.5
统计分析
采用GraphPad Prism 5软件对实验数据进行描述性统计，计量资料结果以x ˉ±s 表示，两组之间
比较选用t 检验和方差分析，P <0.05表明差异有统计学意义。3结
果
3.1
叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯的合成
叶酸、胆固醇琥珀酸单酯结构上含有羧基，聚
氧乙烯二胺分子两端为氨基。本研究以酰胺反应为合成基础，以EDC 和NHS 为催化剂，分别合成叶酸-聚乙二醇-胺（Folate -PEG -amine ）和胆固醇琥珀酸单酯活化物（CHEMS -NHS ），将两者反应后，成功将叶酸、胆固醇琥珀酸单酯接枝到PEG 上，合成了叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯（FA -PEG 2000-CHEMS 和FA -PEG 4000-CHEMS ），合成路线如图1所示。
3.2
1
H NMR 图谱解析
聚氧乙烯二胺（H 2N -PEG -NH 2）、胆固醇琥珀酸
单酯（CHEMS ）、叶酸（FA ）和叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯（Folate -PEG -CHEMS ）的1H NMR 图
谱如图2所示。图2-B 为CHEMS 的1H NMR 图谱，δ7.26为溶剂（CDCl 3）峰，δ5.38为CHEMS 的烯烃质子峰，δ0.69~2.21是胆固醇脂肪族的质子峰，δ2.60~2.67为CHEMS 上琥珀酸（-CH 2-CH 2）质子峰。图2-A 为H 2N -PEG -NH 2核磁氢谱图，δ7.26为溶剂（CDCl 3）峰，δ3.5~3.7为H 2N -PEG -NH 2重复
单元（-CH 2-CH 2-O -）。与图2-A 、C 相比较，图2-D 中Folate -PEG -CHEMS 偶联物1H NMR 结果显示δ3.54~3.67处出现了较强的峰，H 2N -PEG -NH 2重
复单元（-CH 2-CH 2-O -），除了为H 2N -PEG -NH 2峰外，在δ8.64、7.72、6.67、6.56（图中放大部分）处出现了叶酸结构上（-CH ）的质子信号峰，此为叶酸的特征信号峰，由此推断Folate -PEG -CHEMS 已成功合成。3.3
质谱图谱解析
本研究中所用聚乙二醇（PEG ）
相对分子质量
Figure 1Synthesis of Folate -PEG -CHEMS
CHEMS:Cholesteryl hemisuccinate;FA:Folic acid
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第52卷第4期张文典，等：两种叶酸偶联物的合成及体外靶向性研究
分别约为2000、4000，终产物FA -PEG 2000-CHEMS 和FA -PEG 4000-CHEMS 的理论平均相对分
子质量分别约为2891、4891。从图3质谱分析结果可看到FA -PEG 2000-CHEMS 和FA -PEG 4000-CHEMS 相对分
子质量为2891、4823，与所合成终产物的理论相对分子质量基本吻合，从而证实所合成的高分子聚合物为所需要的目标化合物。3.4
钙黄绿素脂质体的包封率
钙黄绿素质量浓度在1~8μg/mL 呈现良好的
线性关系。其线性回归方程为A =0.051c -0.0068，
R 2=0.9991。计算得钙黄绿素脂质体包封率为
（15.6±5.1）%。
3.5
p63战斗机
平均粒径、分散系数(PDI)和Zeta 电位
采用激光粒度仪测定各项指标。测得钙黄绿
素脂质体的平均粒径为（205.8±10.2）nm ，分散系数（PDI ）为0.146±0.09。经电位分析仪测试脂质体的Zeta 电位为-（1.19±0.31）mV 。靶向组脂质体与非靶向脂质体粒径分布及Zeta 电位表征无显著性差异。3.6
体外细胞摄取实验
钙黄绿素脂质体在肝癌HepG2中的靶向性研
究通过体外细胞摄取实验进行评价。激光共聚焦扫描显微镜分析体外HepG2细胞摄取钙黄绿素荧光结果如图4所示，非靶向脂质体组（图4-B ）与FA -PEG 2000-L 组（图4-C ）HepG2细胞中呈现出微弱
荧光，说明非靶向脂质体与FA -PEG 2000-L 摄取效率低，未能在该实验条件下成功递送药物。图4-D 为靶向脂质体FA -PEG 4000-L 在HepG2细胞中的摄取情况，结果显示HepG2细胞内有明显的钙黄绿素
绿荧光，且强度高于其他组。流式细胞术的定量分析结果如图5、图6所示，普通钙黄绿素脂质体（C -L ）组、FA -PEG 2000-L 组、FA -PEG 4000-L 靶向脂质体组内荧光强度与对照组（Blank ）相比均具有显著性差异（P <0.01），C -L 组与FA -PEG 2000-L 组荧光强度相比无显著性差异（P >0.05），表明叶酸偶联物FA -PEG 2000-CHEMS 不能够提升HepG2细胞对药物
的摄取效率。然而，FA -PEG4000-L 靶向脂质体组的荧光强度值分别约为C -L 组与FA -PEG 2000-L
组的
Figure 2
1
H NMR spectra of NH 2-PEG 4000-NH 2(A),CHEMS (B),
Folate -PEG -CHEMS (D)in CDCl 3and folic acid (C)in
DMSO
Figure 3
MS spectra of FA -PEG 2000-CHEMS (A)and FA -PEG 4000-CHEMS (B)
451
苏教版教材插图学报Journal of China Pharmaceutical University 2021，52（4）：447-454第52卷
3.6和3.1倍，差异均有统计学意义（P <0.01），说
明FA -PEG4000-L 靶向脂质体能提升HepG2细胞对药物的摄取效率，叶酸偶联物FA -PEG 4000-CHEMS 有助于提高脂质体在HepG2细胞中的入胞能力。4
讨
论
脂质体技术良好的市场前景和技术性能已使
其成为制药、生物技术、免疫调节、遗传工程、基因药物等研究领域的热点［12-13］。脂质体技术的临床应用潜力令人瞩目，Patisiran 阳离子脂质体注射液作为全球第一款siRNA 药物于2018年获批上市［14］。脂质体由磷脂和适当的附加剂组成，磷脂和胆固醇是形成脂质体双分子层的基础物质，两者也是天然脂蛋白和生物膜的组成成分，因此具有高度的生物相容性，含有靶向基团结构修饰的脂质体可以用于靶向特定的细胞［15］。叶酸脂质体是一种受体靶向型药物递送系统，通常由亲水性直链高分子将叶酸分子与脂质体表面联接起来而获得［16］。
本研究以叶酸为靶向分子，以亲水链H 2N -
PEG -NH 2（H 2N -PEG 2000-NH 2或H 2N -PEG 4000-NH 2）为
主体，一端氨基与一分子叶酸经碳二亚胺类脱水剂EDC 催化发生偶联反应，得到单端叶酸修饰亲水链段FA -PEG -NH 2，疏水分子胆固醇琥珀酸单酯通过DCC 脱水剂催化得到CHEMS -NHS 活性酯，进一步与FA -PEG -NH 2缩合得到叶酸靶向两亲性分子叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯（FA -PEG 2000-CHEMS 与FA -PEG 4000-CHEMS ），其侧链为酰氨键
和酯键，水解稳定性较好，同时，原料成本低且合成工艺简单。利用核磁共振氢谱及高分辨质谱成功验证其结构的正确性。高分子PEG
具有亲水
Figure 4Fluorescence images of cellular uptake in HepG2cells
A:Blank;B -D:HepG2cells treated with non -targeted calcein liposome (C -L),FA -PEG 2000-L or FA -PEG 4000-L (D)at 37°C for 1hour,respec⁃
tively
Figure 5Typical pictures of cellular uptake measured by flow cytometry.HepG2cells were treated with C -L,FA -PEG 2000-L or FA -PEG 4000-L at 37°C
for 1hour
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