紫檀素、香附烯酮和a-香附酮含量的同时测定，建立了该制剂的多指标成分质量控制模式，同时采用聚类分析、主成分分析等化学计量学手段对不同企业生产的10批复方独圣活血片质量进行了综合评价+所建立的方法操作简便、结果准确，为全面、科学地评价独圣活血片整体质量提供了参考+ 参考文献：
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(收稿日期:2020-07-22)
LC-MS/MS法同时测定中药注射剂中3种成分的含量
孙卫1，汪赛赛1，贾倩倩1，付佳1，李智2，韩省力1!(1.西安交通大学药学院，西安710061'.天津天士力之骄药业有限公司，天津300402)
摘要：目的建立高效液相谱-质谱联用(LC-MS/MS)法测定注射用益气复脉和生脉注射液中5-7甲基糠醛(5-HMF)、人参皂5Rd与人参皂5Rg3的含量°方法采用SHIMADZU VP-ODS谱柱(150mmX20mm,5ym)o流动相：ImL'L1甲酸(A)乙睛(B)，梯度洗脱，梯度程序：0〜6min,5%B；6〜20min,5%B〜80%B；20〜25min,80%B。柱温：35f；流速：0.2 mL・min】；进样体积：5yL o质谱条件：ESI源；脱溶剂管线温度：250f，加热块温度&00f；雾化气流速&L・min】；干燥气流速：15L・min1；正离子模式检测电压：+45kV；负离子模式检测电压A3.5kV o结果3种成分质量浓度分别在53.76〜2204.00(n=0.9972),61.60〜246400$2=0.9983),51.05〜2042.00(心=0.9998)ng・mL1范围内与峰面积呈良好的线性关系；平均回收率分别为101.41%,101.44%,99.11%,RSD值分别为4.93%,3.65%,3.79%°结论建立的LC-MS/MS法专属性强、重复性好、稳定性好、精密度高，回收率满足实验要求，可用于中药注射剂中3种成分的含量测定° 关键词：注射用益气复脉；生脉注射液；5-7甲基糠醛(5-HMF)；人参皂5；LC-MS/MS法
DOI：10.3969/j.issn.1004-2407.202101006
中图分类号：R927.2文献标志码:A文章编号：1004-2407(2021)01-0025-04
基金项目：国家自然科学基金面上项目(编号=81973278)；中国博士后科学基金特别资助项目(编号：2019T120923)；中国博士后科学基金面上-等资助项目(编号：2018M641003)
作者简介：孙卫，男，硕士
通信作者：韩省力，男，硕士生导师，副教授
Simultaneous determination of the contents of3components in traditional Chinese medicine injections by LC-MS/MS
SUN Wei1,WANG Saisai1,JIA Qianqian1,FU Jia1,LI Zhi2,HAN Shengli1*(1.School of Pharmacy,Xi'an Jiaotong University, Xi'an710061,China；2.Tianjin Tasly Pride Pharmaceuical Limited Company,Tianjin300402,China)
Abstract:To establish an LC-MS/MS quantitative method for determining5-hydroxymethylfurfural(5-HMF),ginsen-oside Rd and ginsenoside Rg3in Yiqi Fumai Lyophilized Injections and Shengmai Injections.SHIMADZU VP-ODS(150 mmX2.0mm,5卜m)was adopted as analytical column.The mobile phase was1mL•L1formic acid(A)and acetonitrile(B), gradient program：0-6min,5%B；6-20min,5%B-80%B；20-25min,80%B.The column temperature was35f,the flow rate was 0.2mL•min1,and the volume of injection was5yL.MS conditions:ESI ion source was used；dissolvent line temperature was 250f,the temperature of heating block was400f,nebulizing gas flow rate was3L•min1and drying gas flow rate was15 L&min1.Positive ion mode detection voltage：+45kV,ne
gative ion mode test voltage:A35kV.A good linear relationship was observed between the concentration and the peak area of3components in the ranges of53.76-2204.00(r=0.9972), 61.60-2464.00(r=0.9983)and51.05-2042.00ng&mL1(r3=0.9998),respectively.The average recovery rates were 101.41%,101.44%and99.11%,respectively.The RSDs were4.93%,3.65%and3.79%,respectively.The established LC-MS/MS method showed good specificity,repeatability,stability,precision and recovery rate,and can accurately determine thecontentsof3componentsintraditionalChinesemedicineinjections
Keywords:YiqiFumaiLyophilizedInjections；ShengmaiInjections；5-hydroxymethylfurfural(5-HMF)；ginsenoside；LC-MS/MS
中药注射剂具有生物利用度高及作用迅速等特点，在心脑血管疾病、感染性疾病及肿瘤辅助等方面效果显著，临床应用范围广泛⑴。但中药注射剂临床应用不良反应较多，以类变态反应为主°3*。
明确中药注射剂中引发类变态反应的物质基础并控制其含量，对保证中药注射剂的临床应用安全至关重要。
注射用益气复脉与生脉注射液均源于中国著名传统古方“生脉散”，以红参为君药，大补元气，鼓舞清
阳；麦冬为臣药，养阴生津，清心除烦；五味子为佐使，敛肺宁心，止汗生津[4]+主治冠心病劳累型心绞痛，慢性左心功能不全心力衰竭、心律失常、冠心病及病毒性心肌炎等疾病[58]+2种中药注射剂均由3味中药提取制成，成分复杂，含糖量高，不良反应发生率高国家药品不良反应监测中心病例报告数据库显示，在生脉注射液的安全问题中，严重变态反应表现最为突出+5-径甲基糠醛(5-HMF)广泛存在于含糖注射液中[1011]，化学性质活泼，具有广泛的药理活性[1216]，前期研究表明,5-HMF具有较强的致敏作用。因此测定注射用益气复脉和生脉注射液中5-HMF的含量对于2种中药注射剂的质量控制及安全性评价具有重要意义。
高效液相谱-质谱联用(LC-MS/MS)法具有灵敏度高、操作简便和分离效果好等优点，广泛用于复杂体系中微痕量成分的准确定量)1719*+本研究建立了灵敏、快速的LC-MS/MS法，用于测定多批次注射用益气复脉和生脉注射液中5-HMF、人参皂昔Rd 与人参皂昔Rg3的含量+
1仪器与试药
1.1仪器LC-MS/MS8040型高效液相-三重四级杆质谱联用仪，SHIMADZU VP-ODS谱柱(150 mmX
2.0mm,5ym),AUY120型分析天平(日本岛津公司);0.22微孔滤膜(德国Merck公司);MiHi-Q型纯水仪(美国Millipore公司)。
1.2试药5-HMF(批号18110903，质量分数为9&23%)，人参皂昔Rd(批号19061306，质量分数为9&97%)，人参皂昔Rg3对照品(批号18120607，质量分数为99.17%)，均购自成都普菲德生物技术有限公司；乙睛为谱纯，购自德国默克公司；注射用益气复脉(冻干)(批号：201705012017050520170604, 20170702,20170812)，购自天津天士力之骄药业有限公司；生脉注射液(批号：17090122,14040111 , 14030211,13120811,13031011)，购自国药集团宜宾制药有限责任公司+
2方法与结果
2.1谱条件采用SHIMADZU VP-ODS谱柱(150mmX2.0mm,5ym)。流动相：1mL•L A1甲酸(A)-乙月青(B)，梯度洗脱，梯度程序：0〜6min,5%B；6
〜20min,5%B〜80%B；20〜25min,80%B o柱温：35 f；流速：0.2mL>min A1；进样体积：5y L；离子源:ESI 源；脱溶剂管线温度：250f；加热块温度：400f；雾化气流速：3L•min A1；干燥气流速：15L•min A1；正离子模式检测电压：+4.5kV；负离子模式检测电压:—3.5kV。利用对照品溶液建立MRM方法，定量离子对：5-HMF(126.9&109.2)；人参皂昔Rd(945.60 &945.50)；人参皂昔R g3(783.5&113.1)+
2.2溶液的制备
2.2.1混合对照品溶液精密称取3种成分对照品适量，分别置于量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度分别为1.102,1.232,1.021g•L—1的单一对照品储备液。精密吸取上述单一对照品储备液，用甲醇稀释成不同质量浓度的混合对照品溶液4 f保存，备用。
2.2.2供试品溶液精密称取注射用益气复脉(冻干)0.65g，加入2mL超纯水，摇匀，溶解，过0.22
y m，弃去$释100倍作为供试品溶液1；取生脉注，经0.22y m L滤，弃去$，稀释100倍作为供试品溶液2。
2.3方法学验证
2.3.1专属性实验取2.2项下制备的混合对照品溶液和2种供试品溶液，按照2.1项下谱二进样，得子流图(TIC)，见图1，考察本方法的专性。由图13谱峰附近他峰干扰，专属性满足含量测定要求+
3A3B
1212i1
1―1_________ 1111«11111I1
05101520250510152025
Z/min
3C
Z/min
2
65__10__15__2025
〃min
图1总离子流图
A.混合对照品溶液；
B.供试品溶液1；
C.供试品溶液2；1.5-HMF；2.人参Rd；.人参Rg3+
Fig1TICchromatograms
A mixedreferencesubstancessolution；
B samplesolution1；
C samplesolution2；15-HMF；2ginsenoside Rd；3ginsen-osideRg3
2.3.2线性实验取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下谱样测定，记录谱峰积。以混合对照品溶液质量浓度为横坐标(工)、峰积为(y)，性回归，得3的回归方程分别为：y i=43.91Q—1722.4(1=0.9972)，+2=255.87,2+44307(r2=0.9983),y3=289.5,3 +8114(厂3=0.9998)，进样质量53.76〜2204.00,61.60〜2464.00,51.05〜2042.00 ng・mL—1性关系良好。
2.3.3检测限与定量限将最低质量的混合对照品溶释，照21项谱样析，目测法计算0〜25min内信噪比(S/N)，当S/N =3时，3的检测限为2.20,2.05,1.02 ng・mL A1，S/N=10，3的定量限为551，1027，511ng・mL A1。
234221项的合照品溶液，同日进样3次，得日，计算3；分峰面积的RSD值为0.97%,0.73%,1.20%；每日进样1次，连续3d，得日间，计算得3种成分峰面积的RSD值分别为2.53%,4.30%,1.20%,
含量定求。
2.3.5性取2.2.2项下制备的2种供试品溶$连样6$录谱峰积$得到注益气复脉中3峰面积的RSD值分别为4.74%,2.01%,4.91%；生脉注中3i分峰面积的RSD值分别为1.13%,1.95%,2.18%，表明该方法性良好+
2.3.6稳定性取2.2.2项下制备的2种供试品溶$024681012h样$录注益气脉中3的谱峰峰积$得
RSD值为3.01%,2.80%,1.60%；记录生脉注中3的谱峰峰积$得RSD值为2.78%,1.53%,3.01%o结果表明2种供试品溶12h定性好。
2.3.7回收率批注射用益气复脉样品(批号20170501)，按照2.2.2项下方法9份供品溶液，平为3组，每组定量的对照品，加入量为测得量的80%,100%,120%，按照2.1项下谱样测定，计算平率，结果见表1。
表1回收率结果#=3)
Tab.1Results of recovery rates#=3)
柱训ll取样样品加入测得回收平均K)Cpi 付测
组谷量含量量量率率/ /mL/ng/ng/ng/%/%//0①118301464325297.1210141493
1183.0146.4318.792.70
透明导电膜
1183.0146.4325.197.06
1183.0183.0375.7105.29
1183.01830380510792
验光组合1183.01830378.1106.62
1183.0219.6404.810099
1183.0219.6409.7112.33
1183.02196406411084
②1132.0105.6207.196.21101.44 3.65
1132.01056214.810343
1132.0105.6212.9101.63
1132.01320261598.12
1132.0132025849576
1132.0132.0270.8105.21
1132.0158.4326.310603
1132.015843185101.12
1132.01584325410543
③135422834555896.129911379
1354.2283.4567.110012
1354.22834583210581
1354.23542721.610374
1354.2354.2687.294.04
1354.2354.2696.496.63
1354.2425.0843.298.42
1354.24250837.797.12
1354.2425.0850.110003
注：①5-HMF；②人参皂昔Rd；③人参皂昔Rg3o
2.4含量的测定取各批次注射用益气复脉(冻干)
和生脉注射液，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下谱条件进样测定，各样品重复测定3次，记录谱峰峰面积+见表2和表3。
表2注射用益气复脉的含量测定结果
Tab2ResultsofcontentdeterminationoftheYiqiFumaiLy-ophilizedInjections
批号
注射用益气复脉各成分含量/yg•支1
5-HMF人参皂昔Rd人参Rg3
20170501162.23土2.1144.51土3.1115.65土0.21 20170505166.82土0524421土2092268土100 20170604166.05土1432780土0411993土065 2017070211277土03344.67土3711892土033 2017081217413土2173870土1881369土037
表3生脉注射液的含量测定结果
Tab3ResultsofcontentdeterminationoftheShengmaiInjections
生脉注射液各成分含量/y g-支
ILL7
5-HMF人参Rd人参Rg3 170901223662土065106.51土31218661土291 1404011145.17土0.7313286土01321883土012 1403021145.44土087163.74土66518842土641 131208114226土07124123土20317801土480 130310115012土077156.57土11219925土714 3讨论
本实验建立了能同时测定3种成分的LC-MS/ MS法，该方法专属性强、重复性好、稳定性好、精密度高、回收率满足实验要求，进而对注射用益气复脉与生脉注射液中3种成分进行了含量测定+《中国药
典-015年版规定,5-HMF在葡萄糖注射液中限量为11.80y g-mL-1，结合其临床使用方法，本实验检测样品中5-HMF的含量远低于《中国药典-015年版规定的限量)0*且注射用益气复脉中5-HMF的含量低于生脉注射液的含量，推测原因可能是注射用益气复脉采用了冻干工艺，糖类在该储存条件下性质较稳定，不易转化生成5-HMF。
5-HMF作为糖类降解产物，广泛存在于各种含糖注射剂中。由于5-HMF的不稳定性，在中药注射液的复杂环境下，会进一步生成聚合物，引发不良反应，因此测定中药注射剂中5-HMF的含量对于确保中药注射剂的安全使用、减少不良反应具有重要意义+
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