一种荧光碳量子点及其在快速检测绿原酸方面的应用

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1.本发明涉及绿原酸的超灵敏快速检测技术领域，具体涉及一种荧光碳量子点及其在快速检测绿原酸方面的应用。

背景技术：

2.酚类化合物来源于肉桂酸和苯甲酸，在生长调节和植物抗性方面起着重要作用。绿原酸(cga)是一种苯丙酸类化合物，广泛存在于饮料和各种天然食品中，如各类水果和蔬菜。据报道，cga是一种生物活性成分，具有抗氧化、抗糖尿病、抗肥胖、抗菌、抗炎和抗癌等功能，还能够增加白细胞和兴奋中枢神经系统。鉴于cga在生命科学领域的重要作用，开发一种快速、灵敏的检测方法用于cga的检测至关重要。
3.cga检测的传统方法包括薄层扫描法、胶束电动谱法、高效液相谱法(hplc)、液相谱-串联质谱法(lc-ms/ms)和电化学法。然而，这些方法大多需要昂贵的仪器，并且存在操作复杂、耗时和效率低的问题，限制了其实际应用范围。近期荧光法尤其是荧光纳米探针技术，由于其快速、简单、成本低、灵敏度高、方便快捷等诸多优点脱颖而出，在食品检测领域受到人们广泛关注。
4.碳点(cds)是一种尺寸小于10nm的零维荧光碳纳米材料，具有发射波长可调谐、水溶性好、荧光强度高、光稳定性好等特征。这些优点使其在多个应用领域具有良好的应用前景，尤其是作为荧光纳米探针食品成分或食品添加剂检测方面(如姜黄素、谷胱甘肽、叶酸、日落黄、胭脂红等)展现出的高选择性和高灵敏度的优势。然而，迄今关于cds探针用于cga检测的研究尚少，目前仅有两个相关的工作。例如，zhu等将以柠檬酸和l-组氨酸为前体经水热反应制得的cds作为荧光探针用于cga检测，基于cga和cds的内滤效应(ife)检测，获得了0.46μmol l-1
的检出限(lod)。liu等提出了一种基于cds的比率型荧光法，该cds是以柠檬酸/氨基磺酸和聚乙烯亚胺(pei)为碳源通过简单加热制备而得，获得的lod为0.40μmol l-1
(0.12μg/ml)。由于这些cds探针的分析性能仍有很大的提升空间，因此有必要探索更高效的基于cds的荧光探针用于cga检测。

技术实现要素：

5.本发明针对现有基于cds的cga检测方法灵敏度不足的问题，以柠檬酸和对苯二胺为反应前体通过水热法了一种新型cds探针，该检测系统基于ife和动态相互作用的协同猝灭机理，在cga检测中获得了8.87nm的lod，其灵敏度远高于任何现有基于cds的荧光探针。
6.本发明采用以下技术方案：
7.一种荧光碳量子点的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)将0.36g柠檬酸和0.1g对苯二胺溶解在20.0ml超纯水和无水乙醇的等体积比混合溶液中；混合物溶液转移到聚四氟乙烯衬里高压釜中，并在180℃的恒温下加热12小时；
9.(2)让反应产物静置冷却至室温，然后将其转移到50.0ml离心管中。在10000rpm下
离心15分钟后，收集上清液；
10.(3)将所得上清液在超纯水中重新溶解，并通过透析膜在1.0l烧杯中纯化3天，每24h补充一次新鲜的超纯水；将纯化后含有cds的溶液冻干，得到干燥的cds粉末。
11.所述荧光碳量子点在快速检测绿原酸方面的应用，包括以下步骤：
12.1)用pbs溶液和荧光碳量子点混合，得到荧光碳量子点溶液；
13.2)将不同浓度的绿原酸分别与荧光碳量子点溶液混合反应，得到不同绿原酸浓度的混合溶液，分别测得不同绿原酸浓度的混合溶液的荧光强度，取得荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中绿原酸浓度的线性关系；
14.3)将待测样品与荧光碳量子点溶液混合反应，得到待测样品混合溶液，测得待测样品混合溶液的荧光强度；
15.4)根据荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中绿原酸浓度的线性关系得出待测样品混合溶液中绿原酸的浓度。
16.进一步的，步骤1)所述荧光碳量子点溶液的浓度为0.3mg ml-1
。
17.进一步的，步骤2)所述不同绿原酸浓度的混合溶液中绿原酸浓度0.01-110.0μm。
18.进一步的，步骤2)所述荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中绿原酸浓度的线性关系：
19.绿原酸浓度为0.01-0.1μm时，y＝0.946c+1.073；
20.绿原酸浓度为0.1-20.0μm时，y＝0.0698c+1.161，其中c是cga浓度。
21.进一步的，所述步骤2)和步骤3)中，反应体系的ph值在2.0和12.0之间。
22.进一步的，所述步骤2)和步骤3)中，反应体系的ph值为12.0。
23.进一步的，所述步骤2)和步骤3)中，测定荧光强度在λ
ex
为350nm，λ
em
为453nm下测定。
24.进一步的，步骤2)和步骤3)所述反应的时间为1min。
25.进一步的，步骤3)所述待测样品为：选择当地市场上的速溶咖啡、生咖啡豆、烘焙咖啡豆和金银花作为实际样品进行分析，将样品在60℃真空环境中过夜干燥后研磨成细粉，称取0.1g样品，分别超声辅助溶解于10.0ml超纯水中。在10000rpm下将样品溶液离心15分钟，并通过孔径为0.22μm的聚苯乙烯微滤器过滤上清液。收集提取液并将其保存在4℃的冰箱中供进一步使用。
26.本发明具有以下有益效果：
27.本工作以柠檬酸和对苯二胺为反应前体，通过水热法合成法制备了新型荧光cds，并将其作为探针用于cga的超灵敏检测，lod低至8.87nm，为cga检测性能的提升提供了新的途径。此外，本方法成本低、操作简单和检测速度快，并且可以用于实际食品样品分析，具有实际应用潜力。
附图说明
28.图1为本发明荧光碳量子点快速检测绿原酸的示意图；
29.图2(a)cds的tem图，插图为粒径分布直方图；(b)cds的红外光谱图。
30.图3(a)cds紫外-可见吸收光谱(abs)、激发光谱(ex)和发射光谱(em)，插图为cds紫外-可见吸收光谱的局部放大图；(b)cds在激发波长为310-450nm下的荧光光谱；(c)硫酸奎宁(a)和cds(b)紫外吸收强度-荧光光谱峰面积积分相关图。
31.图4不同检测参数对猝灭效率f0/f的影响(a)cds浓度(b)ph(c)反应时间。
32.图5(a)f0/f随cga浓度的变化(1-20)：0.0、0.8、0.2、1.0、3.0、5.0、6.0、8.0、11.0、14.0、17.0、20.0、24.0、28.0、34.0、40.0、50.0、60.0、80.0、110.0μm。(b)和(c)为f0/f与cga浓度之间的线性关系。
33.图6为cds对cga、阴阳离子和各类氨基酸等小分子的(a)选择性和(b)抗干扰性柱状图。
具体实施方式
34.下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
35.通过柠檬酸和对苯二胺的水热加热制备了cds。cga通过ife和动态猝灭以浓度依赖的方式有效降低cds的荧光强度。在这种观察的鼓励下，提出了一种基于cds的荧光方法来检测cga。详细研究了cds用量、ph值和反应时间等工作参数对分析性能的影响。通过研究其线性范围、检测限、选择性和抗干扰能力，彻底验证了该方法。最后将该方法用于食品中cga的测定，以评估其实际应用的可行性。该方法具有超高灵敏度、良好的选择性、低成本和易操作性，为cga监测提供了一种方便、可靠的分析策略。
36.1.cds的合成：
37.首先，将0.36g柠檬酸和0.1g对苯二胺溶解在20.0ml无水乙醇和超纯水的混合液(1:1v/v)中进行混合。然后将溶液转移至聚四氟乙烯衬里高压釜中，并在180℃下加热12小时。反应后，将反应产物自然冷却至室温，并转移至50.0ml离心管中，并在10,000rpm条件下离心15分钟，以去除大颗粒。收集含有cds的上清液，并通过透析膜(分子量截止量500-1000da)在含有1.0l超纯水的烧杯中透析3天，在此期间每24小时重新充注超纯水。最后，将纯化的cds溶液冻干，以获得干燥的cds粉末，以供进一步使用。
38.2.cds的理化性质表征：
39.2.1 cds的特性
40.利用透射电镜(tem)对cds的粒径和形貌进行了研究。如图2a所示，cds呈球形，在tem图像上大部分为单分散。插图为粒径分布直方图，是通过随机计数tem图像中100个颗粒，cds的平均粒径估计为5.5
±
0.3nm。
41.图2b为cds的红外光谱图，在3460-3000cm-1
处的宽吸收峰归因于-nh和-oh伸缩振动，2600cm-1
处的吸收峰与c-h拉伸振动有关，1900cm-1
处的吸收峰归因于c＝o伸缩振动，1720
–
1520cm-1
处的强吸收峰是c＝c伸缩振动的结果，1200cm-1
处的吸收峰归因于c
–
n伸缩振动，1000
–
800cm-1
处的峰与c
–
o有关。
42.2.2 cds的光学性质
43.图3a显示了cds的紫外-可见吸收光谱。可以看出，cds在245nm和352nm处具有两个典型的吸收带。245nm处的强吸收峰归因于芳香族sp2的π-π*跃迁，352nm处的较弱吸收峰归属于c＝o键的n-π*跃迁。图3b显示了不同激发波长下cds的荧光光谱。当激发波长从310nm增加到450nm时，cds的发射波长从450nm改变到557nm，其最佳激发波长为350nm。在紫外线照射下，cds溶液发出黄荧光。以硫酸奎宁为参比物，测得cds的量子产率为3.7％。
44.3.检测参数优化
45.本工作对关键实验参数包括cds浓度、ph值和反应时间进行优化。图4a显示了荧光
猝灭效率f0/f与cds浓度的关系图。当cds浓度从0.01增加到0.3mg ml-1
时，f0/f逐渐增加，进一步增加cds浓度(0.3-1.0mg ml-1
)导致f0/f持续下降。由于cds剂量为0.3mg ml-1
时f0/f最高，因此选择0.3mg ml-1
为最佳cds浓度。
46.如图4b所示，ph值在2.0-11.0的范围内变化时，f0/f变化不显著，ph值为12.0时会导致f0/f急剧增加。因此，选择12.0作为最佳ph。
47.如图4c所示。可以看出，cds与cga混合后，f0/f在1.0min内急剧增加，并在随后保持稳定，表明cds与cga之间的反应仅需1.0min即可完成。因此，1.0min被选为最佳反应时间。
48.4.方法验证
49.4.1 cga对cd的荧光淬灭作用
50.为了探索cds对cga浓度的响应，取适量cds溶解在pbs溶液(ph 12.0)中，使其浓度为0.3mg ml-1
。然后，将不同量的cga添加到cds溶液(2.0ml，ph 12.0)中，最终浓度在0.01-110.0μm之间，记录cds在不同cga浓度存在下的荧光信号。如图5a所示，cds的荧光强度随着cga浓度的增加而逐渐减弱，表现cga可以有效猝灭cds的荧光。
51.如图5b和图5c所示，荧光猝灭效率即f0/f与cga浓度分别在0.01-0.1μm和0.1-20.0μm范围内具有两个良好的线性关系，拟合的线性回归方程分别为y＝0.946c+1.073和y＝0.0698c+1.161，其中c是cga浓度。lod分别为8.87nmol l-1
和0.12μmol l-1
。将该方法的lod与先前报道的基于cds的荧光方法以及其他分析方法进行比较，如表1所示，本工作所提出方法的lod比现有基于cds的荧光法低2倍，相较于hplc-uv、伏安法、电化学法和胶束电动谱法，其lod甚至还要低1-3倍，表明本方法具有超高的灵敏度。
52.表1现有检测方法和文献报道的cga检测方法的线性范围和lod的比较
[0053][0054][0055]
4.2 cds选择性和抗干扰能力验证
[0056]
为了探讨所提出的荧光方法对cga检测是否具有特异性，在2.0ml cds溶液(ph 12.0，0.3mg ml-1
)加入2.0μl cga(100.0mm)及实际样品中可能存在的干扰物质(100.0mm)，包括各类阳离子(fe
2+
、ca
2+
、mg
2+
、zn
2+
、ag
2+
和na
+
)、阴离子(co
32-，so
42-，no
3-，cl-，h2po
4-，
s2o
32-，br-，i-，cr
2-和hpo
42-)和一些小分子(甲硫氨酸，丝氨酸，精氨酸，苏氨酸，组氨酸，酪氨酸，甘氨酸，蔗糖，葡萄糖，d-果糖，抗坏血酸，亮氨酸，谷氨酸，叶酸，氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸)。混合均匀后，在λ
ex
和λ
em
分别为350nm和453nm的条件下，记录混合溶液的荧光强度。如图6a所示，cds对可能存在的干扰物质没有明显的响应，与之相反，cga的引入导致cds荧光强度显著降低。结果表明，该方法对cga检测具有良好的选择性。
[0057]
同时，对所提方法的抗干扰能力进行了研究，将2.0ml cds溶液(ph 12.0，0.3mg ml-1
)转移到5.0ml离心管中。向每个离心管中加入2.0μl cga溶液(100.0mm)，再分别将2.0μl上述可能存在的干扰物质(100.0mm)加入每个离心管中，记录cds/cga系统的荧光强度。如图6b所示，在与这些可能的干扰物质混合后，cds/cga系统的荧光强度没有显著变化，表明基于cds的荧光方法对cga检测具有较高的抗干扰能力。
[0058]
5.实际样品测试
[0059]
选择当地市场上的速溶咖啡、生咖啡豆、烘焙咖啡豆和金银花作为实际样品进行分析，将样品在60℃真空环境中过夜干燥后研磨成细粉，称取0.1g样品，分别超声辅助溶解于10.0ml超纯水中。在10000rpm下将样品溶液离心15分钟，并通过孔径为0.22μm的聚苯乙烯微滤器过滤上清液。收集提取液并将其保存在4℃的冰箱中供进一步使用。
[0060]
在2.0ml cds(0.3mg ml-1
,ph 12.0)溶液中加入20.0μl实际样品提取液，混合均匀，λ
ex
和λ
em
分别设置为350nm和453nm，收集未添加(f0)和添加(f)样品提取液的cds溶液的荧光强度，并借助线性曲线计算食品样品中的cga含量，所有测量均采用五次重复。此外，在每个食品样品的提取液中加入不同量的cga，计算加标回收率。同时采用安捷伦1200系列高效液相谱与光电二极管阵列检测器用于食品样品中cga含量的分析。采用c18柱进行样品分离，以10.0mm醋酸铵和乙腈(60:40，v/v)的混合物作为流动相，紫外检测波长设置为368nm。进样体积为20.0μl，流速为1.0ml min-1
用于cga检测，重复三次取平均值。
[0061]
如表2所示，上述样品中cga的含量分别为7.50μm(金银花)、0.85μm(生咖啡豆)、0.08μm(烘焙咖啡豆)、0.02μm(速溶咖啡)。其加标回收率在98.9-106.7％范围内，相对标准偏差(rsds)小于3.28％。此外，采用hplc法进一步检查所提出方法的准确性。结果发现，本工作所提出检测方法的分析结果与hplc法的良好的分析结果具有一致性，证明本检测方法具有较高的准确性。
[0062]
表2基于cds的荧光法和高效液相谱法对食品样品中cga的检测结果
[0063][0064]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：

1.一种荧光碳量子点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将0.36g柠檬酸和0.1g对苯二胺溶解在20.0ml超纯水和无水乙醇的等体积比混合溶液中；混合物溶液转移到聚四氟乙烯衬里高压釜中，并在180℃的恒温下加热12小时；(2)让反应产物静置冷却至室温，然后将其转移到50.0ml离心管中。在10000rpm下离心15分钟后，收集上清液；(3)将所得上清液在超纯水中重新溶解，并通过透析膜在1.0l烧杯中纯化3天，每24h补充一次新鲜的超纯水；将纯化后含有cds的溶液冻干，得到干燥的cds粉末。2.根据权利要求1所述荧光碳量子点在快速检测绿原酸方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)用pbs溶液和荧光碳量子点混合，得到荧光碳量子点溶液；2)将不同浓度的绿原酸分别与荧光碳量子点溶液混合反应，得到不同绿原酸浓度的混合溶液，分别测得不同绿原酸浓度的混合溶液的荧光强度，取得荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中绿原酸浓度的线性关系；3)将待测样品与荧光碳量子点溶液混合反应，得到待测样品混合溶液，测得待测样品混合溶液的荧光强度；4)根据荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中绿原酸浓度的线性关系得出待测样品混合溶液中绿原酸的浓度。3.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤1)所述荧光碳量子点溶液的浓度为0.3mg ml-1
。4.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤2)所述不同绿原酸浓度的混合溶液中绿原酸浓度为0.01-110.0μm。5.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤2)所述荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中绿原酸浓度的线性关系：绿原酸浓度为0.01-0.1μm时，y＝0.946c+1.073；绿原酸浓度为0.1-20.0μm时，y＝0.0698c+1.161，其中c是cga浓度。6.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)中，反应体系的ph值在2.0和12.0之间。7.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)中，反应体系的ph值为12.0。8.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)中，测定荧光强度在λ
ex
为350nm，λ
em
为453nm下测定。9.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤2)和步骤3)所述反应的时间为1min。10.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤3)所述待测样品为：选择当地市场上的速溶咖啡、生咖啡豆、烘焙咖啡豆和金银花作为实际样品进行分析，将样品在60℃真空环境中过夜干燥后研磨成细粉，称取0.1g样品，分别超声辅助溶解于10.0ml超纯水中。在10000rpm下将样品溶液离心15分钟，并通过孔径为0.22μm的聚苯乙烯微滤器过滤上清液。收集提取液并将其保存在4℃的冰箱中供进一步使用。

技术总结

本发明公开了一种荧光碳量子点及其在快速检测绿原酸方面的应用，以柠檬酸和对苯二胺为反应前体，通过水热法合成法制备了新型荧光CDs，并将其作为探针用于CGA的超灵敏检测，LOD低至8.87nM，为CGA检测性能的提升提供了新的途径。此外，本方法成本低、操作简单和检测速度快，并且可以用于实际食品样品分析，具有实际应用潜力。应用潜力。应用潜力。