徐益 高辉 王佳* 王杨 彭传梅 姚瑶 鲁祥辉
(昆明医科大学附属延安医院/云南心血管病医院检验科，昆明 650051)
摘要：目的 研究医院重症监护病房(intensive care unit ，ICU)患者感染鲍曼不动杆菌的耐药性及耐药基因，以指导临床合理用药，控制ICU 病房感染暴发流行。方法 采用VITEK2-Compact 全自动细菌鉴定药敏系统对细菌进行鉴定及药敏试验，用聚合酶链反应(polymerase chain reaction ，PCR)方法检测6种常见碳青霉烯酶耐药基因(bla IMP 、bla VIM 、bla NDM 、bla OXA-23、bla OXA-24和bla OXA-58)。结果 38株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌对15种临床常用青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类及β-内酰胺酶抑制剂类抗菌药物全部耐药，对头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素的耐药率分别为92.1%和81.6%，仅对替加环素保持较高敏感性，敏感率为94.7%。38株CRAB 中携带bla OXA-23基因共36株(94.7%)，未检出bla IMP 、bla VIM 、bla NDM 、bla OXA-24和bla OXA-58基因。结论我院ICU 分离耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物耐药广泛，携带bla OXA-23基因是可能该院ICU 耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要原因。临床医生应合理使用抗菌药物，加强细菌耐药性监测，防止耐药菌株的产生和进一步传播。 关键词：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌；重症监护病房；耐药基因中图分类号：R978.1 文献标志码：A
Detection of six resistance genes of carbapenem-resistant
Acinetobacter baumannii in ICU
Xu Yi, Gao Hui,Wang Jia,Wang Yang, Peng Chuan-mei, Yao Yao and Lu Xiang-hui
(Kunming Medical University Affiliated Yan'an Hospital / Yunnan Cardiovascular Hospital Laboratory , Kunming 650051)
Abstract Objective To study the drug resistance and drug resistance genes of Acinetobacter baumannii in intensive care unit (ICU) in order to guide clinical rational drug use and control the outbreak of infections in ICU. Methods The VITEK2-compact automatic bacterial identification drug susceptibility system was used for the identification and susceptibility test of bacteria. The polymerase chain reaction (PCR) method was used to detect six common carbapenemase resistance genes (bla IMP , bla VIM , bla NDM , bla OXA-23, bla OXA-24 and bla OXA-58). Results 38 strains of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii were all resistant to 15 common clinical antibiotics, including penicillins, cephalosporins, aminoglycosides, quinolones, and β-lactamase inhibitors. The resistance rates of piperidone/sulbactam and minocycline were 92.1% and 81.6%, respectively, and they remained sensitive to tigecycline only, with a sensitivity rate of 94.7%.
A total of 36 (94.7%) bla OXA-23 genes were carried in 38 CRAB strains, and no bla IMP , bla VIM , bla NDM , bla OXA-24, and bla OXA-58 genes were detected. Conclusion Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolated from our hospital was widely resistant to commonly used antibiotics in the clinic. The main reason
收稿日期：2020-02-17
基金项目：昆明医科大学研究生创新基金(No. 2019S207)
作者简介：徐益，女，生于1995年，在读硕士研究生，主要研究方向：医学微生物检验，E-mail:****************
*
通讯作者，E-mail:***************
文章编号：1001-8689(2021)01-0072-04
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii ，Ab)是医院感染常见条件致病菌，广泛分布于自然界、医院环境及人体皮肤表面，易导致具有严重基础疾病或者免疫力低下的患者发生严重感染，甚至死亡[1]。
近几年，临床医生越来越多地应用碳青霉烯类抗生素感染性疾病，使得耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii ，C R A B )逐年增多，且耐药问题严重，多重耐药(Multidrug resistant ，MDR)及泛耐药(Extensively drug-resistant ，XDR)鲍曼不动杆菌在世界范围内流行，给临床抗感染带来巨大挑战[2-4]。重症监护病房(intensive care unit ，ICU)患者疾病种类多，多为多器官功能障碍、脓毒症等，多数患者免疫力低下、又接受较多的侵入性操作、长期应用大量广谱抗生素，是医院暴发感染流行的重要区域[5-6]。本研究通过对我院重症监护病房CRAB 分布情况及耐药性进行监测分析，检测其耐药基因，为CRAB 的有效及医院制定相应防控措施提供参考。1 材料与方法1.1 菌株来源
选取2017年7月至 2019年6月昆明医科大学附属延安医院重症医学科住院患者临床标本分离的38株CRAB ，剔除同一患者重复菌株。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄葡萄球菌 ATCC25923购自卫生部临检中心。1.2 仪器与试剂
微生物培养箱(美国ThermoFisher Scientific 公司)，VITEK2-Compact 全自动微生物鉴定仪及其配套试剂(法国Bio-Mérieux 公司)，抗菌药物纸片(温州康泰生物科技有限公司)，引物、MasterMix 、核酸染料、DNA Marker(北京博迈德基因技术有限公司)，Agarose 琼脂糖、TAE 缓冲液(昆明硕阳科技有限公司)，干式恒温器(杭州奥盛仪器公司)，低温高速离心机(美国赛默飞世尔科技公司)，PCR 扩增仪(黑马医学仪器公司)、电泳仪(美国Bio-Rad 公司)，Gel Doc XR+凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad 公司)。
1.3 细菌鉴定及药敏试验
菌株的分离、培养参照《全国临床检验操作规程》(第4版)[7]进行。采用VITEK2-Compact 全自动微
生物分析仪进行细菌鉴定与药敏试验。其中，氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、米诺环素、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦的药敏试验采用纸片扩散法(Kirby-Bauer ，KB)，其余均采用最低抑菌浓度法(minimum inhibitory concentration ，MIC)。结果判定参照美国临床与实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute ，CLSI)各年的标准。1.4 耐药基因检测1.4.1 DNA 模板制备
采用煮沸法制备PCR 模板。将经过VITEK2-Compact 全自动微生物鉴定药敏分析系统鉴定后储存于-70℃低温冰箱的鲍曼不动杆菌转入血平板，经18~24h 培养后，挑取适量菌落到300μL 蒸馏水中，充分震荡混匀，然后100℃水浴15min ，13000r/min 离心5min 后取上清液作为作为DNA 模板，-20℃冰箱保存备用。1.4.2 PCR 扩增
反应体系：总体积50μL ，包括M a s t e r M i x 25μL ，上游引物1μL ，下游引物1μL ，DNA 模板2μL ，蒸馏水21μL 。引物序列及产物长度见表1，参照文献[8-9]，由北京博迈德基因技术有限公司合成。反应条件为：94℃预变性5min ，然后94℃变性30s ，适宜温度退火30s(bla IMP 、bla VIM 、bla NDM 和bla OXA-58为58℃，bla OXA-23和bla OXA-24为55℃)，72℃延伸60s ，共30个循环，最后7
2℃延伸5min 。
for carbapenem resistance of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii in ICU of our hospital maybe was the strains carrying the bla OXA-23 gene. Clinicians should use antibiotics reasonably, strengthen the monitoring of bacterial resistance, and prevent the production and further spread of drug-resistant strains.
Key words Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii ; ICU; Drug resistance genes
表1 PCR 引物序列Tab. 1 PCR primer sequence
基因名称引物序列(5'-3')产物长度/bp B 类金属酶基因(MBLs)
bla IMP F CTACCGCAGCAGAGTCTTTAC R AACCAGTTTTGCCTTACCAT
587
bla VIM F AGTGGTGAGTATCCGACAG R ATGAAAGTGCGTGGAGAC 261
bla NDM
F GTTTGGCGATCTGGTTTTC
R CGGAATGGCTCATCACGATC 621
D 类苯唑西林酶基因(OXAs)
bla OXA-23 F GATCGGATTGGAGAACCAGA
R ATTTCTGACCGCATTTCCAT
501bla OXA-24 F GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA R AGTTGAGCGAAAAGGGGATT 246bla OXA-58
F AAGTATTGGGGCTTGTGCT
G R CCCCTCTGCGCTCTACATAC
599
1.4.3 PCR产物分析
扩增完产物经2%琼脂糖凝胶，110V电泳30min，放入凝胶成像系统扫描成像。电泳出现明亮条带并且该条带与预期产物大小相同者送北京博迈德基因技术有限公司进行测序，测序结果通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站Blast比对分析。
2 结果
2.1标本类型分布
38株CRAB来源于痰标本20株，占52.6%，来源于肺泡灌洗液14株，占36.8%，其余来源于胸水2株，血液1株，脑脊液1株。表明鲍曼不动杆菌主要引起下呼吸道感染。
2.2药敏试验结果
38株CRAB对20种抗菌药物中的15种全部耐药，均为多重耐药菌株。对头孢哌酮/舒巴坦及米诺环素亦无敏感菌株，耐药率分别超过90%和80%，我院ICU分离CRAB仅对替加环素保持较高敏感性，耐药率为0，有部分中介菌株，见表2。
表2 耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌对临床常用抗生素耐药率
Tab. 2 Resistance rate of CRAB to clinical antibiotics 抗生素耐药(R)中介(I)敏感(S)亚胺培南100.0%00
阿米卡星100.0%00
左氧氟沙星100.0%00
环丙沙星100.0%00
复方磺胺甲噁唑100.0%00
妥布霉素100.0%00
庆大霉素100.0%00
哌拉西林100.0%00
哌拉西林/三唑巴坦100.0%00
氨苄西林/舒巴坦100.0%00
氨苄西林100.0%00
阿莫西林/克拉维酸100.0%00
头孢曲松100.0%00
头孢吡肟100.0%00
氨曲南100.0%00
头孢哌酮/舒巴坦92.1%7.9%0
米诺环素81.6%18.4%0
替加环素07.1%94.7% 2.3耐药基因检测结果
38株CRAB中36株检出bla
OXA-23基因(94.7%)，
bla
IMP 、bla
VIM
、bla
NDM
、bla
OXA-24
和bla
OXA-58
基因均无
特异性条带出现，检测结果为阴性。部分bla
OXA-23
基因的PCR产物电泳结果见图1。
M：Marker；1~10、12：阳性标本；11：阴性标本；P：阳性对照；N：阴性对照
图1 bla
OXA-23
基因扩增产物电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of bla
OXA-23
gene amplification products bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P N
2000
1500
1000
750
500
250
100
3 讨论
据2014年CHINET中国细菌耐药性监测报告显示，鲍曼不动杆菌在医院内感染病原菌位列第三位，在非发酵菌中的地位已超过铜绿假单胞菌[10]。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)于2017年公布的新型抗生素研发重点病原体清单中，CRAB被列为革兰阴性菌中的首位，究其原因，CRAB不仅可造成较高的病死率、医疗保健和社区负担，而且带来抗药性、传播性以及社区环境可预防性等方面的严峻挑战[11-12]。由于ICU患者病情危重，患者多长期卧床、免疫力低下，而鲍曼不动杆菌营养需求极低，生命力极其顽强，可黏附于各类物体表面，对紫外线、湿热、化学消毒剂等因素并不敏感，同时具有极强的获得性耐药和克隆性传播的能力，因此鲍曼不动杆菌在ICU中的检出率越来越高，前期研究表明，我院ICU已成为鲍曼不动杆菌检出率最高科室[13]。
耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌常常对多种抗菌药物均耐药，形成泛耐药，甚至全耐药[14]。本研究中，38株对亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌，同时对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类及β-内酰胺酶抑制剂类抗菌药物均耐药。对头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素亦无敏感菌株，耐药率分别为92.1%和81.6%，远高于其他地区相关报道。本院CRAB仅对替加环素保持较高敏感性，耐药率为0，提示替加
环素可作为本院ICU鲍曼不动杆菌的第一选择。此药敏试验结果表明，我院ICU鲍曼不动杆菌耐药极其严重，临床可供选择的药物极其有限。医院应加强细菌耐药性检测，制定抗菌药物分级管理使用规则，临床医生应严格依照药敏试验结果，加强抗菌药物合理使用，否则临床将面临无药可用的境地。
CRAB的耐药机制非常复杂，主要包括以下几个方面：①产生药物水解酶碳青霉烯酶；②外膜孔蛋白表达下调或缺失；③抗菌药物作用靶位改变；④主动外排泵活性增加；⑤生物膜的形成；⑥可移动遗传元件(如插入序列、质粒、整合子、转座子)快速传播细菌的耐药性等[15]。其中最主要的是碳青霉烯酶的产生。碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类β-内酰胺酶，在鲍曼不动杆菌中主要为D类苯唑西林酶(OXAs)和B类金属β-内酰胺酶(MBLs)。D类酶按照氨基酸的同源性可分为8组，在鲍曼不动杆菌中报道的主要是OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58这4组[16]，B类酶包括有IMP、VIM、和NDM等型。由于各个国家和地区使用的抗菌药物存在差异，不同地区的鲍曼不动杆菌耐药性也不同，其所携带的耐药基因构成比亦不相同。大部分文献报道显示bla
OXA-51
基因为鲍曼不动杆菌天然携带，其对鲍曼不动杆菌耐药性的贡献主要是由其上游插入序列介导，故本研究检测了6种主要碳青霉烯酶基因，结果显示，38株CRAB中36株(94.7%)
检出bla OXA-23型基因，未发现bla
IMP 、bla
VIM
、
bla
NDM 、bla
OXA-24
和bla
OXA-58
基因，提示bla
OXA-23
是该院
ICU分离CRAB主要携带的基因型别，是引起鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因之一，与国内相关报道[17]一致。本次研究未检出B类金属β-内酰胺酶基因，虽然此类酶水解活性较强，但本次研究结果表明该酶不是本院ICU鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药的主要原因。另外，本研究中鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药率达100%，却有2株CRAB未检出上述耐药基因，提示可能存在外膜蛋白缺失或主动外排泵过度表达等其他耐药机制。
综上所述，本院重症监护病房CRAB耐药情况严重，临床医生面临极大困境，产OXA-23型酶可能是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要原因。医务人员应重视鲍曼不动杆菌的耐药性情况，及时将耐药谱变迁情况进行反馈，积极开展鲍曼不动杆菌耐药基因检测，分析鲍曼不动杆菌耐药特征与主要流行型别，从而为临床提供强有力的科学依据，减少耐药菌的产生和传播，预防和控制院内感染暴发流行。
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