海南台农芒采后果实病病原鉴定
陈亭妤;李聪;周国英;李河
【摘 要】刺盘孢属(Colletotrichum)真菌是芒果的重要病原菌.本研究采用形态和分子生物学鉴定了海南省台农芒果实采收后病的病原菌.从台农芒发病果实上总共分离纯化获得38株刺盘孢属真菌.基于形态学特征和多基因序列(核糖体转录间隔区、钙调蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、肌动蛋白、微管蛋白),确定引起台农芒采后病的病原为暹罗菌(C.siamense)、亚洲菌(C.asianum)和果生菌(C.fructicola).其中果生菌是我国芒果病原的首次报道. 【期刊名称】《热带作物学报》
【年(卷),期】2018(039)007
【总页数】6页(P1396-1401)
【关键词】芒果;病;刺盘孢属真菌;多基因系统发育
【作 者】陈亭妤;李聪;周国英;李河
【作者单位】森林有害生物防控湖南省重点实验室,中南林业科技大学林学院,湖南长沙 410004;森林有害生物防控湖南省重点实验室,中南林业科技大学林学院,湖南长沙 410004;森林有害生物防控湖南省重点实验室,中南林业科技大学林学院,湖南长沙 410004;森林有害生物防控湖南省重点实验室,中南林业科技大学林学院,湖南长沙 410004
【正文语种】中 文
【中图分类】S31
台农芒果实营养丰富，甜度极高，核小皮薄肉厚，果肉细致无纤维，主要分布在广西、广东和海南等华南广大地区。病是芒果的第一大病害，特别是芒果果实采收后抗病性降低，可利用的营养物质增加，病原菌导致果实在田间或储运中腐烂，有时病果率达60%以上，病果品质下降，每年造成的经济损失高达8 000万元以上，严重威胁着芒果产业的健康发展[1-4]。
刺盘孢属（Colletotrichum）真菌的大多数相似种无法通过形态学特征来进行区分，目前国
内外对病病原菌的研究主要采用形态学特征结合多基因序列分析鉴定。Weir等[5]在形态学基础上结合多基因系统发育学方法在胶孢菌复合（C. gloeosporioides complex）下确定了22个合格种和1个亚种，包括已经发现的合格种13个、描述新种10个。符丹丹[6]报道中国苹果病的病原有7种，分别是C. aenigma、C. alienum、C.fructicola、C. gloeosporioides、C. nymphaeae、C.siamense和C. orientalis。王玉春等[7]报道的中国主要茶区茶树菌有3种，分别是C. camelliae、C. fructicola和C. siamense。Lima等[8]采用6个基因位点系列（rDNA-ITS、ACT、GS、CAL、TUB-2和 GAPDH），对巴西东北部的芒果病病原菌进行了研究，发现有5种刺盘孢属真菌能引起芒果病。我国报道的芒果病病原菌主要有3种：C. gloesporioides、C. acutatum 和 C. siamense [9-14]。海南台农芒采后病原菌尚无相关报道。本研究基于形态学特征，结合多基因分子系统发育分析及致病性测定，鉴定海南台农芒果实采收后病病原菌种类，为进一步研究该病的发生规律、防治措施等工作提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 2017年4—6月，分3次采集了海南省海口市3个水果市场上正在出售的38个发病的台农芒果实。
1.1.2 实验试剂 北京索莱宝科技有限公司真菌基因组 DNA提取试剂盒（100T），南京诺唯赞生物科技有限公司Green Taq Mix。
1.2 方法
1.2.1 台农芒菌分离及纯化 表面消毒后于无菌操作台中用无菌解剖刀切取交界处组织（4～5 mm），放入无菌水中冲洗30 s，再放入75%的酒精中30 s，取出后无菌水冲洗2次，每次30 s，置于无菌滤纸上吸干表面水分，倒置于PDA培养基上，封口，放入28 ℃黑暗培养箱中进行培养。待长出菌丝后，从菌落边缘切取三角菌块，转移到新的PDA培养基上，继续28 ℃恒温培养，得到纯菌株。 1.2.2 菌形态学特征 将菌株接种在 PDA培养基上，第7天用灭菌的5 mm打孔器从菌落边缘选取圆片，并转移到PDA培养基上，恒温培养5 d，测量并记录菌落直径、颜和形态，观察并记录50个分生孢子的大小和形状，记录附着胞形态特征。
图1 台农芒果实病斑Fig.1 Anthracnose disease of mango fruit
1.2.3 菌分子鉴定
（1）DNA提取、扩增及序列测定 将菌株接种在PDA培养基上培养7 d，刮取适量菌丝放入无菌离心管（1.5 mL）中，采用试剂盒提取DNA。对所有分离筛选获得的菌株，参照 Weir等[5]的研究，选择核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）、肌动蛋白(ACT)、谷氨酰胺合成酶（GS）、钙调蛋白（CAL）、β-微管蛋白（TUB-2）和 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）共 6个基因片段进行扩增、测序。引物序列及退火温度如表1所示。
（2）多基因系统发育分析 对测定的序列在GenBank中进行 Blast比对，下载和选用 Damm等[15]、Weir等[5]和 Sharma等[16]菌模式菌株的序列与本研究分离纯化获得的菌株序列共同构建系统发育树。采用 MEGA 6.0构建邻近法（neighbor-joining，NJ）系统发育树，所有碱基赋予相同权重，自举检验（boot-straping）重复1 000次以获得各分支的支持率。
1.2.4 致病性测定及柯赫氏法则验证
（1）孢子液法。对新鲜芒果表面用75%酒精表面消毒处理，取浓度为15×10倍显微镜下每视野30～40个病原菌孢子悬浮液后滴在无伤和有伤（针刺 3孔）芒果表面，以无菌水处理作对照（CK），放入培养箱，温度28 ℃，相对湿度98%。
（2）菌丝块法。用5 mm打孔器从菌落边缘取菌丝块，接种于无伤和有伤（针刺3孔）芒果表面，并在菌丝块上覆盖沾有无菌水的脱脂棉保湿，用保鲜膜包裹固定。放入培养箱，温度28 ℃，相对湿度98%。
表1 本研究所用的引物和退火温度Tab.1 Sequences of the primers and annealing temperatures used in this study基因 gene 引物序列（5′ →3′）primer sequence 退火温度annealing temperature/℃核糖体转录间隔区 F：GGAA GTAA AAGT GGTA ACAAGG 52 internal transcribed spacers (ITS) R：TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC钙调蛋白 F：GARTWCAAGGAGGCCTTCTC 50 calmodulin (CAL) R：TTTTTGCATCATGAGTTGGAC 3-磷酸甘油醛脱氢酶 F：GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA 60 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase R：GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT谷氨酰胺合成酶 F：ATGGC CGAGT ACATC T
GG 60 glutamine synthetase R：GAACC GTCGA AGTTC CAC肌动蛋白 F：ATG TGC AAG GCC GGT TTC GC 59 actin R：TAC GAG TCC TTC TGG CCC AT微管蛋白 F：AAC ATG CGT GAG ATT GTA AGT 59 tubulin R：ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT CGC
对上述致病性测定实验中发病的台农芒果实再次分离病原菌，观察菌落、分生孢子形态及分子序列特征，进一步确认是否与原接种病原菌一致。
1.2.5 其他芒果品种致病性测定 从市场上购买新鲜、健康的其他品种芒果的果实，表面消毒后，分别采用无伤和有伤2种方式接种病菌，设置空白对照，重复3次，观察实验结果并拍照记录。
2 结果与分析
2.1 系统发育分析
从样品中共分离得到38株刺盘孢属真菌，获得了每个菌株的rDNA-ITS、CAL、GDPH、ACT、GS和 TUB6基因序列。所有 228条序列提交GenBank保存（GenBank接收号为 ITS：
MG783043～MG783080；CAL：MG783157～MG783194；GDPH：MG783233～MG783270 ； ACT ： MG783081～MG783118；GS：MG783195～MG783232；TUB：MG783119～MG783156）。其中，ITS、CAL、GDPH、ACT、GS、TUB基因序列 Blast比对同源性分别为99%、100%、99%、100%、99%和100%。
从系统发育树（图2）中可以看出，38株参与系统学分析的菌株分成了3个进化枝，各进化枝的支持率均较高，分别代表3个分类单元，每个进化支中包含了相应分类单元的模式菌株。其中，M23、M27、M24、M14、M14-1、M25、M5、M6-2、M16、M26、M6、M7和M110共13个菌株与果生菌（C. fructicola）聚为一支；菌株M15、M9-1、M2-2、M9-2、M2-1共 5个菌株与C. siamense聚为一支；菌株M11、M52、M102、M92、M83、M61、M9、M1-1、M12、M17、M17-1、M2、M4-2、M73、M8-1、M4-2、M8、M4-1、M1和M312共20个菌株与C. asianum聚为一支。
2.2 菌株形态学特征
根据形态学特征，38株刺盘孢属真菌也归为C. asianum、C. siamense和C. fructicola三种。
2.2.1 亚洲菌（C. asianum）共分离获得20株 在 PDA培养基上该菌菌落呈灰白，橙孢子堆，菌落背面浅黄，中间深绿，生长速度10.2 mm/d。分生孢子圆柱状，两端钝圆，部分可见油滴，孢子基部稍宽于顶端，大小(17±1.0)μm×(5.5±0.25) μm。分生孢子可形成黑附着胞，呈近圆形，褐，大小为(9.0±1.5) μm×(6.5±0.5) μm。
2.2.2 暹罗菌（C. siamense）共分离获得 5株 菌株在 PDA培养基上呈地毯状，菌落近圆形，气生菌丝由白和灰白逐变为深灰绒状；菌落背面浅灰至深灰，中心颜深，外部颜浅；可产生橘黄的分生孢子堆。5 d平均生长速率为11.4 mm/d。分生孢子为单胞，直、圆柱状、无、光滑、两端钝圆或一端钝圆，另一端稍尖，分生孢子大小为(15±1.6) μm×(4.9±0.55) μm；分生孢子附着胞单个或成簇状分布，浅棕至深棕，近球形或短圆柱形，部分轻微不规则形，大小为(9.5±1.9) μm×(5.9±0.85) μm。形态特征与模式菌株一致。
2.2.3 果生菌（C. fructicola）共分离获得13株 在PDA培养基上，菌落厚重浓密，棉絮状，白至深灰，圆形，规则完整，边缘颜稍浅一些，气生菌丝绒毛状，菌落背面黑素沉淀，灰白至深灰，分生孢子堆浅黄，5 d平均生长速率10.5 mm/d。营养菌丝
透明，光滑，有隔膜，分枝；厚垣孢子未发现；未发现刚毛；分生孢子直，无隔膜，圆柱状或椭圆形，两端钝圆或一端略尖，光滑，无，单胞，大小为(16.5±0.8) μm×(6.0±0.7) μm。在PDA培养基上培养后期可见有性态。分生孢子附着胞单个或成簇状分布，浅棕至深棕，近球形或短圆柱形，大小为(7.5±1)μm× (4.5±0.9) μm。
