凋亡的影响
郭红艳１，徐亚茹２，李耕慧３，孙晓杰４△
，赵正林１，吴 琦４，刘 波５
（１．齐齐哈尔医学院生化教研室，２．齐齐哈尔医学院附属第一医院检验科，３．齐齐哈尔市第一医院老年科，４．齐齐哈尔医学院
临床生化教研室，
５．齐齐哈尔医学院附属第二医院办公室，齐齐哈尔１６１００６）【摘要】 目的：探讨长链非编码ＲＮＡＬｉｎｃ００６７３过表达对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法：将重组慢病毒表达质粒ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３和对照空载体质粒ｐＬＶＸ ＮＣ在２９３Ｔ细胞中进行慢病毒包装与扩增，将重组慢病毒转染胃癌细胞ＭＧＣ ８０３建立稳定过表达Ｌｉｎｃ００６７３的细胞系，实时荧光定量ＰＣＲ方法检测Ｌｉｎｃ００６７３基因的表达；ＭＴＴ实验和克隆形成实验观察细胞的生长增殖；流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡；ｑＰＣＲ检测细胞周期相关调控基因表达；免疫印迹法检测ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路关键分子及肿瘤增殖相关蛋白的表达。结果：Ｌｉｎｃ０ ０６７３在胃癌细胞系ＭＧＣ ８０３、ＢＧＣ ８２３和ＡＧＳ中的表达量显著高于正常胃粘膜细胞ＧＥＳ １（Ｐ＜０．０５）。建立了稳定过表达Ｌｉｎｃ００６７３的ＭＧＣ ８０３细胞系，Ｌｉｎｃ００６７３的表达量比对照空载体组高２００倍。Ｌｉｎｃ００６７３过表达促进ＭＧＣ ８０３细胞增殖和克隆形成（Ｐ＜０．０５），抑制细胞凋亡并影响细胞周期Ｇ１→Ｓ期进程（Ｐ＜０．０１）；Ｌｉｎｃ００６７３过表达可影响ＭＧＣ ８０３细胞周期调节基因ＣＣＮＧ２、ｐ１９和ＣＤＫ１的表达；免疫印迹结果显示，Ｌｉｎｃ００６７３过表达不仅促进ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路关键分子ｐＡＫＴ及其下游靶点ＮＦ κＢ和Ｂｃｌ ２蛋白的表达，而且上调肿瘤相关因子β ｃａｔｅｎｉｎ和ＥＺＨ２蛋白的表达。结论：Ｌｉｎｃ００６７３过表达可能通过ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路促进ＭＧＣ ８０３细胞增殖、抑制凋亡。【关键词】 Ｌｉｎｃ００６７３；胃癌；细胞增殖；细胞凋亡；ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路
【中图分类号】Ｒ７３５．２ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０２２）０１ ０５３ ００６【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．６２０６．２０２２．０１０
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｏｎｇ ｃｈａｉｎｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＬｉｎｃ００６７３ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅＭＧＣ ８０３
ＧＵＯＨｏｎｇ ｙａｎ１，ＸＵＹａ ｒｕ２，ＬＩＧｅｎｇ ｈｕｉ３，ＳＵＮＸｉａｏ ｊｉｅ４△，ＺＨＡＯＺｈｅｎｇ ｌｉｎ１，ＷＵＱｉ４，ＬＩＵＢｏ
５（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＱｉｑｉｈａｒＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，２．ＴｈｅＣｌｉｎｉｃａｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＱｉｑｉｈａｒＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，
３．ＣａｄｒｅＷａｒｄ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＱｉｑｉｈａｒ，４．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＱｉｑｉｈａｒＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，
５．ＯｆｆｉｃｅｏｆｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＱｉｑｉｈａｒＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｑｉｑｉｈａｒ１６１００６，Ｃｈｉｎａ）
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｏｎｇ ｃｈａｉｎｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＬｉｎｃ００６７３ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐ ｏｐｔｏｓｉｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３ａｎｄｔｈ
ｅｃｏｎｔｒｏｌｅｍｐｔｙｐｌａｓｍｉｄｐＬＶＸ ＮＣｗｅｒｅｐａｃｋａｇｅｄａｎｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｉｎ２９３Ｔｃｅｌｌｓ，ａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅＭＧＣ ８０３ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｃｅｌｌｌｉｎｅｓｔａｂｌｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＬｉｎｃ００６７３．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｎｃ００６７３ｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＴｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙａｎｄｃｌｏｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｓｓａｙ．Ｃｅｌｌｃｙｃｌｅａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅｒｅｌａｔｅｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＰＣＲ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｋｅｙｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｔｈｅＰＩ３Ｋ／ＡｋｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄｔｕｍｏｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＬｉｎｃ００６７３ｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅＭＧＣ ８０３，ＢＧＣ ８２３ａｎｄＡＧＳｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｎｏｒｍａｌｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａｃｅｌｌｌｉｎｅＧＥＳ １（Ｐ＜０．０５）．ＭＧＣ ８０３ｃｅｌｌｌｉｎｅｗｉｔｈｓｔａｂｌｅｏｖ
ｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＩＮＣ００６７３ｗａｓｅｓｔａｂ ｌｉｓｈｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＬｉｎｃＣ００６７３ｗａｓ２００ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｅｍｐｔｙｃａｒｒｉｅｒｇｒｏｕｐ．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｎｃ００６７３ｐｒｏｍｏｔｅｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＭＧＣ ８０３ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）ａｎｄｃｌｏｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５），ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｆｆｅｃｔｅｄｔｈｅＧ１→Ｓｐｈａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅ（Ｐ＜０．０１）．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｎｃ００６７３ｃｏｕｌｄａｆｆｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅＣＣＮＧ２，Ｐ１９ａｎｄＣＤＫ１ｉｎＭＧＣ ８０３．ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬｉｎｃ００６７３ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｎｏｔｏｎｌｙｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｔｈｅｋｅｙｍｏｌｅｃｕｌｅｐＡｋｔｉｎＰＩ３Ｋ／ＡｋｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄｉｔｓｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｔａｒｇｅｔＮＦ κＢａｎｄＢｃｌ ２ｐｒｏｔｅｉｎ，ｂｕｔａｌｓｏｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｔｕｍｏｒｒｅｌａｔｅｄｆａｃｔｏｒｓβ ｃａｔｅｎｉｎａｎｄＥＺＨ２ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｎｃ００６７３ｍａｙｐｒｏｍｏｔｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｈｉｂｉｔａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＭＧＣ ８０３ｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈＰＩ３Ｋ／Ａｋｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ．
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】 Ｌｉｎｃ００６７３； ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ； ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ； ａｐｏｐｔｏｓｉｓ； ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔｓｉｇｎａｌｐａｔｈｗａｙ
３
５中国应用生理学杂志，２０２２，３８（１）
【基金项目】黑龙江省省属本科高校基本科研业务费项目
（２０１９ ＫＹＹＷＦ １２１９）【收稿日期】２０２１ ０５ １３【修回日期】２０２１ １２ ２４ △【通讯作者】Ｔｅｌ：０４５２ ２６６３１５１；Ｅ ｍａｉｌ：ｓｕｎｘｊ９７＠１６３．ｃｏｍ
胃癌（ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅ，ＧＣ）是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其在中国的发病率呈逐年递增的趋势。越来越多的证据显示，长链非编码ＲＮＡ（ｌｏｎｇｎｏｎ ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ＬｉｎｃＲＮＡ）参与胃癌的发生发展，与胃癌细胞的生长、侵袭和转移等相关［１，２］
。
Ｌｉｎｃ００６７３于２０１５年被鉴定为胰腺癌易感基因，可
作为胰腺癌的预后诊断标志物
［３，４］
。最近研究显
示，Ｌｉｎｃ００６７３在多种人类肿瘤组织中高表达，其在胃癌组织中的表达程度与胃癌的ＴＮＭ分期、淋巴结转移和远处转移等呈正相关
［５ ７］
。本文利用基因克
隆技术构建过表达Ｌｉｎｃ００６７３重组慢病毒载体，通过慢病毒包装和基因转染技术建立过表达Ｌｉｎｃ００６７３的胃癌ＭＧＣ ８０３细胞系，探讨Ｌｉｎｃ００６７３过表达对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用的分子机制。
１ 材料与方法
１．１ 主要材料与试剂
人肾细胞２９３Ｔ、人胃粘膜细胞ＧＥＳ １和胃癌细胞系ＭＧＣ ８０３、ＢＧＣ ８２３、ＡＧＳ由本室冻存；本研究所用重组慢病毒过表达质粒ｐＬＶＸ Ｐｕｒｏ Ｌｉｎｃ００６７３由上海捷瑞生物工程有限公司构建并测序鉴定，对照空载体质粒ｐＬＶＸ ＮＣ和慢病毒包装质粒ｐＭＤ２．Ｇ
、ｐｓＰＡＸ２由中国医学科学院肿瘤医院黄常志教授惠赠；ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、胎牛血清（ＦＢＳ）和胰酶购自Ｇｉｂｃｏ公司；嘌呤霉素、ＭＴＴ和碘化丙啶（ＰＩ）购自Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ公司；ＲＴ ｑＰＣＲ试剂盒为翊圣生物公司产品；细胞凋亡检测试剂盒为４ＡＢｉｏｔｅｃｈ公司产品；所用抗体均为Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司产品。１．２ ＲＴ ｑＰＣＲ检测胃癌细胞中Ｌｉｎｃ００６７３基因的表达
细胞用含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０（ＧＥＳ １、ＭＧＣ ８０３和ＢＧＣ ８２３）或ＤＭＥＭ（ＡＧＳ和２９３Ｔ）培养基于３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度条件下培养，０．２５％的胰酶消化传代。采用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ，逆
转录生成ｃＤＮＡ，用ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ
７Ｆｌｅｘ系统（ＡＢＩ，
美国）进行实时荧光定量ＰＣＲ反应，以甘油醛 ３ 磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）为内参，检测上述细
胞系中Ｌｉｎｃ００６７３的表达。引物由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成，引物序列见表１，反应条件如下：９５℃，３０ｓ预变性；９５℃，１０ｓ变性、６０℃，３０ｓ退火及延伸，循环４０次，
３个复孔／样品，２ ΔΔ
Ｃｔ计算基因的相对表达量。
１．３ 慢病毒包装与细胞转染
利用慢病毒包装质粒ｐＭＤ２．Ｇ和ｐｓＰＡＸ２，由ＰＥＩ介导，将重组质粒ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３和空载体质粒ｐＬＶＸ ＮＣ分别转染２９３Ｔ细胞，获得过表达Ｌｉｎｃ００６７３的慢病毒和对照空载体病毒。常规培养ＭＧＣ ８０３细胞，待细胞密度达到２０％～３０％左右，分别用上述病毒感染细胞，
４８ｈ后用２μｇ／ｍｌ嘌呤霉素筛选，获得稳定表达Ｌｉｎｃ００６７３的ＭＧＣ ８０３细胞系和对照空载体细胞系，ＲＴ ｑＰＣＲ方法鉴定Ｌｉｎｃ００６７３基因的表达。１．４ ＭＴＴ法检测细胞增殖
０．２５％胰酶消化细胞，将转染ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３和ｐＬＶＸ ＮＣ的ＭＧＣ ８０３细
胞分别接种于９６孔板，每孔１０
００个细胞，６个复孔／组，常规培养，每天取一块培养板，弃细胞培养液，ＰＢＳ清洗，加１１０μｌＭＴＴ染液培养４ｈ，弃上清后加１５０μｌＤＭＳＯ溶解沉淀，测４９２ｎｍ吸光度值（ＯＤ４９２），连续５ｄ。１．５ 克隆形成实验
消化对数生长期细胞，制备各组单细胞悬液，细胞计数后将细胞分别以２００个／孔和５００个／孔分散均匀接种于６孔板，
常规培养１８ｄ，甲醇固定３０ｍｉｎ，结晶紫染液染１５ｍｉｎ，拍照、计数细胞集落的形成。
１．６ 细胞周期与凋亡检测
各组细胞培养４８ｈ，０．２５％无ＥＤＴＡ的胰酶消化后Ｐ
ＢＳ洗涤，ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩ双染，上机检测细胞凋亡（ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪，ＵＳＡ），ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ软件分析结果；ＰＩ染检测细胞周期，ＭｏｄＦｉｔ软件分析结果。
１．７ 细胞周期相关调控基因表达检测
消化对数生长期细胞，采用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ，ＲＴ ｑＰＣＲ试剂盒检测细胞周期相关调控因子基因表达。引物序列（５＇→３＇）见表１，ＰＣＲ反应条件同前所述。
Ｔａｂ．１ ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＲＴ ｑＰＣＲ
ＰｒｉｍｅｒＳｅｑｕｅｎｃｅ
Ｌｉｎｃ００６７３Ｆ ５＇ ＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧＧＣＣＴＴＧＧＡＴＧ ３＇，Ｒ ５＇ ＡＣＧＧＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＴ ３＇ＣＣＮＧ２Ｆ ５＇ ＴＧＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＧＧＣＴ ３＇Ｒ ５＇ ＣＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣ ３＇ｐ１９
Ｆ ５＇ ＡＡＣＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＡＧＡＣ ３＇Ｒ ５＇ ＣＴＧＧＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＧＧＴ ３＇ＣＤＫ１Ｆ ５＇ ＴＧＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＧＧＣＴ ３＇Ｒ ５＇ ＣＣＣＡＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣ ３＇ＧＡＰＤＨ
Ｆ ５＇ ＣＣＴＧＧＴＡＴＧＡＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＧ ３＇Ｒ ５＇ ＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣ ３＇
４５ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２２，３８（１）
１．８ 免疫印迹实验检测信号转导通路关键因子
采用ＲＩＰＡ裂解细胞提取总蛋白，测蛋白浓度，取各组４０μｇ总蛋白进行ＳＤＳ—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转到ＰＶＤＦ膜上，５％脱脂奶粉常温封闭１
．５ｈ，ＴＢＳＴ洗膜３次，每次１０ｍｉｎ，分别以１∶１０００稀释一抗Ｂｃｌ ２、ｐＡｋｔ、ＮＦ κＢ、ＥＺＨ２、β ｃａｔｅｎｉｎ以及ＧＡＰＤＨ，４℃孵育过夜，加二抗（１∶５０００），３７℃孵育１ｈ，ＥＣＬ显后化学发光成像分析系统检测目的条带，蛋白表达以靶蛋白／ＧＡＰＤＨ积分光密度表示。１．９ 统计学处理
结果以均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，数据统计分析软件采用ＳＰＳＳ２１，组间比较采用独立样本Ｓｔｕｄｅｎｔ＇ｓｔｔｅｓｔ。
２ 结果
２．１ 胃癌细胞中Ｌｉｎｃ００６７３基因的表达增高
ＲＴ ｑＰＣＲ检测结果显示：Ｌｉｎｃ００６７３基因在三种胃癌细胞株ＡＧＳ、ＭＧＣ ８０３和ＢＧＣ ８２３中的相对
表达量分别为４．３８４±０．５０１、４．５５１±０．２１４和４．５１０±０．２７８，在正常人胃粘膜ＧＥＳ １细胞中的表达量为１．０４３±０．３４１，即Ｌｉｎｃ００６７３在胃癌细胞株
中的表达高于正常胃粘膜细胞（Ｐ＜０．０５），本文选择胃低分化粘液腺癌细胞株Ｍ
ＧＣ ８０３进行过表达实验研究。２．２ ＲＴ ｑＰＣＲ方法鉴定ＭＧＣ ８０３细胞中Ｌｉｎｃ００６７３基因的过表达
ＲＴ ｑＰＣＲ检测结果显示，转染ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３和ｐＬＶＸ ＮＣ的ＭＧＣ ８０３细胞，其Ｌｉｎｃ００６７３基因的相对表达量分别为０
．９９９±０．０１９和２００．０９６±５４．５２７，即后者Ｌｉｎｃ００６７３的表达比ｐＬＶＸ ＮＣ组增加了２００倍（Ｐ＜０．０１）。表明成功建立稳定过表达Ｌｉｎｃ００６７３的ＭＧＣ ８０３细胞系。
２．３ Ｌｉｎｃ００６７３过表达促进ＭＧＣ ８０３细胞生长
如表２所示，Ｌｉｎｃ００６７３过表达的ＭＧＣ ８０３细胞与转染空载体ｐＬＶＸ ＮＣ细胞相比，细胞增殖速度加快，细胞生长第３、４、５日，ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３组ＯＤ４９２均高于ｐ
ＬＶＸ ＮＣ组（Ｐ＜０．０５）。Ｔａｂ．２ ＭＴＴａｓｓａｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏａｓｓｅｓｓｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＭＧＣ ８０３ｃｅｌｌｓ
Ｇｒｏｕｐ１ｄ
２ｄ
３ｄ
４ｄ
５ｄ
ｐＬＶＸ ＮＣ０．２３７±０．０１４０．２９７±０．１４００．３１７±０．０３９
０．３８０±０．０２３
０．３８７±０．０２１
ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３
０．２３８±０．０２０
０．３２０±０．００９
０．４２０±０．０３４
０．４７８±０．０２７
０．５１０±０．０３７
Ｐ＜０．０５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
２．４ Ｌｉｎｃ００６７３过表达促进ＭＧＣ ８０３细胞克隆增殖
克隆形成实验结果显示，在分别接种２００和５００个细胞培养１８ｄ后，转染空载体ｐＬＶＸ ＮＣ组细胞的克隆数分别为７３．３３±１２．６７和１９０．６７±２６．１６，而转染ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３组分别形成１２７．００±２４．３３和３３８．６７±３８．１４细胞克隆，二者比较差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，图１）
。
Ｆｉｇ．１ ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｎｃ００６７３ｐｒｏｍｏｔｅｄｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ＣｅｌｌｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍａｔｉｏｎａｓｓａｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏａｓｓｅｓｓｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｐＬＶＸ ＮＣａｎｄｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３ｉｎＭＧＣ ８０３ｃｅｌｌｓ
２．５ Ｌｉｎｃ００６７３过表达对ＭＧＣ ８０３细胞周期与凋亡的影响
经流式细胞仪检测，ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３组Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期占比分别为６７．５２％±１．６３％、２８．８７％±０．３０％和３．６２％±１．７２％；ｐＬＶＸ ＮＣ组Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期占比分别为６９．７２％±２．８８％和２５．８２％±１．４１％和４．４６％±１．５４％。两组间比较Ｓ期占比差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５，图２Ａ）。细胞凋亡检测结果显示，ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３组细胞早期凋亡率（
ＬＲ）和总凋亡率（ＬＲ＋ＵＲ）分别为０．５２％±０．０２％和４．０９％±０．３６％，而对照组分别为３．９０％±０．３９％和５．５２％±０．２９％，即Ｌｉｎｃ００６７３过表达的胃癌细
胞早期凋亡和总凋亡率均低于对照组细胞，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０１，图２Ｂ）。２．６ Ｌｉｎｃ００６７３过表达对细胞周期调控基因表达的影响
ＲＴ ｑＰＣＲ检测结果显示，Ｌｉｎｃ００６７３过表达使ＭＧＣ ８０３细胞周期调节基因ＣＣＮＧ２和ｐ１９的表达
量降低，而ＣＤＫ１的表达量显著增高，与对照组相比，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，表３）
５
５中国应用生理学杂志，２０２２，３８（１）
Ｆｉｇ．２ ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＬｉｎｃ００６７３ｏｖｅｒｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎＭＧＣ ８０３ｃｅｌｌｃｙｃｌｅａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ
Ａ：ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｎｃ００６７３ｐｒｏｍｏｔｅｄＳ ｐｈａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＧＣ ８０３ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ；Ｂ：ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｎｃ００６７３ｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅａｐｏｐ ｔｏｔｉｃｒａｔｅｏｆＭＧＣ ８０３ｃｅｌｌｓ
Ｔａｂ．３ ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｎｃ００６７３ａｆｆｅｃｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｉｎＭＧＣ ８０３ｃｅｌｌｓ
ＧｒｏｕｐＣＣＮＧ２ｐ１９ＣＤＫ１
ｐＬＶＸ ＮＣ１．０１４±０．１８４１．００６±０．１５７１．００４±０．１１９
ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３０．５７５±０．２９０ ０．１２８±０．０１１ １．６４３±０．０３４ Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ２．７ Ｌｉｎｃ００６７３过表达影响细胞增殖与凋亡的机制
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法在蛋白水平检测各组转染细胞ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路关键分子ｐＡｋｔ及其下游靶因子ＮＦ κＢ和Ｂｃｌ ２蛋白的表达，同时还检测细胞增殖相关因子β ｃａｔｅｎｉｎ和ＥＺＨ２蛋白的表达，结果显示，过表达Ｌｉｎｃ００６７３的细胞中上述因子的表达量均明显增高（Ｐ＜０．０１，图３，表４）
。
Ｆｉｇ．３ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＰＩ３Ｋ／Ａｋｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ ｒｅｌａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｃｅｌｌｓｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐ
Ｔａｂ．４ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＬｉｎｃ００６７３ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎＰＩ３Ｋ／Ａｋｔｓｉｇｎａｌｐａｔｈｗａｙ
ＧｒｏｕｐＥＺＨ２Ｐ ＡｋｔＢＣＬ ２ＮＦ κＢβ ｃａｎｔｅｎｉｎｐＬＶＸ ＮＣ０．６１９±０．０３６０．９２２±０．０４１０．６２２±０．０６４０．１４５±０．０３８０．３１４±０．０５４ｐＬＶＸ Ｌｉｎｃ００６７３０．９３０±０．０２７ １．６０２±０．０８０ ０．９２１±０．０４７ ０．９４６±０．１０７ １．３８２±０．１１１ Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
３ 讨论
胃癌是全球常见癌症之一，给患者带来极大困扰。多年来，学者们一直致力于对该病发病机制、诊疗方面进行研究［８，９］，近年来ＬｎｃＲＮＡ在胃癌中的作用逐渐引起关注，Ｌｉｎｃ００６７３
定位于人染体１７ｑ２４．３，最初被证实为胰腺癌易感基因，具有抑癌基因的作用［１０］。随后的研究发现，Ｌｉｎｃ００６７３在肺癌、乳腺癌等多种人类肿瘤中表达增高，属于癌基因，细胞水平实验证实其过表达可促进肺癌、肝癌、乳腺癌以及甲状腺癌等多种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［１１ １５］，本课题组前期研究显示，Ｌｉｎｃ００６７３在胃癌患者血清中的表达明显高于正常人，但其过表达对胃癌细胞的调控作用及相关分子机制却鲜有报道。
本研究发现，Ｌｉｎｃ００６７３在ＭＧＣ ８０３、ＢＧＣ ８２３以及ＡＧＳ等多种胃癌细胞系中的表达量均显著高于正常胃粘膜细胞，因此推测Ｌｉｎｃ００６７３的异常表达与胃癌的发生和发展可能存在相关性。进而通过细胞水平实验证实，胃癌细胞ＭＧＣ ８０３中过表达Ｌｉｎｃ００６７３导致细胞生长和克隆增殖加快；流式细胞术检测显示，ＭＧＣ ８０３细胞过表达Ｌｉｎｃ００６７３产生Ｓ期比例增高、细胞早期凋亡及总凋亡比率降低等生物学改变，上述结果提示其在ＧＣ的发生发展过程中起到一定的致癌、促癌作用。
多种ＬｉｎｃＲＮＡ通过ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路途径发挥对肿瘤细胞的调控作用，如沉默ＳＴＸＢＰ５ ＡＳ１和Ｌｉｎｃ００６７３基因均可抑制该通路，进而影响ＧＣ、胶质
６
５ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２２，３８（１）
瘤细胞的增殖、迁移等一系列生物学行为［１６，１７］。为了探讨Ｌｉｎｃ００６７３过表达影响ＭＧＣ ８０３细胞增殖与凋亡的分子机制，本研究在蛋白水平对ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路关键分子Ａｋｔ及其下游靶标ＮＦ κＢ和Ｂｃｌ ２进行检测，结果显示，过表达Ｌｉｎｃ００６７３的细胞中不仅ＰＩ３Ｋ下游分子磷酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）表达增高，而且ＮＦ κＢ和Ｂｃｌ ２的表达量亦显著增高，ＮＦ κＢ蛋白促进细胞增殖，而Ｂｃｌ ２则是细胞凋亡抑制蛋白，这些蛋白表达增加将导致ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路活性增强。
细胞周期进程有一系列正负性调节因素，如Ｃｙｃｌｉｎ家族中的ＣＤＫｓ起正性调节作用，而ＣＣＮＧ２、ｐ１９则起负性调节作用，过表达Ｌｉｎｃ００６７３后，胃癌细胞上述细胞周期相关调控基因表达均发生了变化。此外，本研究还发现，Ｌｉｎｃ００６７３过表达导致β ｃａｔｅｎｉｎ和ＥＺＨ２蛋白表达量也显著上调，二者均与细胞增殖相关，其中ＥＺＨ２还与细胞的运动迁移相关。因此，Ｌｉｎｃ００６７３过表达可能通过ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路影响细胞增殖和凋亡相关基因、蛋白的表达，进而影响胃癌细胞的生物学行为。
值得一提的是，本研究显示Ｌｉｎｃ００６７３在ＧＣ中表达较高，也有报道持其他观点，此外，β ｃａｔｅｎｉｎ是Ｗｎｔ信号通路的关键分子，多种癌基因、抑癌基因以及ＬｉｎｃＲＮＡ可通过Ｗｎｔ／β ｃａｔｅｎｉｎ信号通路调控肿瘤的发生发展，例如ＬｉｎｃＲＮＡＣＡＳＣ１１可通过Ｗｎｔ／β ｃａｔｅｎｉｎ信号通路促进宫颈癌的迁移和侵袭［１８］，最近有文献报道Ｌｉｎｃ００
６７３通过该信号通路促进肺腺癌的进程［１９］。细胞内信号传导网络复杂，信号通路之间亦存在着相互调节和关联，Ｌｉｎｃ００６７３是否可能也通过其他信号通路对ＧＣ的发生发展进行调控，其机制如何？尚需进一步的研究证实。
综上所述，ＬｉｎｃＲＮＡ００６７３在ＧＣ中表达较高，且其过表达可通过ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路促进胃癌细胞增殖、抑制细胞凋亡，可能是ＧＣ患者的分子诊断中的生物标志物和靶点。
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