液体菌种工作总结_暑假实习工作总结工作总结
(2022-11-22 22:29:46)
目的要求
实验内容
1.细菌染的一般程序
涂片干燥固定 初染 (媒染) 脱复染
（1） 涂片临床标本或液体可直接涂在干净的载玻片上。对于固体培养的细菌，首先在玻片上滴一滴生理盐水，然后取一点细菌，在盐水中均匀研磨，显示轻度浑浊。涂层膜的尺寸通常约为1cm2。
(2)干燥 涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。
（3） 固定细菌常用火焰加热法，即干燥后的涂片快速通过火焰3~5次，用手触摸时温度热而不烫伤。其目的是杀灭细菌、凝结并改变细菌对染料的渗透性。 (4) 初染 不同的染，所用染液也不同。染液以覆盖菌膜为度。 （5） 媒染剂染可以通过媒染剂染提高染料与被染物质之间的亲和力。媒染剂也可用于定影，也可包含在定影液或染料溶液中。
(6) 脱 此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度，作为鉴别染之用。
（7） 脱后，为了便于观察，通常用复染液对细菌的一次染进行复染。复染液的颜明显不同于初染液。
2．常用染料原液配制
制备一00ml纯乙醇饱和溶液所需染料用量一般为：亚甲基蓝2G~5g；结晶紫7g~14g；
碱性品红3G~7g。
3．常用的染方法
（1） 单一染是一种用染料染的方法。它常用于使用卢氏美兰或稀释的石炭酸发红溶液。
1) 染液
① Lu的亚甲蓝溶液为30ml亚甲蓝醇饱和溶液+70ml 0.01%氢氧化钾溶液。
② 稀释石炭酸复红液 碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸馏水作10倍稀释即成。
2） 大肠杆菌普通倾斜培养。
3) 染方法 于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染1min，以水冲洗至无颜流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。
4） 结果亚甲蓝染细胞呈蓝；用稀释的石炭酸染的细胞呈红。
(2) 革兰染法
1） 主要细菌用结晶紫染，然后用媒染剂染成深紫或紫黑。如果用酒精去除颜并再次染红，则称为革兰氏阴性菌；如果不经酒精脱，仍为紫黑，称为革兰氏阳性菌。
革兰染的原理尚未完全明了，主要有三种学说：① 等电点学说 革兰阳性菌的等电点低(pH2～3)，革兰阴性菌等电点较高(pH4～5)，一般染液pH值
约为7.0，因此电离后阳性细菌携带的负电荷比阴性细菌多。因此，它们吸收更多带正电荷的染料（如结晶紫），不易脱。② 通透性理论：革兰氏阳性菌的细胞壁通透性小于革兰氏阴性菌，脱剂易溶解，染料易通过革兰氏阴性菌的细胞壁洗涤，易于脱；阳性菌细胞壁通透性低，不易脱。③ 化学理论革兰氏阳性细菌的细胞中含有一种特殊的化学成分。通常认为它是核糖核酸镁盐和多糖的复合物。与染料媒染剂结合，使有细菌不易脱；革兰氏阴性菌含有较少的RNA镁盐复合物，易于脱。
2) 染液
① 结晶紫染料溶液：取结晶紫饱和溶液20ml+1%草酸铵水溶液80ml，混合过滤。② Lugo碘溶液取碘化钾2ml，在10ml蒸馏水中充分溶解，然后加入碘1g，完全溶解后加入蒸馏水至300ml。
③ 脱剂 95%乙醇。
④ 稀释石炭酸双红单染法。
3) 菌种 大肠埃希菌和葡萄球菌混合菌液。
4） 方法
① 初染 将结晶紫染液2～3滴加于制好的涂片上，染 1min，水洗；② 媒染 加卢氏碘液2～3滴染1min，水洗；
③ 脱95%乙醇脱0.5min（直至无紫脱落），用水冲洗；
④ 复染 加稀释石炭酸复红数滴，染1min，水洗干后镜检。
5） 结果革兰阳性菌呈紫，革兰阴性菌呈红。
6) 注意事项 ① 涂片不宜过厚，否则脱受影响，使革兰阴性菌染成革兰阳性菌，造成错误鉴定。② 为防止染液蒸发而改变浓度，碘液的颜变淡应弃去。③ 涂片积水过多会改变染液浓度，影响染效果，故每次水洗后应将玻片甩干。④ 注意细菌的菌龄，一般以18h～24h左右培养物效果最好，菌龄过长影响细菌染性。
（3） Ziehl-Neelsen：主要用于结核分枝杆菌和麻风病的检查。
1) 染液
① 将石炭酸发红染料溶液与10ml碱性发红酒精饱和溶液和90ml 5%石炭酸水溶液混合。
② 脱剂 3%盐酸酒精。
③ 复染剂，卢氏美兰染液，同一染方法。
2) 菌种 卡介苗和表皮葡萄球菌混合液。
3） 方法
① 初染 在已固定的涂片上滴加石炭酸复红染液，远火徐徐加热至有蒸汽冒出，但切不可沸腾，并随时添加染液，染3 min～5min，冷却后水洗。② 脱 滴加3%盐酸酒精脱至无红流下为止，一般为2min。③ 复染 水洗后用吕氏美兰复染0.5 min～1min，水洗干后镜检。
4） 结果抗酸菌呈红，非抗酸菌呈蓝。
5) 注意事项 ① 加热时火切勿过大，防止染液沸腾。② 每张玻片只允许放一份标本，以免阴阳结果混淆。③ 用过的玻片要彻底洗干净，防止抗酸菌留在玻片上。④ 切勿使用染缸，印干的滤纸只能一片一张，不得重复使用。⑤ 脱时间宁长勿短，以免误诊。⑥ 为防止实验室感染，标本要高压灭菌后再制片。
（4） Panpenhein染法主要用于检测尿液和粪便中的抗酸细菌。
当用萋-纳抗酸染检出抗酸菌后，用该方法染，结核分枝杆菌染成红，耻垢分枝杆菌染成蓝。
1） 染液
① 石炭酸复红染液 见萋-纳抗酸染法。
② 从复染液中取红铬酸1g，溶于100ml无水乙醇中，再加亚甲基蓝2G（至饱和），室温放置4天，使其完全溶解，过滤，加甘油20ml，混匀备用。
2) 标本 怀疑肾结核患者的尿液。
3） 方法
① 初染 于制好的涂片上滴加石炭酸复红染液数滴加温染2min。② 复染 倾去染液勿水洗，滴加复染液，边滴边倾去，重复4～5次后，水洗、待干、镜检。
3） 结果结核分枝杆菌呈红，耻垢分枝杆菌等细菌呈蓝。
(5) 鞭毛镀银染法
1） 染液
① 甲液 鞭酸5g，三氯化铁5g，36%甲醛1ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100ml。② 乙液
取AgNO3 2g溶于100ml蒸馏水中，临用前用15%氨水滴定，出现棕沉淀后继续滴加氨水直至呈现乳白薄雾状为止。
2） 方法
① 将奇异变形杆菌在1.4%的软琼脂上传两代，形成迁徙生长现象。取洁净玻片一张，于玻片上滴加蒸馏水一滴，然后取上述迁徙生长边缘的细菌少许，轻轻点于蒸馏水中，使其自然扩散、干燥，切勿火焰固定。
② 将指甲液滴在配制好的涂片上，染3~5分钟，用蒸馏水冲洗。
③ 用乙液冲去残水后，加乙液0.5 min～1min，并在火焰上方稍加热，用蒸馏水冲洗，干后镜检。
3） 结果细菌呈深棕，鞭毛呈浅棕。
4) 注意事项 ① 细菌培养时传代次数因菌种不同可适当增加。② 制涂片时菌量不宜过多，动作要轻，切勿研磨，以免鞭毛脱落。③ 加乙液后加热温度不要太高。
（6） 魏氏鞭毛染
1) 染液 饱和钾明矾液2ml，5%石炭酸液5ml，20%鞣酸液2ml相混合。临用时加碱性复红酒精饱和液1ml，混合后过夜，次日过滤后使用。此染液以3日内使用效果最好。
2） 方法将奇异变形杆菌在1.4%软琼脂中培养两代，形成迁移生长现象。取高度清洁的载玻片，在载玻片上加一滴蒸馏水，然后在迁移生长边缘取一点细菌，在蒸馏水中轻轻拍打，使其自然扩散，放入37℃恒温箱中自然干燥。不需要火焰固定。滴染液0.5~1min，用水冲洗至干燥，镜检。
3) 结果菌体与鞭毛均呈红。
（7） 孢子染
1) 染液
① 石炭酸双红染液见耐酸染法。
② 脱剂 95%乙醇。
③ 双染液、鲁美兰染液，与单染法相同。
2) 菌种 芽胞杆菌普通斜面培养物。
3） 方法
① 初染 于制好的涂片上滴加石炭酸复红染液加热染3 min～5min，勿使染液沸腾。
② 水洗后脱，用95%乙醇脱约1min，用水冲洗。
③ 复染 加吕氏美兰染液染1min，水洗干后镜检。
4） 结果孢子呈红，细菌呈蓝。
(8) 黑斯(Hiss)荚膜染法
1） 染料溶液结晶紫染料溶液：取结晶紫饱和溶液5ml，加蒸馏水95ml混合；20%硫酸铜水溶液。
2) 标本 提前数日小白鼠腹腔注射肺炎链球菌菌液0.2ml，小鼠死亡后解剖取腹腔液印片。
3） 方法
① 将印片在空气中自然干燥，无需加热固定。
② 滴下结晶紫染料溶液，在火焰上加热，直到蒸汽出来。不要用水洗。③ 用20%硫酸铜溶液冲洗染料溶液，不要用水冲洗，干燥后进行显微镜检查。
4) 结果 菌体呈紫，荚膜呈淡紫。
（9） 阿尔伯特异染颗粒染法
1) 染液
① 将0.15g甲苯胺蓝和0.2g孔雀石绿溶于2ml 95%乙醇中，加入100ml蒸馏水和1ml冰醋酸，放置24h，过滤备用。
② 乙液 将碘化钾3g溶于蒸馏水10ml～20ml中，再加碘2g等溶解后加蒸馏水至300ml备用。
2） 菌株白喉棒状杆菌Lv的卵子倾斜培养。
3) 方法 已固定的涂片上加甲液染3 min～5min，水洗后，再加乙液染1min，水洗待干，镜检。
4） 结果细菌呈蓝绿，变颗粒呈蓝黑。
(10) 刚果红染法(负染法)：背景着而菌体不着的染方法。
