对羟基苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）的结构及其吡唑类除草剂的最新研究进展20世纪90年代, 对羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-hy-droxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD)⾸次被确定为除草剂作⽤靶 标.以HPPD为靶标的除草剂具有⾼效、低毒、作物安全性⾼、不易产⽣抗性、环境相容性好以及对后茬作物安全等⼀系列优点[1]. HPPD是⽣物体内酪氨酸代谢过程中重要的酶, 它⼏乎存在于所有需氧⽣物体内.⽣物体内酪氨酸(Tyrosine)在酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase, TAT)的作⽤下⽣成对羟基苯丙酮酸(p-hydroxyphenylpyruvic acid, HPPA), 在氧⽓的参与下HPPD能够将HPPA催化转化成尿⿊酸(HGA).在植物体内, 尿⿊酸(HGA)能够被进⼀步转化成质体醌和⽣育酚[2].⽣育酚是植物体内重要的抗氧化物质, 能有效地增强植物的抗逆性.质体醌是植物进⾏光合作⽤过程中关键的辅助因⼦, 促进植物体内类胡萝⼘素等的合成.在植物体中⾼于60%的叶绿素都结合于捕光天线复合物上, 该复合物吸收太阳光能并将激发能传递给光合作⽤反应中⼼, ⽽类胡萝⼘素是反应中⼼的叶绿素结合蛋⽩和天线系统的重要组成部分, 在植物光合作⽤中担负着光吸收辅助⾊素的重要功能, 具有吸收和传递电⼦的能⼒, 并在清除⾃由基⽅⾯起着重要的作⽤.因此, ⼀旦HPPD的活性被抑制, 植物体内酪氨酸正常代谢将被阻断, 导致在植物体内类胡萝⼘素的缺乏, 从⽽诱导叶绿素光氧化作⽤减弱, 影响植物的光合作⽤, 促使植物产⽣⽩化症状⽽死亡[3~7]. 结合最新的研究进展, 本⽂对⽬前已经报道的不同种属来源的HPPD的晶体结构、抑制剂⼩分⼦与靶标酶的结合模式及其在植物体内的代谢产物进⾏系统的总结, 同时对不同商品化吡唑类HPPD除草剂的优缺点
进⾏对⽐分析, 并对这类除草剂的发展⽅向进⾏了介绍.
1 HPPD的结构、活性位点及其可能催化机理1.1 HPPD的结构及活性位点
HPPD抑制剂作为除草剂的使⽤历史可以追溯到20世纪80年代初, 1980年⽇本三共制药有限公司⾸次将吡唑特投⼊到世界除草剂市场.当时并不知道吡唑特的作⽤靶标就是HPPD. HPPD真正被确定为除草剂作⽤的靶标是从20世纪90年代开始.随后, ⼈们不断地从⽼⿏[8]、猪[9]、兔[10]以及⼈的肝脏[11]、⽟⽶[12]、胡萝⼘[13]、拟南芥[14]、荧光假单胞菌[15]和链霉素[16]等体内提取或克隆HPPD.⽬前, ⽂献上已经报道的主要有14个HPPD或其复合物的晶体结构, 其中有12个晶体结构已经被蛋⽩质数据库(PDB)收录, 详细信息见表 1.拟南芥是植物界⾥⾯⼀个具有代表性的模式⽣物, 因此关于HPPD的晶体结构报道的最多的是拟南芥源HPPD (AtHPPD).其中⼤部分晶体结构是以⼆聚体的形式存在的.
表 1 已经公布的HPPD的晶体结构信息
Table 1. Announced HPPD crystal structure information
对⽐分析拟南芥源和⼈源的HPPD晶体结构[24](图 1)可以看出, 来⾃拟南芥源HPPD (AtHPPD)和⼈源HPPD (hHPPD)晶体结构具有⾼度的相似性, 每个单体都是由具有相似的拓扑结构域组成, 都存在着⼀种α/β折叠⽅式, 该折叠是由⼀个平⾏的和反平⾏的β链围绕着⼀个α螺旋所组成的结构.其活性位点位于
⼀个扭曲打开的β折叠区, 由7个β折叠构成.在活性空腔内, 具有催化活性的Fe2+以六配位的形态存在, 与相邻的⾼度保守的氨基酸残基(⼀个⾕氨酸和两个组氨酸)及⼀分⼦游离的⽔形成配位作⽤, 并和底物HPPA分⼦中的两个氧原⼦形成双齿螯合型配位键, 进⽽形成⼀个稳定的⼋⾯体结构, 发挥其⽣物催化功能.随后⼈们对于不同种属来源的HPPD的差异性也进⾏了深⼊研究.
图1hHPPD晶体结构(A, 2.1 Å)和AtHPPD与抑制剂的共晶体结构(B, 2.62Å) Figure1.Crystal structure of hHPPD (A,
2.1Å) and crystal structure of inhibitor with AtHPPD (B, 2.62 Å)
2004年Walsh[14]及2013年Richard和Jane等[19]分别对不同种属来源的HPPD进⾏结构⽐对分析(表2).通过对⽐分析，植物与哺乳动物的HPPD氨基酸序列的同源性存在显著的差异性, ⽽同为植物界或者动物界的同源性⽐较⾼.哺乳纲的⼈和⽼⿏的氨基酸序列的同源性⾼达90%.同时, 在HPPD的活性空腔内, 对其52个具有⽣物活性的氨基酸残基位点进⾏对⽐分析, AtHPPD与哺乳纲的⼈、⼩⿏及猪的活性位点差异个数为13~14个, ⽽同为哺乳纲的⼈、⼩⿏及猪的活性位点的氨基酸残基差异个数只有1~2个.因此, 为后续开发具有⾼选择性、安全性的HPPD类除草剂提供了理论指导基础.
表 2 不同种属来源的HPPD氨基酸序列⽐对aTable 2. Different species of HPPD amino acid sequence alignment
结合计算化学⽅法[20], 分别选取AtHPPD (PDB编号: 1SQD), RnHPPD (PDB编号: 1SQI)以及hHPPD (PDB编号: 3ISQ)的晶体结构, 以HPPD催化中⼼Fe2+周围12 Å范围内的氨基酸作为活性位点的考虑范围进⾏序列⽐对(图2).结果表明hHPPD与RnHPPD的活性腔序列相似性⾼达97%, AtHPPD与hHPPD和RnHPPD相⽐, 活性腔序列相似性都为66%, 图中虚线框中的氨基酸为催化中⼼Fe2+周围12 Å范围内的氨基酸残基, 灰⾊代表在三类种属HPPD活性腔中有差异的氨基酸残基位点, 共17个, 但是其中只有两个位点的氨基酸残基Met314和Lys400(以拟南芥1SQD为标准)是在结合位点附近，通过序列⽐对其在RnHPPD (PDB ID: 1SQI)中的等位残基分别为Leu289和Ala361, 在hHPPD (PDB ID: 3ISQ)中的等位
通过序列⽐对其在RnHPPD (PDB ID: 1SQI)中的等位残基分别为Leu289和Ala361, 在hHPPD (PDB ID: 3ISQ)中的等位残基分别为不同种属来源的HPPD其活性位点氨基酸残基具有⼀定Leu289和Ala361.从氨基酸序列⽐对的结果分析, 的差异性.其可能会影响抑制剂与HPPD结合的稳定性, 导致抑制剂分⼦在不同种属来源的HPPD抑制活性的不同, 为后续设计选择性好、安全性⾼的抑制剂提供理论基础.
图2AtHPPD, hHPPD和RnHPPD催化中⼼的氨基酸序列⽐对 Figure2.Sequence alignment of the amino acids in the active sites of AtHPPD, hHPPD and RnHPPD
1.2 HPPD的可能催化机理
⽂献上已经报道了多种植物体内HPPD催化HPPA⽣成HGA的这⼀⽣物反应机制[21~23], ⽽普遍接受的是如Scheme 1所⽰的催化反应机理[24~27].
图式1⽬前⼴泛认可的HPPD催化反应机理
Scheme1.The commonly recognized HPPD catalytic reaction mechanism
该机理包括羰基的脱除反应、芳⾹环的羟基化和取代基的迁移反应.在催化反应进⾏的时候, HPPA⾸先与HPPD的催化活性中⼼Fe2+进⾏配位形成⼀个六配位过渡态(step 1), 紧接着⼀分⼦氧插⼊到该过渡态中, ⼆价铁随后被氧化成了四价铁形成了过渡态(step 3).经过O—O键的断裂以及⼆氧化碳的脱除反应得到过渡态(step 4), step 4结构中的苯环是⼀个富电⼦的官能团, 它进攻⾼价铁中的氧原⼦形成step 5.四价铁随后被还原成⼆价铁, 再经过烷基的迁移反应、烯醇互变反应得到过渡态(step 7), step 7脱除尿⿊酸完成了整个催化反应循环.在完成⼀个催化反应循环后, HPPD⼜继续进⾏下⼀个催化反应过程, 所得到的尿⿊酸进⼊后续的⽣理转换过程中.
2 吡唑类HPPD除草剂的作⽤模式及研究历程2.1 吡唑类HPPD除草剂的作⽤模式
HPPD⼴泛存在于⾃然界的各种需氧⽣物体中.从催化中⼼的结构上来讲, HPPD属于2-组氨酸-1-羧酸盐⾯三联体结构氧化酶⼤家族中的⼀员, 从在细胞中的位置上来讲, HPPD⼜属于细胞质酶.近年来⼈们也
培养出了⼀些商品化的抑制剂与AtHPPD复合物的晶体结构. 2008年拜⽿公司报道了磺酰草吡唑与AtHPPD复合物单晶[28].从所得到的AtHPPD-磺酰草吡唑复合晶体结构分析, 磺酰草吡唑与AtHPPD的结合⼒主要受两个⽅⾯的因素控制:⼀⽅⾯是磺酰草吡唑分⼦中的氧与⼆价铁之间的螯合作⽤⼒, 另⼀⽅⾯是磺酰草吡唑分⼦中的疏⽔基团与催化⼝袋之间的疏⽔作⽤⼒.
HPPD催化活性中⼼位于⼀个开⼝扭曲的螺旋状的β结构中, 该结构是由7个β折叠组成.晶体的每⼀个单体中都含有⼀个⼆价铁离⼦, ⼆价铁是以六配位的形式存在的, 其中2个组氨酸、⼀个⾕氨酸以及⼀个⽔分⼦各占据⼀个配位键, 抑制剂分⼦中苯甲酰⼄烯⽚段的2个氧原⼦各⾃与Fe2+形成⼀个配位键(图3).磺酰草吡唑分⼦中N上的甲基朝向⼀个疏⽔性的⼩⼝袋之中, 这个⼝袋很⼩说明在吡唑环上不能引⼊体积过⼤的基团.磺酰草吡唑分⼦中的苯环结构能够与周围的2个苯丙氨酸形成三明治型的π-π堆积作⽤.由于苯环上间位的三氟甲基结构与周围疏⽔性氨基酸残基的距离⼩于4 Å, 它们之间会存在⼀个疏⽔相互作⽤⼒.在实验的过程中⼈们也发现AtHPPD中C-端螺旋结构会呈现出开关构象, 当处于开放的构象时则有利于底物进⼊到催化位点以及产物的释放; ⽽处于闭合的构象时则有利于保护催化反应免受溶剂的影响.
图3AtHPPD-磺酰草吡唑的结合模式图
Figure3.Simulated binding model of pyrasulfotole in AtHPPD
2.2 商品化的吡唑类HPPD除草剂
HPPD是继⼄酰辅酶A羧化酶(ACCase)、⼄酰乳酸合成酶(ALS)后的⼜⼀重要的除草剂作⽤靶标.由于其独特的作⽤机制可以有效防治多种抗性杂草.商品化的HPPD除草剂主要分为三酮类、吡唑类、异噁唑类(⼆酮腈).三酮类和异噁唑类已有相关的⽂献报道. 2016年新上市的HPPD除草剂环吡氟草酮和双唑草酮都属于吡唑类, 因此主要对吡唑类HPPD除草剂的研究现状进⾏总结. 20个世纪70年代, ⽇本三共制药公司报道了苄草唑(Pyrazolynate), 商品名为“Sanbird”.主要⽤于⽔稻⽥, 在3~4 kg ai/ha的剂量下对⼀年⽣或多年⽣的杂草具有较好的防效.苄草唑作为⼀种前药, 在⽔中分解释放出具有⽣物活性分⼦.通过植物的吸收传导, 到达作⽤靶点进⽽发挥药效.苄草唑在⽔中的半衰期与温度和pH相关, 尤其是在偏碱性的⽔中半衰期只有4.3 h (T＝25 ℃), 在⼟壤中的降解时间DT50＝8~10 d, 因此严重制约了苄草唑的药效.苄草唑的合成路线如Scheme 2所⽰, 2,
(T＝25 ℃), 在⼟壤中的降解时间DT50＝8~10 d, 因此严重制约了苄草唑的药效.苄草唑的合成路线如Scheme 2所⽰, 2, 4-⼆氯苯甲酰酰氯Ⅱ-1b和吡唑醇Ⅱ-1a在Ca(OH)2作碱及异丙醇作溶剂的条件下得到化合物Ⅱ-1c. Ⅱ-1c再与对甲苯磺酰氯反应即能制备苄草唑.该合成路线便捷, 合成成本低廉, 在初期也有⾮常好的市场价值.
图式2苄草唑、苄草酚和吡草酮的⼯业合成路线
Scheme2.Synthetic routes of pyrazolynate, pyrazoxyfen and benzofenap
1984年, Kimura[29]⾸次报道了苄草酚(Pyrazoxyfen). 1985年, ⽇本⽯原产业株式会社正式将苄草酚推向市场, 商品名为“Paicer”.同样适⽤于⽔稻⽥, 在推荐剂量3 kg ai/ha下, 对灌溉⽥的阔叶杂草具有较宽的杀草谱.然⽽, 苄草酚对⽔稻的安全性受温度的影响.当⽓温低于35 ℃时, 对于移栽稻⽥和直播稻⽥的⽔稻不会产⽣毒副作⽤; 当⽓温⾼于35 ℃时, 则会对⽔稻产⽣短暂物毒性, 因此其在推⼴过程中受到了严重的限制.其合成路线与苄草唑类似(Scheme 2).
1987年, ⽇本三菱⽯油化⼯和RhÔne-Poulenc Agro (Bayer Crop Science)⾸次将吡草酮(Benzofenap)应⽤于商品化, 其商品名为“Yakawide”.由于结构的差异性, 相对于苄草酚, 吡草酮延长了其在⼟壤中的半衰期, 在同等剂量下吡草酮的药效时间可以增加⾄50 d, ⽽苄草酚的药效时间约为21~35 d; 同时吡草酮具有更好的作物选择性并且能够有效地避免⾼温致使其对⽔稻产⽣的短暂的药害现象.具体的合成路线如Scheme 2.
苯吡唑草酮(Topramezone)是由德国巴斯夫公司开发的⽟⽶⽥除草剂. 2006年, 在北美洲和欧洲同时上市, 其商品名分别为“Impact”和“Clio”.在推荐使⽤剂量50~75 g ai/ha的条件下, 它能够有效的防治⼀年⽣⽟⽶⽥中多种阔叶杂草和⽲本科杂草, 相对于硝磺草酮、磺草酮, 其对狗尾草、马齿苋、马唐等杂草的防效⼏乎可以达到百分之百.同时, 与其他类的除草剂如⼆甲酚草胺、烟嘧磺隆制成混剂, 可有效拓宽杀
草谱; 与三嗪类除草剂或麦草畏制成混剂⼏乎可以防治所有种属的阔叶杂草.⽬前, 苯吡唑草酮是⽟⽶⽥最为安全、⾼效的HPPD类除草剂; 其⼏乎对所有品种的⽟⽶都表现出⾼度安全性.⼯业可能的合成路线如Scheme 3, 以2, 3-⼆甲基硝基苯(Ⅱ-2a)为起始原料, 经过与亚硝酸丁酯反应得到安息⾹醛肟Ⅱ-2b, Ⅱ-2b 经过氯化再与⼄烯反应得到含异噁唑结构的中间体Ⅱ-2d.再经过后续的硝基还原反应、氨基甲硫基化、溴化、氧化以及偶联反应即能制备苯吡唑草酮[30].
图式3苯吡唑草酮的⼯业合成路线
Scheme3.Industrial synthetic route of topramezone
2000年, Aventis CropScience (Bayer CropScience)⾸次报道了磺酰草吡唑(Pyrasulfotole)[31]. 2008年, 拜⽿公司在北美洲和澳⼤利亚同时将其推向市场, 其商品名分别是“Huskie”和“Velocity”.其作为苗后除草剂, 在25~50 g ai/ha的剂量下, 能够有效地防治常见的阔叶杂草, 如繁缕(Stellaria media)、藜属(Chenopodium album)、茄属植物(Solanum spp.)、苋属(Amaranthus spp.)和苘⿇属(Abutilon theophrasti), 但对于部分的⼀年⽣⽲本科杂草(狗尾草, Setaria viridis (L.) Beauv.)的防治效果并不理想.截⽌⽬前, 其还未见有交互抗性的例⼦报道.磺酰草吡唑是⾸个⽤于⾕物⽥的HPPD类除草剂, 与安全剂(吡唑解草酯)制成混剂能够显著地提⾼作物抗药性, 使其⼏乎对所有品种的⼩麦、⼤麦和⿊⼩麦表现出优异的作物安全性.磺酰草吡唑的⼯业化⽣产路线见Scheme 4, 以2-氯-4-三氟甲基苯甲酸钠盐(Ⅱ-3a)为起始原料, 经过硫甲基化、氧化、酰氯化、酯化、重排反应即可合成磺酰草吡唑.
图式4磺酰草吡唑的⼯业合成路线
Scheme4.Industrial synthetic route of pyrasulfotole
2016年, 青岛清原抗性杂草防治有限公司发布了2个专利化合物——环吡氟草酮[32](Pucaoke, 商品名“普草克®”)和双唑草酮[33](Xueying-TM, 商品名“雪鹰TM”) (Scheme 5), 是国内⾸次将HPPD抑制剂类的新化合物引⼊到⼩麦⽥抗性⽲本科和阔叶杂草的防治上, 很好地解决了⼄酰乳酸合成酶(ALS)和⼄酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂的抗性和多抗性问题, 尤其是环吡氟草酮是全球⾸次将HPPD抑制剂类化合物引⼊到⼩麦⽥抗性⽲本科杂草的防治上.环吡氟草酮属于新型HPPD 类除草剂, 可有效地防治⼤麦⽥⼀年⽣的多种单⼦叶和阔叶杂草, 与麦⽥常⽤的精噁唑⽲草灵、炔草酯、唑啉草酯、三甲苯草酮、啶磺草胺、甲基⼆磺隆、氟唑磺隆、异丙隆等不存在交互抗性, 可以有效解决当年抗性及多抗性的看麦娘等⽲本科杂草及部分阔叶杂草.双唑草酮对⾼粱⽥的阔叶杂草具有突出的防效, 且与当前麦⽥常⽤的双氟磺草胺、苯磺隆、苄嘧磺隆、噻吩磺隆等⼄酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)抑制剂类除草剂, 唑草酮、⼄羧氟草醚等多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)抑制剂类除草剂以及⼆甲四氯钠、2, 4-D等激素类除草剂不存在交互抗性, 可以有效解决抗性以及多抗性的播娘蒿、荠菜、野油菜、繁缕、⽜繁缕、麦家公等阔叶杂草.
图式5双唑草酮和环吡氟草酮的⼯业合成路线
Scheme5.Synthetic routes of Xueying-TM and Pucaoke®
图选项
2.3 商品化吡唑类HPPD抑制剂的代谢机制
药物代谢是研究药物在⽣物体内的吸收、分布、⽣物转化和排泄等过程的特点和规律, 是药物研发产业链中的重要环节，贯穿药物研究过程的始终.因此, 研究药物在⽣物体内的代谢过程和代谢产物, 对于开发新药具有重要的指导意义.⽬前, 已经商品化的吡唑类HPPD除草剂有7个, 从已有报道的⽂献来看, 对已经商品化的吡唑类除草剂, 主要研究在⾃然环境中的分解代谢, ⽽在⽣物体内的代谢机制和最终的代谢产物尚⽆明确的结论.
HPPD类除草剂从结构上来划分主要是吡唑类和三酮类.虽然吡唑环和1, 3-环已⼆酮互为⽣物电⼦等排体, 但是, 由于结构的差异性导致其在⾃然环境或⽣物体内的稳定性差异较⼤, 同时也影响植物的吸收传导.在实际应⽤研究中发现, 早期商品化的HPPD类除草剂苄草酯、苄草酚和吡草酮都是以前药的形式存在.其主要⽬的是优化原药的理化性质, 延长药物的半衰期, 提⾼药物利⽤度, 从⽽增强药物的活性, 降低毒副作⽤, 改善药物的作物安全性.
苄草唑、苄草酚和吡草酮都是⽤于防治⽔稻⽥中的杂草.由于其⾃⾝有⼀定的局限性, 例如半衰期短, ⾼
温下对⽔稻具有⼀定的毒副作⽤等.早期的三类除草剂都是以前药的形式存在, 在⼟壤、⽔中缓慢⽔解并释放出具有⽣物活性的⼩分⼦Ⅱ-5a,Ⅱ-5b(Scheme 6)[34], 进⽽通过植物的根部吸收进⼊植物体内到达作⽤位点.由于不同种属间的差异性, ⽣物体内的环境不同, 其在⽣物体内的代谢产物也不完全相同.⼤部分⽔解⽣成苯甲酸类似物Ⅱ-5g, Ⅱ-5h, 苯甲酸类似物进⽽通过好氧降解和厌氧降解两种途径形成更为简单的代谢产物.⽤于⽟⽶⽥中的除草剂苯吡唑草酮(Topramezone)在⼟壤中会被逐渐的分解代谢为羧酸衍⽣物Ⅱ-5c和吡唑类衍⽣物Ⅱ-5d和Ⅱ-5e⽽丧失药效[35].
图式6商品化HPPD抑制剂的代谢机制
Scheme6.Metabolic mechanism of commercialization HPPD inhibitors
2.4 经典型的吡唑类HPPD除草剂
近年来, 在商品化的除草剂基础上, 具有更⾼⽣物活性、更好作物选择性和更低使⽤剂量的新型HPPD抑制剂⼩分⼦不断被报道.以磺酰草吡唑为例, 都保留了分⼦中的苯甲酰烯醇结构, 分别对其吡唑环和芳环部分进⾏改造.对于吡唑环的优化主要包括两部分, 其⼀是对吡唑环上取代基的优化.从已经报道的HPPD晶体结构分析(图1), 抑制剂分⼦中的烯醇结构与在催化活性空腔中的Fe2+形成双齿螯合作⽤, 吡唑环处于⼀个较⼩的疏⽔腔, 因此在吡唑环上引⼊过⼤或过多的取代基不利于提⾼其⽣物活性.其次是对吡唑环上羟基进⾏保护形成前药.前药在⼀定的程度上可以改善药物⼩分⼦在⽣物体内的吸收传导代
谢, 从⽽提⾼抑制剂⼩分⼦对作物的选择性和安全性.如商品化的HPPD类除草剂苄草唑、苄草酚和吡草酮. 1999年⽇本⽯原产业株式会社报道的化合物Ⅲ-1a, Ⅲ-1b(图4), 在63 g/ha的剂量下化合物Ⅲ-1b的除草活性明显优于化合物Ⅲ-1a, 因此对于吡唑环的修饰改造多集中于对羟基的保护.
图4吡唑类HPPD抑制剂⼩分⼦
Figure4.Pyrazol inhibitors of HPPD
报道最多的是对磺酰草吡唑芳环部分衍⽣物的合成.对取代芳环的研究, 2004年, ⽇本专利报道了⼀系列取代的⼆苯醚或⼆苯硫醚化合物, 在100 g/ha剂量下对部分杂草仍可达90%以上. 2006年德国巴斯夫股份公司(BASF)报道的苞卫(Topramezone, Ⅲ-2a)是⽬前应⽤于⽟⽶⽥最为安全、⾼效的HPPD类除草剂, 具有较宽的杀草谱.尤其是对于⼀年⽣的⽲本科杂草(狗尾草)和阔叶杂草(马齿苋), 具有⾮常好的防效.对于取代芳杂环的研究也是近年来的⼀个热点, 不断有新型的结构被报道出来. 2005年, ⽇本⽇产化学公司报道⼀类含有五元吡唑环结构的吡唑类化合物Ⅲ-3a, 所得到的⼤部分化合物均表现出了优良的除草效果. 2012年⽇本株式会社报道的吡啶酮类化合物Ⅲ-4a在1000 g/ha的剂量下对于部分杂草的防效达到100%.在2013年, KUMIAI公司⼜报道了含有嘧啶⼆酮结构[36]的化合物Ⅲ-4b, 所合成化合物同样也表现出了优良的除草活性. 2014年报道了含有三嗪酮结构化合物Ⅲ-4c, 该类化合物同样也表现出了⼴谱⾼效的除草效果.
苯并杂环的研究多集中在苯并五元环和苯并六元环的结构. 2001年, 德国巴斯夫股份公司的专利中包含⼀系列喹啉化合物
苯并杂环的研究多集中在苯并五元环和苯并六元环的结构. 2001年, 德国巴斯夫股份公司的专利中包含⼀系列喹啉化合物Ⅲ-5b, 吡唑羰基部分在苯环的2, 3, 4, 5-位变换, 得到⼀系列类似物, 该系列衍⽣物在63~125 g/ha剂量下对杂草具有很好的抑制活性. 2014年我们课题组[37~39]报道的喹唑啉酮类的化合物Ⅲ-5a具有较好的作物选择性, 随后2015年他们[40]报道苯并咪唑类化合物Ⅲ-5c, 在处理剂量150 g/ha条件下, 部分化合物对苘⿇、反枝苋、鳢肠、马唐、稗草的抑制活性达80%以上.在75 g/ha的剂量下, 对⽟⽶、⽔稻和⼩麦表现出优良的作物安全性.
2.5 ⾮经典型的吡唑类HPPD除草剂
近年来, 突破经典型HPPD抑制剂的分⼦结构模式, 在保留与Fe2+形成螯合作⽤的苯甲酰烯醇结构的基础上, 以⽣物电⼦等排原理为基础, 基于计算机辅助的药物碎⽚离⼦虚拟筛选的途径, 并结合活性亚结构拼接的⽅法, 对其吡唑环进⾏整体修饰改造. 2015年, 徐效华课题组[41]报道了⼀系列新型抑制剂⼩分⼦(图 5), 化合物Ⅳ-d在187.5 g/ha下, 对稗草具有⼀定的防效. 2009年, Matthias[42]根据电⼦等排原理设计合成了⼀类新型的铁螯合HPPD抑制剂, 如图 5所⽰的化合物Ⅳ-e, 在温室盆栽条件下却⼏乎没有除草活性.有趣的是这类化合物在酶⽔平上表现出了很好的抑制活性, 抑制常数IC50达到了36 nmol•L－1, ⽐对照药剂苞卫⾼出了近5倍.
图5⾮经典型HPPD抑制剂⼩分⼦
Figure5.Nonclassic inhibitors of HPPD
2015年, 李正名教授课题组[43, 44]报道含吡唑环类衍⽣物Ⅳ-f, 部分化合物在1500 g/ha的剂量下对芸苔属植物(Brassica campestris)和反枝苋类植物(Amaranthus retroflexus)分别达到40.0%和22.1%的抑制效果.同时在苗前⽤药, 能够抑制对苋类植物的茎叶⽣长, 为后续开发新型HPPD类抑制剂具有重要的指导意义.
3 总结与展望
随着现代农药的⼤量不合理使⽤, 杂草的抗性问题越来越严重.为了克服这⼀现状, 寻新的作⽤靶标和在现有的作⽤机制基础上开发更为⾼效的抑制剂⼩分⼦或具有反抗性的抑制剂⼩分⼦, 是现在农药发展的两个重要⽅向.以HPPD为靶标的除草剂具有⾼效、低毒, 作物安全性⾼及环境相容性好等优势.作为竞争性作⽤靶标, HPPD催化中⼼的Fe2+位于蛋⽩的C-末端区域处在⼀个较⼤的溶剂空腔结构中, 与相邻的两个组氨酸和⼀个⾕氨酸形成配位键, 抑制剂分⼦中的苯甲酰烯醇部分的2个氧原⼦能够与HPPD催化中⼼的Fe2+⾏成双齿螯合的配位作⽤, 形成类似⼀个扭曲的三⾓双锥体结构.其次抑制剂分⼦中的苯甲酰烯醇⽚段的芳环与相邻的两个苯丙氨酸形成三明治型的π-π堆积作⽤, 这⼀点基本上是所有HPPD抑制剂所共有的特性.从靶标的三维结构、不同种属HPPD的差异性以及HPPD与抑制剂的相
互作⽤机制等⾓度分析, HPPD活性位点的氨基酸残基具有⾼度保守型特点, 这将为后续HPPD类抑制剂分⼦的设计提供了理论基础, HPPD也将是未来除草剂开发的重要作⽤靶标.
