姜娜;樊江莉;杨洪宝;彭孝军
【摘 要】细胞器的研究一直是认识细胞结构和功能的重要手段.线粒体是细胞的能量工厂,参与众多的新陈代谢过程,许多病理学过程均与它相关,是一种重要的细胞器,一直以来都是研究的热点.定位于线粒体的荧光探针主要分为3大类,本文重点介绍并讨论近10年基于带有正电荷的荧光团或者在荧光团中引入三苯基膦等定位基团实现对线粒体染荧光探针的研究进展. 【期刊名称】《化工学报》
【年(卷),期】2016(067)001
【总页数】15页(P176-190)
【关键词】荧光;探针;线粒体;细胞生物学;生物技术;成像
【作 者】姜娜;樊江莉;杨洪宝;彭孝军
【作者单位】大连理工大学精细化工国家重点实验室,辽宁大连116024;济南大学化学化工学院,山东济南250022;大连理工大学精细化工国家重点实验室,辽宁大连116024;大连理工大学精细化工国家重点实验室,辽宁大连116024;大连理工大学精细化工国家重点实验室,辽宁大连116024
【正文语种】中 文
【中图分类】TQ618.5
2015-06-29收到初稿，2015-07-31收到修改稿。
联系人：彭孝军。第一作者：姜娜（1987—），女，博士研究生。
Received date: 2015-06-29.
线粒体是细胞的能量工厂，在细胞生命过程中起到至关重要的作用，其功能异常与许多疾病密切相关，因此开发线粒体相关的荧光探针具有重要的生物学和生理学意义。目前已报道的定位于线粒体的荧光探针主要分为3大类：一类是基于线粒体带有-180 mV的膜电位，
进而利用本身带有正电荷的荧光团或者在荧光团中引入三苯基膦等正电荷基团来实现其对线粒体的染；另一类是将探针与能够标记线粒体的蛋白质或者短肽链连接（一般由20～40个氨基酸序列组成），进而达到线粒体特异性染的目的。这类探针具有较好的生物相容性，但水溶性差、细胞通透性不好等限制其应用发展；第3类是利用胶束或者囊泡将药物等不能够渗透线粒体膜的物质包裹，进而选择性堆积在线粒体。一般选用带有正电荷的脂质体等作为囊泡的外表面，通过内吞作用，磷脂层与线粒体膜相融合后释放内含物。该类探针能够将带负电的药物或者大分子协同带入线粒体内部，但是内含物的释放率是值得关注的方面。本文将着重讨论第一类荧光探针近10年的发展。
线粒体是1894年德国科学家Altmann在动物细胞内首次发现的，它具有双层膜结构，外膜是界膜，内膜向内折入形成嵴；内外膜不相通，形成约-180 mV的膜电位。目前大多数线粒体定位类荧光探针是基于线粒体负膜电位特性，利用本身带有正电荷的荧光团或者在荧光团中引入带有正电荷基团，实现对线粒体的染，其中最为常用的是三苯基膦正电荷基团。线粒体不仅为人体生命活动提供能量，还积极参与多种生理过程，它的异常与癌症、糖尿病、阿尔茨海默病等疾病相关，同时线粒体对各种外界损伤又极为敏感，通常其数量、大小和结构随损伤均有改变。细胞受到损伤时，线粒体可由线状变大或者变圆，损伤
严重时可变成小空心泡状结构。2013年，本课题组合成一例能够长时间观测线粒体形态变化的氟硼吡咯类（BODIPY类）荧光探针OBEP（1.1）（图1）[1]。该探针具有良好的光学稳定性，小的细胞毒性，在生理pH范围内对酸碱不敏感，可以通过激光共聚焦成像观测到处于不同形态的线粒体。通过探究，作者认为探针（1.1）是基于吡啶N原子乙基季铵化后使得探针整体带正电荷，易于与线粒体负的膜电位相结合进而特异性染到线粒体。
近红外荧光探针可以有效地避开蛋白自发荧光，具有较深的组织穿透力，因此开发能够定位于线粒体的近红外荧光探针意义重大。2010年Shi课题组证实以吲哚季铵盐为基础的七甲川菁染料可以定位于线粒体[2]。由于探针IR-780（1.2）（图2）具有较好的光学性质和生物相容性，优先聚集于肿瘤组织，因此作者希望可以利用该探针建立一个肿瘤诊断和的平台。2013年Tung课题组报道一例基于七甲川菁染料的无细胞毒性探针AcQCy7 （1.3）（图2）[3]，该探针本身不发射荧光，当进入细胞后发生乙酰基水解作用生成化合物QCy7，同时伴随红荧光发射。分子1.3可以很好地选择性堆积在线粒体上，即使与细胞共孵育时间长达两天，其染位置不变，而且无任何细胞毒性表达，这为长时间观测线粒体形态变化提供有利的研究工具。
2011年 Kawazoe课题组报道首例成像于线粒体膜的荧光探针[4]，并且通过细胞磨碎技术、凝胶电泳、液质联用技术等各种实验证明该分子在膜上发生成环反应，由本身没有荧光的分子1（1.4）在线粒体膜上反应生成发射绿荧光的分子2（1.5）（结构如图3），但是该分子定位于线粒体膜及其环化反应的机制尚不明确。
双光子激光共聚焦成像由于具有高的空间分辨率、组织穿透性深、光损伤程度低和耐光性好等优点，目前受到广泛关注。山东大学于晓强教授基于咔唑母体，设计合成两例用于线粒体成像的双光子荧光探针CAI（1.6）和CAEI（1.7）（图4）[5]。这两例探针之所以能够定位于线粒体，很大部分是因为吡啶被碘代烷化合物取代后形成季铵盐，使探针分子带有正电荷。
目前已报道的能够定位于线粒体的荧光探针大部分是基于三苯基膦基团或者探针本身带有正电荷，而2013年Reddy及其合作者报道一例基于铕-β二酮络合物用于线粒体定位的探针Eu(pfppd)3(tpy) （1.8）（图5）[6]，丰富了线粒体荧光探针的数据库。
锌作为一种重要的过渡金属元素，在人体中的含量仅次于铁，Zn2+含量异常会影响相关蛋白以及DNA的转化和功能，进一步影响正常生理过程，造成脑发育迟缓、癫痫等疾病。20
03年Gee课题组报道一例基于罗丹明的探针RhodZin-3 AM（2.1）（图6）[7]，该探针与Zn2+结合后可实现75倍荧光增强，并且选择性堆积于线粒体上，实现对线粒体中内源性自由Zn2+的检测。2011年，韩国Cho课题组报道一例基于FRET机理检测线粒体内Zn2+的红荧光探针5[8]。该探针斯托克斯位移大，可减少激发光的干扰，在生理范围内不受pH干扰，实现了Zn2+的比率成像。紧接着，2012年，Cho和Kim合作，利用三苯基膦基团对线粒体的定位作用合成一例检测Zn2+的双光子荧光探针SZn2-Mito（2.2）（图6）[9]。当与Zn2+结合后，探针536 nm处有70倍荧光增强，对鼠海马组织深达100～200 μm处实现Zn2+双光子激光共聚焦成像。
铁是人体内含量最多的过渡金属元素，具有重要的生理学意义，包括呼吸作用、电子转移、遗传信息转录等。尤其在线粒体内，铁含量异常所引起的相关疾病正在增加，例如弗里德里奇共济失调症。这种疾病是由共济蛋白的缺陷引起的，而三价铁离子是这种蛋白合成的控制因素。大连理工大学宁桂玲教授带领课题组设计合成一例基于罗丹明探针母体用于检测细胞内三价铁离子的探针RNP1（2.3）（图7）[10]，该探针基于萘酐与罗丹明之间发生FRET作用调节对Fe3+的络合能力。值得注意的是，探针2.3定位于线粒体同样是依赖于三苯基膦基团。Cabantchik课题组同样通过修饰罗丹明母体来监测线粒体内Fe3+水平[1
1-14]RdITPA-TG（图8）[15]。该系列探针在中性环境下选择性与Cu+反应，使得母体螺环打开，发射542 nm的黄橙荧光。当TG基团为三苯基膦基团时，探针2.4可很好地定位于线粒体上，达到对线粒体内。
铜同样是线粒体内重要的基本金属元素，参与线粒体细胞素c氧化酶及超氧歧化酶的合成，而这两种酶在能量产生和能量凋亡中起调配作用。Taki教授基于香豆素母体设计合成一系列探针Cu+检测识别的目的。
钯及其离子化合物在生物体内含量很低，大多数是通过呼吸作用吸入，进而滞留在肺部，其中一部分吸收的钯化合物会快速转运至肝、肾等器官。但是由于环境中钯离子的浓度很低，又存在基体干扰，因此对它的检测分析仍较为困难。Bradley及其合作者利用细胞内的耦合反应合成化合物5（2.5）（图9）[16-17]。首先脂溶性不能够发射荧光的探针母体2.5-a与带有三苯基膦部分的2.5-b部分进入细胞后，在Pd0的催化作用下发生铃木反应生成探针2.5，同时伴随着绿荧光的发射，而三苯基膦基团的引入，使得探针可以定位于线粒体。
氟离子是一种重要的阴离子，它广泛地参与生物、医药和化学过程。当人体氟离子含量超
标时，最常见的表现是氟斑牙、新陈代谢失调、骨质疏松症和尿石症等。研究表明，当线粒体暴露在高浓度的氟离子环境时，其呼吸作用效率下降，进而导致线粒体功能紊乱，诱发迟发性神经退行性类疾病。2014年，本课题组设计合成一例高选择性和高灵敏性检查F-的荧光探针FP（2.6）（图10）[18-19]。分子2.6本身不发射荧光，当与F-发生水解作用后，将会在485 nm处发射强烈的绿荧光，且对F-的检测限达19×10-9mol·L-1。该探针虽不带有正电荷（与F-作用后的产物YG也不带正电荷），却很好地选择性定位于活细胞线粒体上。
氧气是生物进行生命活动的必要因素。在生命活动中，机体通过呼吸作用产生一系列氧的衍生物，例如活性氧系列，通常包括超氧负离子（O-2·）、羟基自由基（HO·）、过氧自由基（ROO·）、过氧化氢（H2O2）和单线态氧（1O2）等。在正常的细胞环境内，活性氧的产生是必须的，但是当因外界刺激产生过量的活性氧时，可对机体造成损伤乃至损害[20]。早在2006年，Chang课题组合成一例基于FRET机理比率检测过氧化氢的新型荧光探针RPF1（3.1）（图11）[21]。未与H2O2反应前，只能观察到香豆素的蓝荧光；与H2O2相互作用后，香豆素的蓝荧光逐渐减弱，而荧光素的绿荧光恢复并且逐渐增强。探针RPF1（3.1）激发和发射波长均处于可见光区，不仅可减少对生物样品的光损伤，
还可以避开蛋白的自发荧光。值得注意的是，作者是将线粒体从细胞分离出后进行的检测。紧接着，2007年Nagano课题组基于罗丹明母体带有正电荷的性质，设计合成一例真正能够检测线粒体中活性氧的探针MitoAR（3.2）（图11）[22]，并实现在活细胞中对活性氧的荧光成像。
2010年，Shioji课题组将三苯基膦基团引入到四苯基芘荧光母体上，报道一例能够检测线粒体内过氧化合物的探针MitoDPPP（3.3）（图12）[23]。通过观察探针的染情况，作者认为脂溶性的过氧化合物可有效地穿透线粒体膜。Robinson及其合作者同样将三苯基膦基团引到乙啡啶母体上，合成能够定位于线粒体的探针6（3.4）和7（3.5）（图12）[24]。这两例探针的荧光发射具有不同的形式。当细胞内仅发生自动氧化作用（无超氧化合物）时，探针510 nm激发时只产生乙啡啶部分的荧光；而当超氧化合物存在时，它将氧化探针生成2-羟基-乙啡啶的形式，并且在396 nm和510 nm处均可被激发，因此通过检测396 nm和510 nm两处的激发波长，可区分细胞一般氧化过程和超氧诱导过程。
