一种绿荧光碳量子点及其在快速检测诱惑红方面的应用

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1.本发明涉及诱惑红的快速检测技术领域，具体涉及一种绿荧光碳量子点及其在快速检测诱惑红方面的应用。

背景技术：

2.合成素具有泽艳丽、成本低、染力强的优点而广泛用于食品工业以改变食品的外观，从而提高食欲。诱惑红(ar)属于合成偶氮染料，具有成本低、稳定性高的优点，并广泛用于各种食品中，如糖果、果冻、果汁、乳制品、饮料等。尽管其应用广泛，由于其具有偶氮官能团和芳香环的独特结构，其毒性和致病性不容忽视。据报道，ar的过度使用可能会导致多种疾病，如呼吸和消化问题、多动症、失眠、哮喘、过敏、染体损伤和淋巴瘤等。为了防止ar滥用，许多国家都制定了法规。例如，在美国、德国、挪威、丹麦、法国、瑞典、瑞士、比利时、奥地利和印度ar被归类为非法食品着剂，并完全禁止使用。中国规定了ar在不同类型食品中允许使用的最大限量值，例如其在软饮料中的最大允许使用限量为0.1g kg-1
，糖果和巧克力的最大允许使用限量为0.3g kg-1
。因此，需要开发一种简单、快速和方便的分析方法，用于准确测定食品中的ar含量。
3.目前，研究人员已经建立了多种分析方法来准确检测ar，包括薄层谱法(tlc)、微分脉冲极谱法(dpp)、电化学传感法、毛细管电泳法(ce)、高效液相谱法(hplc)等方法。尽管这些方法已被证明能够用于ar检测，但它们通常受到仪器昂贵、繁琐的样品制备程序和耗时长等方面的困扰。因此，基于功能化碳量子点(fcns)的荧光方法具有快速、操作简单、低成本、良好的选择性和高灵敏度等优点，在克服上述困难方面展现出良好的应用前景。
4.碳量子点(fcns)通常是指粒径小于10nm的富氧碳纳米颗粒，有显著的荧光(pl)特性。fcns具有优异的光稳定性、可调节发射、水溶性、生物相容性和低细胞毒性。基于这些优势，fcns在食品检测中已占据一席之地。研究表明，基于fcns的传感系统在检测柠檬黄、柠檬酸、孔雀石绿、胭脂红和谷胱甘肽等食品添加剂方面表现出较高的灵敏度。然而，迄今使用fcns作为纳米探针进行ar检测的研究仍然很少，目前只发现了两篇报道。vijeata等以水果硬壳，果肉，纸浆和树胶混合物为原料制备了三种fcns探针用于ar检测，检测限分别为0.260、0.607和0.166μmol l-1
。在另一项研究中，gunjal等以锯木厂废料为原料制备了fcns探针用于ar检测，获得的检测限为0.91μmol l-1
(0.45μg ml-1
)。这两项研究证明了使用fcns作为纳米探针进行ar检测的可行性。然而，这两项工作均基于短波长蓝荧光的fcns，容易受到溶剂散射光谱的干扰或缺乏大斯托克斯位移而限制了检测的灵敏度。为进一步提高基于fcns的荧光方法的分析性能，开发基于长波长荧光的fcns探针用于ar检测是十分必要的。

技术实现要素：

5.本发明针对现有基于短波长蓝荧光fcns的ar检测技术灵敏度不足的问题，开发
了一种基于绿荧光g-fcns的快速检测法用于ar检测，其灵敏度远高于任何现有基于fcns的荧光探针。此外，该方法还具有操作简单、成本低和检测快速的优点，并且可用于实际食品基质中的ar检测。
6.本发明采用以下技术方案：
7.一种绿荧光碳量子点的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)将0.13g 4-氨基苯甲酸和0.10g间苯二胺溶解在20.0ml超纯水和无水乙醇的等体积比混合溶液中；混合物溶液转移到聚四氟乙烯衬里高压釜中，并在180℃的恒温下加热12小时；
9.(2)让反应产物静置冷却至室温，然后将其转移到50.0ml离心管中。在12000rpm/min下离心15分钟后，收集上清液；
10.(3)将所得上清液在超纯水中重新溶解，并通过透析膜在1.0l烧杯中纯化3天，每24h补充一次新鲜的超纯水；将纯化后含有g-fcns的溶液冻干，得到干燥的g-fcns粉末，在干燥箱中长期储存。
11.所述绿荧光碳量子点在快速检测诱惑红方面的应用，包括以下步骤：
12.1)用超纯水和绿荧光碳量子点混合，得到绿荧光碳量子点溶液；
13.2)将不同浓度的诱惑红分别与绿荧光碳量子点溶液混合反应，得到不同诱惑红浓度的混合溶液，分别测得不同诱惑红浓度的混合溶液的荧光强度，取得荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中诱惑红浓度的线性关系；
14.3)将待测样品与绿荧光碳量子点溶液混合反应，得到待测样品混合溶液，测得待测样品混合溶液的荧光强度；
15.4)根据荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中诱惑红浓度的线性关系得出待测样品混合溶液中诱惑红的浓度。
16.进一步的，步骤1)所述绿荧光碳量子点溶液的浓度为0.001-0.1mg ml-1
。
17.进一步的，步骤1)所述绿荧光碳量子点溶液的浓度为0.01mg ml-1
。
18.进一步的，步骤2)所述荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中诱惑红浓度的线性关系为：y＝0.0849x+0.9883。
19.进一步的，所述步骤2)和步骤3)中，反应体系的ph值在2.0和12.0之间。
20.进一步的，所述步骤2)和步骤3)中，反应体系的ph值为6.5。
21.进一步的，所述步骤2)和步骤3)中，测定荧光强度在λ
ex
为400nm，λ
em
为493nm下测定。
22.进一步的，步骤2)和步骤3)所述反应的时间为1min。
23.进一步的，步骤3)所述待测样品为：含有ar的软饮料、糖果或巧克力，粉碎溶解或稀释后用孔径为0.45μm的醋酸纤维素膜注射过滤器进行过滤得到的提取液。
24.本发明具有以下有益效果：
25.本发明以4-氨基苯甲酸(paba)和间苯二胺为前体，通过水热法合成法制备了一种绿荧光g-fcns，并将其作为探针用于ar的超灵敏检测，检测限低至为23.5nm，为提高ar检测的检测性能开辟了新前景。本方法还具有操作简单、成本低和分析快速的优点，并且可以用于实际样品分析，因此具有良好的应用推广价值。
附图说明
26.图1为本发明检测的方法示意图；
27.图2(a)g-fcns的紫外-可见吸收光谱(实线)、荧光激发光谱(划线)和发射光谱(点划线)；右上角的插图是300-500nm范围内放大的紫外-可见吸收光谱，左上角的图片是自然光(左)和紫外线照射下(右)的g-fcns水溶液；(b)g-fcns在不同激发波长下的荧光光谱；(c)(a)硫酸奎宁和(b)g-fcns紫外吸收强度-荧光光谱峰面积积分图；
28.图3为g-fcns的(a)tem图；(b)粒度分布直方图；(c)ftir光谱图；
29.图4(a)ph对检测ar的影响曲线图；(b)g-fcns浓度对检测ar的影响曲线图；(c)反应时间对检测ar的影响曲线图；
30.图5(a)含不同浓度ar(0.0
–
60.0μmol l-1
)的g-fcns溶液(0.01mg ml-1
)的荧光光谱图；(b)f0/f与ar浓度的线性关系图；
31.图6为g-fcns对ar、阴阳离子和各类氨基酸等小分子的(a)选择性和(b)抗干扰性柱状图。
具体实施方式
32.为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下实施例。实施例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。
33.如图1所示，通过4-氨基苯甲酸(paba)和间苯二胺的水热加热制备了g-fcns。ar通过静电吸附，内滤效应(ife)和动态猝灭以浓度依赖的方式有效降低g-fcns的荧光强度。因此，提出了一种基于g-fcns的荧光方法来检测ar。详细研究了g-fcns浓度、ph值和反应时间等检测条件对分析性能的影响。通过研究其线性范围、检测限、选择性和抗干扰能力，彻底验证了该方法。最后将该方法用于食品中ar的测定，以评估其实际应用的可行性。该方法具有超高灵敏度、良好的选择性、低成本和易操作性，为ar监测提供了一种方便、可靠的分析策略。
34.1.g-fcns的合成：
35.将0.13g paba和0.10g间苯二胺溶解在20.0ml超纯水和无水乙醇(1:1v:v)的混合溶液中。将混合物溶液转移到聚四氟乙烯衬里高压釜中，并在180℃的恒温下加热12小时。让反应产物静置冷却至室温，然后将其转移到50.0ml离心管中。在12000rpm(每分钟转数)下离心15分钟后，收集上清液，在超纯水中重新溶解，并通过透析膜(mwco＝500-1000da)在1.0l烧杯中纯化3天，每24h补充一次新鲜的超纯水。将纯化后含有g-fcns的溶液冻干，得到干燥的g-fcns粉末，在干燥箱中长期储存。
36.2.g-fcns的理化性质表征：
37.采用紫外可见吸收光谱(uv-vis)研究了g-fcns的紫外吸收性质。图2a(实线)显示了g-fcns的uv-vis光谱在240、270和375nm处有吸收峰。240nm处的峰是由于c＝n键的π
→
π*跃迁，而270和375nm处的峰是由于c＝o键的n
→
π*跃迁。
38.通过荧光光谱研究了g-fcns的荧光性质。如图2a(划线)所示，g-fcns在400nm处有激发峰。如图2a(点划线)所示，g-fcns在400nm激发下的发射峰为493nm。g-fcns的水溶液在自然光下呈棕黄(图2a左上角插图左)，在紫外线照射下呈亮绿(图2a的左上角插图
右)。图2b为g-fcns在不同激发波长下的发射光谱，可见其发射光谱展现出激发波长依赖性。如图2c所示，以硫酸奎宁为参考物质，测得g-fcns的量子产率为15.40％。
39.通过tem法测量g-fcns的形态和尺寸。如图3a所示，g-fcns尺寸均匀且呈球形。图3b是g-fcns的粒径分布直方图。g-fcns的粒径分布范围为0.35-6.65nm，平均粒径为2.5
±
0.4nm。
40.采用傅里叶红外光谱对g-fcns的官能团进行了表征。如图3c所示，在3426-3213cm-1
范围内的吸收峰归因于o-h/n-h的伸缩振动。2923cm-1
和1693cm-1
处的吸收峰分别对应c-h和c＝o的伸缩振动。c＝n和n-h伸缩振动分别出现在1600cm-1
和1496cm-1
。c-n伸缩振动和c-o伸缩振动分别出现在1313-1260cm-1
和1170cm-1
。因此，g-fcns的亲水性归因于其表面具有含氮和含氧官能团的不饱和碳质结构。
41.3.实验条件优化
42.为了获得最佳的检测性能，对传感平台的主要工作参数进行了优化，包括反应体系ph、g-fcns溶液浓度和反应时。
43.3.1 ph对检测的影响
44.如图4a所示，ph值(pbs溶液，10.0mm)在2.0和12.0之间变化时，导致荧光猝灭效率即f0/f(其中f0和f分别指与ar混合前后g-fcns的荧光强度)显著变化，并且在ph 6.5(超纯水)时获得最高值。因此，最佳ph值选择为6.5。为了简化步骤，后续的检测工作采用超纯水为溶液。
45.3.2g-fcns浓度对检测的影响
46.如图4b所示，当g-fcns浓度从0.001增加到0.01mg ml-1
时，传感系统的f0/f显著增加，在更高浓度范围(0.01-0.1mg ml-1
)内f0/f急剧下降。因此，选择0.01mg ml-1
为最佳g-fcns浓度。
47.3.3反应时间对检测的影响
48.如图4c显示，f0/f在1.0min内急剧增加，并且随着时间的延长趋于恒定，表明该传感系统反应速度快，仅需要1.0min即可完成反应，因此，在随后的检测工作中采用1.0min为最优反应时间。
49.4.分析方法验证
50.4.1线性范围
51.为研究ar对g-fcns荧光强度的影响，使用超纯水制备浓度为0.01mg ml-1
的g-fcns溶液，然后将不同浓度的ar加入所制备的g-fcns溶液中，反应1.0min后，记录混合溶液在400nm激发和493nm发射下的荧光强度。
52.如图5a所示，在g-fcns溶液(0.01mg ml-1
)中加入不同浓度的ar后，随着ar浓度的增加，观察到g-fcns的荧光强度逐渐降低。当ar浓度达到60.0μmol l-1
时，g-fcns的荧光猝灭了近95.87％。表明ar可以有效猝灭g-fcns的荧光强度。如图5b所示，荧光猝灭效率f0/f与ar浓度成线性关系。对应的回归方程为y＝0.0849x+0.9883。检测限计算为23.5nmol l-1
。将本检测方法的检测限与已报道的基于fcns的荧光方法进行比较，如表1所示，本检测方法的灵敏度远高于任何现有的基于fcns的荧光检测法的灵敏度。
53.表1基于fcns的ar荧光法的检测性能
[0054][0055]
4.2选择性
[0056]
本工作研究了g-fcns对ar的选择性。将ar和不同种类的干扰物质，包括阳离子(k
+
、na
+
、fe
2+
、ba
2+
、pb
2+
、cd
2+
和mg
2+
)、阴离子(br-、h2po
42-、s2o
32-、cl-、no
3-、no
2-和f-)、素(苋菜红、靛蓝和喹啉黄)和其他几种小分子(丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸、氨酸、葡萄糖、d-果糖和蔗糖)溶解在超纯水中，最终浓度为0.1mmol l-1
。分别取2.0μl添加到一系列5.0ml其中含有2.0ml g-fcns溶液(0.01mg ml-1
)的离心管中。充分混合后，在400nm激发波长下，记录493nm处混合溶液的最大荧光强度。
[0057]
如图6a所示，ar的引入导致g-fcns荧光强度急剧下降，而其他可能存在的干扰物质对g-fcns的荧光强度几乎没有显著影响，表明本工作所提出的检测方法对ar检测具有优异的选择性。
[0058]
4.3抗干扰性
[0059]
本工作考察了g-fcns对ar检测的抗干扰性。将一系列20.0μl ar溶液(10.0mmol l-1
)分别加入到含有2.0ml g-fcns溶液(0.01mg ml-1
)的5.0ml离心管中。然后，分别加入2.0μl上述干扰物质，使其终浓度为0.1mmol l-1
。与选择性研究类似，记录混合物溶液在400nm激发下，493nm处的荧光强度。
[0060]
如图6b所示，g-fcns/ar系统的荧光不受上述外来物质的干扰，表明该方法具有良好的抗干扰能力。因此，所提出的方法具有用于实际食品样品中ar测定的潜力。
[0061]
5.实际样品测试
[0062]
不同种类的食品样品，如含有ar的软饮料、糖果和巧克力，均采购自当地市场。对于饮料样品，首先将它们煮沸以去除溶解的co2，然后将2.0ml样品转移到离心管中并用10.0ml超纯水稀释。对于糖果和糖衣巧克力，首先将它们粉碎成细粉，将0.1g每种样品粉末溶解在10.0ml超纯水中并超声处理10.0min。最后，将样品提取液用孔径为0.45μm的醋酸纤维素膜注射过滤器进行过滤。将g-fcns溶液(0.01mg ml-1
)转移到5.0ml离心管中，每个离心管中含有2.0ml g-fcns溶液。分别加入20.0μl样品提取液进行混合，在400nm的激发波长下测量添加样品提取液前后g-fcns溶液在493nm处的荧光强度(即f0和f)。
[0063]
表2食品样品中ar的检测
[0064][0065]
如表2所示，上述食品样品中的ar含量分别为0.30、0.71、0.22、0.42和0.51μmol l-1
，分别对应0.14、0.34、0.11、0.20和0.24mg kg-1
，均低于我国在软饮料、糖果和巧克力样品中允许ar使用的最大限量，因此可以被安全食用。样品回收率测试显示其回收率在97.4-104.8％的范围内，相对标准偏差(rsd)小于3.58％。另外，通过hplc分析进行比较，可以观察到两种方法的检测结果具有一致性，表明所提出的检测方法具有高准确度。
[0066]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：

1.一种绿荧光碳量子点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将0.13g 4-氨基苯甲酸和0.10g间苯二胺溶解在20.0ml超纯水和无水乙醇的等体积比混合溶液中；混合物溶液转移到聚四氟乙烯衬里高压釜中，并在180℃的恒温下加热12小时；(2)让反应产物静置冷却至室温，然后将其转移到50.0ml离心管中。在12000rpm/min下离心15分钟后，收集上清液；(3)将所得上清液在超纯水中重新溶解，并通过透析膜在1.0l烧杯中纯化3天，每24h补充一次新鲜的超纯水；将纯化后含有g-fcns的溶液冻干，得到干燥的g-fcns粉末，在干燥箱中长期储存。2.根据权利要求1所述绿荧光碳量子点在快速检测诱惑红方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)用超纯水和绿荧光碳量子点混合，得到绿荧光碳量子点溶液；2)将不同浓度的诱惑红分别与绿荧光碳量子点溶液混合反应，得到不同诱惑红浓度的混合溶液，分别测得不同诱惑红浓度的混合溶液的荧光强度，取得荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中诱惑红浓度的线性关系；3)将待测样品与绿荧光碳量子点溶液混合反应，得到待测样品混合溶液，测得待测样品混合溶液的荧光强度；4)根据荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中诱惑红浓度的线性关系得出待测样品混合溶液中诱惑红的浓度。3.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤1)所述绿荧光碳量子点溶液的浓度为0.001-0.1mg ml-1
。4.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤1)所述绿荧光碳量子点溶液的浓度为0.01mg ml-1
。5.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤2)所述荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中诱惑红浓度的线性关系为：y＝0.0849x+0.9883。6.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)中，反应体系的ph值在2.0和12.0之间。7.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)中，反应体系的ph值为6.5。8.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)中，测定荧光强度在λ
ex
为400nm，λ
em
为493nm下测定。9.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤2)和步骤3)所述反应的时间为1min。10.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤3)所述待测样品为：含有ar的软饮料、糖果或巧克力，粉碎溶解或稀释后用孔径为0.45μm的醋酸纤维素膜注射过滤器进行过滤得到的提取液。

技术总结

本发明公开了一种绿荧光碳量子点及其在快速检测诱惑红方面的应用，以4-氨基苯甲酸(PABA)和间苯二胺为前体，通过水热法合成法制备了一种绿荧光碳量子点(G-FCNs)，并将其作为探针用于AR的超灵敏检测。本发明显著提高了FCNs探针对AR检测的灵敏度，为AR快速检测开辟了新途径。本发明建立的基于G-FCNs的AR快速检测方法，其检测限低至23.5nM，因此其具有高灵敏度。另外，本方法还具有操作简单、成本低和分析快速的优点，并且可以用于实际样品分析，因此具有良好的应用推广价值。此具有良好的应用推广价值。此具有良好的应用推广价值。