一种合成On-DNA芳基炔烃类先导化合物的方法与流程

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一种合成on-dna芳基炔烃类先导化合物的方法
技术领域
1.本发明属于基因编码化合物库构建领域，具体涉及一种合成on-dna芳基炔烃类先导化合物的方法。

背景技术：

2.在药物研发中，针对生物靶标的高通量筛选有助于快速获得先导化合物，但基于单个分子的传统高通量筛选存在化合物库数量有限、耗时长、成本高等缺点。这在一定程度上限制了先导化合物的发现。brenner和lerner于1992年创造性地提出使用基因编码化合物库技术(delt)来进行生物活性筛选的方法，它结合了组合化学和分子生物学技术的特征，通过给每个化合物加上一个dna标签的特别技术，使用组合-拆分法(split and pool)在较短的时间内得到数目多达亿级的化合物库。delt不仅突破了传统高通量筛选的高成本瓶颈，实现了筛选的化合物在化学结构、空间及数量上的飞跃，并且使用了全新的类似于表型筛选(phenotypic screening)的生物筛选模式。与传统高通量筛选相比，基因编码化合物库极大地增加了化合物的数量和化学结构空间多样性。
3.基因编码化合物库技术主要的工作之一是dna上化学反应(简称on-dna化学反应)的开发，目前已经有一些on-dna化学反应被报道。例如上海药明康德新药开发有限公司(申请号为cn201910609569.0的中国专利申请)公开了一种通过suzuki偶联反应得到on-dna芳烃化合物的方法：以on-dna芳基卤代物为底物，在pd催化剂、配体和碱的存在下，与有机三氟硼酸钾试剂反应制得on-dna芳烃化合物。该方法增加了on-dna芳基卤代物的dna编码化合物库的多样性，反应产率高，底物普适性广，条件温和，操作方便，适合于多孔板进行的dna编码化合物库的合成。成都先导药物开发股份有限公司(申请号为cn201910590679.7的中国专利申请)公开了一种合成on-dna芳基苄位取代类化合物的方法，该方法以on-dna醛类化合物为原料，与吲哚在碱性条件下反应生成on-dna吲哚醇类化合物，然后将on-dna吲哚醇类化合物在酸性条件下被1,4-二氢-2,6-二甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯还原成吲哚烷基化类化合物。能够在基因编码化合物库上实现的化学反应的种类越多，条件越丰富，在进行基因编码化合物库的设计和和合成时选择才越多，得到的化合物库的多样性也会越丰富。但是，目前公开报道的on-dna化学反应种类有限，还无法满足开发先导化合物发现的广泛需求。
4.芳基炔烃类化合物指含有直接相连的芳基和炔基结构的一类化合物，这类化合物是有机合成中的重要原料或中间体。同时，研究发现芳基炔烃类化合物具有多种生物活性。例如化合物tolasure(bm-3103)，它是美国biomendics公司正在开发的一种用于由穿孔活检造成的急性诱导伤口的伤口愈合药物(相关文献：safety and efficacy of topicaltolasure targeting aggregated mutant keratin in severe epidermolysis bullosasimplex(nct05062070)clinicaltrials.gov web site 2021,october 04)；再如化合物x，它是印度药用芳香植物中央研究所发现的一种具有抗疟性能、抗癌活性的药物(相关文献：kumari,p.；misra,k.；sisodia,b.s.；et al.planta med2009,75(1),59)。
[0005][0006]
申请号为cn201910609568.6的中国专利申请公开了一种dna编码化合物库构建中制备on-dna芳基炔烃化合物的方法，路线如下。该方法将on-dna芳基端炔化合物与小分子芳基溴代物在二异丙基胺和和四三苯基膦钯的存在下，于超纯水与二甲基乙酰胺的混合溶剂中，在65℃下反应3小时，得到了on-dna芳基炔烃化合物。但是，一方面，该方法采用价格昂贵且稀有的钯催化剂，增加了制备成本；另一方面，该方法需要加热到65℃，已有研究证明，钯催化剂本身也对dna存在一定程度的损伤，在加热的条件下这种损伤程度会进一步加深(malone,m.l.and paegel,b.m.acs comb.sci.2016,18,182-187.)，因此该方法增加了dna链损坏的风险，dna链一旦损坏，将无法完成后续的扩增工作，使得on-dna芳基炔烃化合物也就失去了在构建基因编码化合物库中的应用价值。事实上，正是因为dna化学与普通化学反应存在差别，许多普通的小分子化学反应条件苛刻，容易引起dna变性、破坏dna活性，从而一定程度上限制了dna编码化合物库构建和发展。
[0007][0008]
申请号为cn202210032980.8的中国专利申请也公开了一种合成芳基炔烃类先导化合物的方法，路线如下。该方法先以碘代炔烃为起始原料制备得到寡聚核酸-碘代炔烃，然后以寡聚核酸-碘代炔烃与硼酸试剂在铜催化剂和碱的存在下，于25℃下反应24小时得到了on-dna芳基炔烃类先导化合物。虽然该方法没有采用价格昂贵且稀有的钯催化剂，并且降低了反应温度，但是，一方面，该方法采用的原料碘代炔烃不易买到，需要自行制备，增加了时间和经济成本；另一方面，该方法采用的原料碘代炔烃稳定性不佳，易掉碘或水解，只适合在温和的条件下反应，适用范围有限，限制了所能合成的on-dna芳基炔烃类化合物的种类多样性。
[0009][0010]
因此，开发出一种成本低，适用范围广，对dna损伤小，高收率的合成on-dna芳基炔烃类化合物的方法具有重要意义。

技术实现要素：

[0011]
本发明的目的在于提供一种合成on-dna芳基炔烃类先导化合物的新方法，以及该合成方法在构建基因编码化合物库中的用途。
[0012]
本发明提供了一种合成的on-dna芳基炔烃类先导化合物方法，所述方法包括以下
步骤：
[0013][0014]
以式i所示化合物和式ii所示化合物为原料，在碱和铜催化剂的存在下反应，得到式iii所示on-dna芳基炔烃类先导化合物；
[0015]
其中，dna为单链或双链的核苷酸链；
[0016]
x为连接单元；
[0017]
l为无或连接单元；
[0018]
a环选自5～6元杂芳环、苯环、芳稠环、芳杂稠环；
[0019]
m为1～4的整数；
[0020]
ra各自独立地选自未被取代或被一个或两个以上rd取代的c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、orc、卤素、氰基、3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基，或者其中两个ra连接成环；
[0021]
rc选自3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基；
[0022]
rd各自独立地选自氰基、卤素。
[0023]
进一步地，所述式i所示化合物、式ii所示化合物、碱和铜催化剂的当量比为1:(1-1000):(1-500):(0.1-100)；
[0024]
所述碱为碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化铯、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、磷酸钾、磷酸钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氟化铯、叔丁醇钾、叔丁醇钠、三乙胺、正丁胺、异丁胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、n,n-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、n,n,n',n'-四甲基乙二胺、1,1,3,3-四甲基胍、n,n-二环己基甲胺、二环己胺、四氢吡咯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或任意两种以上的混合物；
[0025]
所述铜催化剂为醋酸铜、硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、碳酸铜、碘化亚铜、铜-β-环糊精复合物、双(2,4-戊二酮酸)铜、乙酰丙酮铜、四氟硼酸四(乙腈)铜、二氯(1,10-菲咯啉)铜、双(8-羟基喹啉)铜、三氟甲磺酸铜、双(三氟-2,4-戊二酮)铜、高氯酸铜、六氟磷酸四(乙腈)铜、醋酸亚铜、溴化铜、氟化铜、溴化亚铜、氯化亚铜、氯化亚铜-双(氯化锂)络合物、溴化亚铜二甲硫醚络合物中的任意一种或任意两种以上的混合物；
[0026]
所述反应的溶剂为水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或任意两种以上的混合物；
[0027]
所述反应的温度为0-40℃，反应的时间为1-48小时。
[0028]
进一步地，所述式i所示化合物、式ii所示化合物、碱和铜催化剂的当量比为1:(1-200):(1-100):(0.1-50)；
[0029]
所述碱为碳酸钾、碳酸钠中的一种或两种的混合物；
[0030]
所述铜催化剂为碘化亚铜、六氟磷酸四(乙腈)铜、氯化亚铜-双(氯化锂)络合物中的任意一种或任意两种以上的混合物；
[0031]
所述反应的溶剂为水、甲醇和乙腈的混合物；
[0032]
所述反应的温度为25℃，反应的时间为24小时。
[0033]
进一步地，所述式i所示化合物、式ii所示化合物、碱和铜催化剂的当量比为1:200:15:10；
[0034]
所述碱为碳酸钾；
[0035]
所述铜催化剂为碘化亚铜。
[0036]
进一步地，x选自nhco、conh、nh、co。
[0037]
进一步地，l选自无、c
1-4
亚烷基、未被取代或被一个或两个以上rb取代的5～6元杂芳环、未被取代或被一个或两个以上rb取代的苯环；
[0038]
其中，l1选自c
1-2
亚烷基，l2选自c
1-2
亚烷基，y选自o或s；
[0039]
rb各自独立地选自卤素、c
1-3
烷基；
[0040]
a环选自5～6元杂芳环、苯环、芳稠环、芳杂稠环；
[0041]
m为1、2或3；
[0042]
ra各自独立地选自未被取代或被一个或两个以上rd取代的c
1-4
烷基、c
1-4
烷氧基、orc、卤素、3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基，或者其中两个ra连接成环，所述环为5～6元饱和环；
[0043]
rc选自3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基；
[0044]
rd各自独立地选自氰基、卤素。
[0045]
进一步地，x为nhco，式i所示化合物的合成方法包括以下步骤：
[0046][0047]
以式i-a所示化合物和式i-b所示化合物为原料，反应，得到式i所示化合物。
[0048]
进一步地，所述反应是在碱和缩合试剂的作用下进行的，式i-a所示化合物、式i-b所示化合物、碱和缩合试剂的当量比为1：(40-160)：(100-400)：(25-100)；
[0049]
所述反应的温度为0-40℃，反应的时间为0.5-10小时；
[0050]
所述反应的溶剂为水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯、无机盐缓冲液、有
机碱缓冲液中的任意一种或任意两种以上的混合物。
[0051]
进一步地，所述碱为n,n-二异丙基乙胺，缩合试剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯；
[0052]
式i-a所示化合物、式i-b所示化合物、碱和缩合试剂的当量比为1：80：200：50；
[0053]
所述反应的温度为室温，反应的时间为1小时；
[0054]
所述反应的溶剂为水和二甲基亚砜的混合物。
[0055]
进一步地，所述on-dna芳基炔烃类先导化合物为以下化合物之一：
[0056][0057]
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
[0058]
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀c
a-b
烷基表示任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。例如，c
1-6
烷基是指包含1-6个碳原子的直链或支链的烷基。
[0059]“杂芳环”即“杂芳基”，指包含一个到多个杂原子的杂芳族基团。这里所指的杂原
子包括氧、硫和氮。例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡唑基、吡咯基、n-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。
[0060]“稠环烷基”指多环的环烷基，且该多环的环烷基中有两个环共用两个相邻的碳原子。“芳稠环”即“稠环芳基”，指多环中的至少一个环为芳基的稠环烷基。
[0061]“杂稠环基”指多环的杂环基，且该多环的杂环基中有两个环共用两个相邻的碳原子或杂原子。“芳杂稠环”即“稠环杂芳基”，指多环中的至少一个环为杂芳基的杂稠环基。
[0062]
卤素指氟、氯、溴或碘。
[0063]
室温指25
±
5℃。
[0064]
本发明公开了一种合成on-dna芳基炔烃类先导化合物的新方法，该方法以寡聚核酸-末端炔烃化合物和芳基硼酸为原料，在铜催化剂和碱的存在下反应得到了on-dna芳基炔烃类先导化合物。本领域技术人员公知的，dna必须在一定的条件下才能保持稳定，应用于dna编码化合物库构建的反应需要具有较高的收率。在本发明的反应条件下，产物on-dna芳基炔烃类化合物不仅收率高，而且产物中的dna完整性好。本发明中得到的on-dna芳基炔烃类化合物的完整性不仅可以从液相谱质谱得到确认，还可以通过进行下一步dna酶催化偶联反应验证。
[0065]
与现有的制备on-dna芳基炔烃类先导化合物的方法相比，本发明的方法具有以下优势：
[0066]
(1)与碘代炔烃相比，本发明采用的原料末端炔烃都是商业化的产品，能够通过购买市售产品获得，并且价格便宜，降低了时间和经济成本；
[0067]
(2)本发明没有采用价格昂贵且稀有的钯催化剂，而是采用价格更便宜、更易得的铜催化剂，进一步降低了生产成本；
[0068]
(3)与碘代炔烃相比，本发明采用的原料末端炔烃更稳定，即使在酸、碱性的条件下也能够稳定存在，适用范围更广，拓宽了所能合成的on-dna芳基炔烃类先导化合物的种类；
[0069]
(4)本发明的方法条件温和，对dna损伤小。
[0070]
综上，本发明合成on-dna芳基炔烃类先导化合物的方法成本低，对dna损伤小，普适性好，操作简单，条件温和，能高收率地制得on-dna芳基炔烃类化合物。
[0071]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0072]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0073]
图1：dna-nhfmoc的液相谱质谱图。
[0074]
图2：dna-nh2的液相谱质谱图。
[0075]
图3：s1-1的液相谱质谱图。
[0076]
图4：s1-2的液相谱质谱图。
[0077]
图5：s1-3的液相谱质谱图。
[0078]
图6：s1-4的液相谱质谱图。
[0079]
图7：s1-5的液相谱质谱图。
[0080]
图8：s1-6的液相谱质谱图。
[0081]
图9：s1-7的液相谱质谱图。
[0082]
图10：s1-8的液相谱质谱图。
[0083]
图11：s1-9的液相谱质谱图。
[0084]
图12：s1-10的液相谱质谱图。
[0085]
图13：p1的液相谱质谱图。
[0086]
图14：p2的液相谱质谱图。
[0087]
图15：p3的液相谱质谱图。
[0088]
图16：p4的液相谱质谱图。
[0089]
图17：p5的液相谱质谱图。
[0090]
图18：p6的液相谱质谱图。
[0091]
图19：p7的液相谱质谱图。
[0092]
图20：p8的液相谱质谱图。
[0093]
图21：p9的液相谱质谱图。
[0094]
图22：p10的液相谱质谱图。
[0095]
图23：p11的液相谱质谱图。
[0096]
图24：p12的液相谱质谱图。
[0097]
图25：p13的液相谱质谱图。
[0098]
图26：p14的液相谱质谱图。
[0099]
图27：p15的液相谱质谱图。
[0100]
图28：p16的液相谱质谱图。
[0101]
图29：p17的液相谱质谱图。
[0102]
图30：p18的液相谱质谱图。
[0103]
图31：p19的液相谱质谱图。
[0104]
图32：p20的液相谱质谱图。
[0105]
图33：p21的液相谱质谱图。
[0106]
图34：p22的液相谱质谱图。
[0107]
图35：p23的液相谱质谱图。
[0108]
图36：p24的液相谱质谱图。
[0109]
图37：p25的液相谱质谱图。
[0110]
图38：p26的液相谱质谱图。
[0111]
图39：p27的液相谱质谱图。
[0112]
图40：p2-1的液相谱质谱图。
[0113]
图41：hp的结构。
[0114]
图42：寡聚核酸-芳基炔烃类化合物p1～p27的结构、收率和分子量，括号内表示收率。
具体实施方式
[0115]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0116]
本发明实施例采用的芳基硼酸为以下s2-1～s2-18中的一种，均为已知化合物，可通过购买市售产品获得：
[0117][0118]
本发明实施例采用的寡聚核酸-末端炔烃化合物为以下s1-1～s1-10中的一种：
[0119][0120]
以下为合成寡聚核酸-末端炔烃化合物s1-1～s1-10的路线：
[0121][0122]
将100纳摩尔hp(hp的结构如图41所示，为市售产品)溶于去离子水配制成1毫摩尔/升的hp溶液(100微升，1当量)。将40当量的起始头片段化合物sm1(市售产品，200毫摩尔/升dmso溶液)、250当量ph＝9.47的四硼酸钠(na2b4o7)缓冲液(250毫摩尔/升水溶液)、40
当量的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmt-mm)(200毫摩尔/升水溶液，4000纳摩尔)混合。将该混合物充分混匀后加入到hp溶液中，再次混匀后于4℃下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升的氯化钠溶液，然后继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应液置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀干燥后得到dna-nhfmoc。利用液相谱质谱联用仪进行检测，dna-nhfmoc的谱图如图1所示，其分子量为5406。
[0123]
(1.2)合成dna-nh2[0124][0125]
将100纳摩尔dna-nhfmoc溶于去离子水配制成1毫摩尔/升的溶液(100微升，100纳摩尔，1当量)，向其中加入36微升10％的(piperidine)水溶液，将两者混合均匀后于室温下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升的氯化钠溶液。然后继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应液置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀干燥后得到寡聚核酸-nh2(简写为dna-nh2)。利用液相谱质谱联用仪进行检测，dna-nh2的谱图如图2所示，其分子量为5184。
[0126]
(1.3)合成寡聚核酸-末端炔烃化合物s1
[0127][0128]
将100纳摩尔dna-nh2溶于去离子水配制成1毫摩尔/升的dna-nh2溶液(100微升，100纳摩尔，1当量)。在80当量酸-末端炔烃化合物1(200毫摩尔/升dmso溶液)中加入200当量n,n-二异丙基乙胺(200毫摩尔/升dmso溶液)，50当量2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(200毫摩尔/升dmso溶液)，将该混合物充分混匀后加入到dna-nh2溶液中，再次混合均匀后室温反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升氯化钠溶液。然后继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应液置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液，余下沉淀干燥后得到寡聚核酸-末端炔烃化合物s1。化合物s1根据结构中l的不同，分别对应于化合物s1-1～s1-10。
[0129]
利用液相谱质谱联用仪进行检测,s1-1～s1-10的谱图见图3-12。
[0130]
实施例1：合成寡聚核酸-芳基炔烃类化合物p1
[0131]
[0132]
将1纳摩尔寡聚核酸-末端炔烃化合物s1-1(1当量)溶于去离子水，配制成1毫摩尔/升的溶液，并向其中加入200当量芳基硼酸s2-1(200毫摩尔/升甲醇溶液)、15当量碳酸钾(20毫摩尔/升水溶液)以及10当量碘化亚铜(10毫摩尔/升乙腈溶液)。将该混合物混合均匀后于25℃下反应24小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1摩尔/升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，70℃下反应10～30分钟。再向上述反应液中加入总体积10％的5摩尔/升氯化钠水溶液以及总体积3倍的无水乙醇，振荡混合均匀后，将反应液置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液，余下沉淀干燥后得到寡聚核酸-芳基炔烃化合物p1。通过液相谱质谱联用仪进行检测，检测到相应产物分子量为5388，说明寡聚核酸-芳基炔烃化合物p1合成成功。通过液相谱质谱检测得反应收率为88％，谱图见图13。
[0133]
实施例2-18：合成寡聚核酸-芳基炔烃类化合物p2～p18
[0134]
参照实施例1的合成方法，区别仅在于将原料芳基硼酸s2-1分别替换为s2-2～s2-18，分别得到寡聚核酸-芳基炔烃化合物p2～p18。
[0135]
实施例19-27：合成寡聚核酸-芳基炔烃类化合物p19～p27
[0136]
参照实施例1的合成方法，区别仅在于将原料寡聚核酸-末端炔烃化合物s1-1分别替换为s1-2～s1-10，分别得到寡聚核酸-芳基炔烃化合物p19～p27。
[0137]
通过液相谱质谱联用仪对上述产物的分子量和反应收率进行检测，相应谱图见图14-39。寡聚核酸-芳基炔烃类化合物p1～p27的结构和收率汇总见图42。
[0138]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0139]
实验例1：合成寡聚核酸-芳基炔烃类化合物的条件筛选实验
[0140][0141]
以合成寡聚核酸-芳基炔烃类化合物p2为例，对铜催化剂的种类、碱的种类、原料比例、反应时间等条件进行了筛选。具体来说，参照实施例2的合成方法p2的方法，区别仅在于按照表1控制铜催化剂的种类和当量、碱的种类和当量、原料s2-2的当量、反应时间，比较不同条件下所得化合物p2的收率。
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表1.合成化合物p2的条件筛选实验结果
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表1中，14号的“b”表示反应时间为10小时，其余1-13、15号的反应时间与实施例2中相同，都是24小时。
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根据实验结果可以看出，在12号的反应条件(即实施例2的反应条件)下，所得产物p2的收率最高。
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实际上，15号的反应条件与申请号为cn202210032980.8的中国专利申请中寡聚核酸-碘代炔烃与硼酸试剂在铜催化剂和碱的存在下反应制备芳基炔烃类先导化合物p2的优选反应条件相同。但是，比较15号和12号的反应收率可以看出，如果在cn202210032980.8中制备p2的优选反应条件下利用本发明的方法制备p2，所得产物收率仅60％，明显低于15号的产物收率。
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也就是说，利用本发明的方法在12号的反应条件(即实施例2的反应条件)下，不仅能够克服以碘代炔烃为起始原料时的缺点，同时能够得到高收率的on-dna芳基炔烃类先导化合物。
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实验例2：本发明寡聚核酸-芳基炔烃类化合物中寡聚核酸的完整性验证
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以下利用寡聚核酸-芳基炔烃类化合物p2与tag a(短链的寡聚核苷酸，两条链的分子量分别为4064，5884)的链接实验来验证寡聚核酸的完整性：
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步骤：将1纳摩尔p2溶于去离子水配制成1毫摩尔/升的溶液(1微升，1纳摩尔，1当量)，向其中加入1.2当量的taga(1毫摩尔/升水溶液，1.2当量)、1微升10
×
t4 dna链接缓冲溶液以及0.5微升t4 dna链接酶。将上述溶液混合均匀，室温反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应液置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后在4000rpm的转速下离心半小时，
倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后通过液相谱质谱联用仪检测并确认产物分子量。反应原料p2和产物p2-1的液相谱质谱联用检测结果分别见图14和图40。
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结果发现，寡聚核酸-芳基炔烃类化合物p2与tag a能够成功进行dna酶催化偶联反应。说明本发明合成化合物p2的方法没有对寡聚核酸部分的结构造成破坏；同时，液相谱质谱联用检测分析表明该反应产物纯度高、质谱检测能够精确得到与计算值相吻合的实验数值，进一步验证了dna的良好完整性。
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综上，本发明提供了一种合成on-dna芳基炔烃类先导化合物的方法，属于基因编码化合物库构建领域。本发明公开了一种合成on-dna芳基炔烃类先导化合物的新方法，该方法以寡聚核酸-末端炔烃化合物和芳基硼酸为原料，在铜催化剂和碱的存在下反应得到了on-dna芳基炔烃类先导化合物。本发明合成on-dna芳基炔烃类先导化合物的方法成本低，对dna损伤小，普适性好，操作简单，条件温和，能高收率地制得on-dna芳基炔烃类化合物，在构建基因编码化合物库中应用前景广阔。

技术特征：

1.一种合成的on-dna芳基炔烃类先导化合物方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：以式i所示化合物和式ii所示化合物为原料，在碱和铜催化剂的存在下反应，得到式iii所示on-dna芳基炔烃类先导化合物；其中，dna为单链或双链的核苷酸链；x为连接单元；l为无或连接单元；a环选自5～6元杂芳环、苯环、芳稠环、芳杂稠环；m为1～4的整数；r
a
各自独立地选自未被取代或被一个或两个以上r
d
取代的c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、or
c
、卤素、氰基、3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基，或者其中两个r
a
连接成环；r
c
选自3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基；r
d
各自独立地选自氰基、卤素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述式i所示化合物、式ii所示化合物、碱和铜催化剂的当量比为1:(1-1000):(1-500):(0.1-100)；所述碱为碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化铯、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、磷酸钾、磷酸钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氟化铯、叔丁醇钾、叔丁醇钠、三乙胺、正丁胺、异丁胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、n,n-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、n,n,n',n'-四甲基乙二胺、1,1,3,3-四甲基胍、n,n-二环己基甲胺、二环己胺、四氢吡咯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或任意两种以上的混合物；所述铜催化剂为醋酸铜、硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、碳酸铜、碘化亚铜、铜-β-环糊精复合物、双(2,4-戊二酮酸)铜、乙酰丙酮铜、四氟硼酸四(乙腈)铜、二氯(1,10-菲咯啉)铜、双(8-羟基喹啉)铜、三氟甲磺酸铜、双(三氟-2,4-戊二酮)铜、高氯酸铜、六氟磷酸四(乙腈)铜、醋酸亚铜、溴化铜、氟化铜、溴化亚铜、氯化亚铜、氯化亚铜-双(氯化锂)络合物、溴化亚铜二甲硫醚络合物中的任意一种或任意两种以上的混合物；所述反应的溶剂为水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或任意两种以上的混合物；
所述反应的温度为0-40℃，反应的时间为1-48小时。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述式i所示化合物、式ii所示化合物、碱和铜催化剂的当量比为1:(1-200):(1-100):(0.1-50)；所述碱为碳酸钾、碳酸钠中的一种或两种的混合物；所述铜催化剂为碘化亚铜、六氟磷酸四(乙腈)铜、氯化亚铜-双(氯化锂)络合物中的任意一种或任意两种以上的混合物；所述反应的溶剂为水、甲醇和乙腈的混合物；所述反应的温度为25℃，反应的时间为24小时。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述式i所示化合物、式ii所示化合物、碱和铜催化剂的当量比为1:200:15:10；所述碱为碳酸钾；所述铜催化剂为碘化亚铜。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：x选自nhco、conh、nh、co。6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：l选自无、c
1-4
亚烷基、未被取代或被一个或两个以上r
b
取代的5～6元杂芳环、未被取代或被一个或两个以上r
b
取代的苯环；其中，l1选自c
1-2
亚烷基，l2选自c
1-2
亚烷基，y选自o或s；r
b
各自独立地选自卤素、c
1-3
烷基；a环选自5～6元杂芳环、苯环、芳稠环、芳杂稠环；m为1、2或3；r
a
各自独立地选自未被取代或被一个或两个以上r
d
取代的c
1-4
烷基、c
1-4
烷氧基、or
c
、卤素、3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基，或者其中两个r
a
连接成环，所述环为5～6元饱和环；r
c
选自3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基；r
d
各自独立地选自氰基、卤素。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：x为nhco，式i所示化合物的合成方法包括以下步骤：以式i-a所示化合物和式i-b所示化合物为原料，反应，得到式i所示化合物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述反应是在碱和缩合试剂的作用下进行的，式i-a所示化合物、式i-b所示化合物、碱和缩合试剂的当量比为1：(40-160)：(100-400)：(25-100)；所述反应的温度为0-40℃，反应的时间为0.5-10小时；所述反应的溶剂为水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、
1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或任意两种以上的混合物。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述碱为n,n-二异丙基乙胺，缩合试剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯；式i-a所示化合物、式i-b所示化合物、碱和缩合试剂的当量比为1：80：200：50；所述反应的温度为室温，反应的时间为1小时；所述反应的溶剂为水和二甲基亚砜的混合物。10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于：所述on-dna芳基炔烃类先导化合物为以下化合物之一：

技术总结

本发明提供了一种合成On-DNA芳基炔烃类先导化合物的方法，属于基因编码化合物库构建领域。该方法以寡聚核酸-末端炔烃化合物和芳基硼酸为原料，在铜催化剂和碱的存在下反应得到了On-DNA芳基炔烃类先导化合物。本发明合成On-DNA芳基炔烃类先导化合物的方法成本低，对DNA损伤小，普适性好，操作简单，条件温和，能高收率地制得On-DNA芳基炔烃类化合物，在构建基因编码化合物库中应用前景广阔。因编码化合物库中应用前景广阔。因编码化合物库中应用前景广阔。