具有组织保护活性的新多肽的制备方法及在中的应用

具有组织保护活性的新多肽的制备方法及在中的应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，本发明多肽作为组织保护性多肽，能够保护机体几乎所有的器官和组 织，尤其对于多种组织炎症，具有良好的保护，和治愈作用。本发明涉及多肽固相化学合成、多肽大 规模纯化及冻干、理化性质测定、应用等技术。

背景技术

外源性和内源性损伤因子可引起细胞各种各样的损伤性病变，与此同时机体的局部和全身则发生一系 列复杂的反应，以局限并消灭损伤因子，清除和吸收坏死组织、细胞，并修复损伤，这就是机体的防御性 反应称为炎症。炎症是十分常见而又重要的基本病理过程，体表的外伤感染和各器官的大部分常见病和多 发病(如疖、痈、肺炎、肝炎、肾炎等)都属于炎症性疾病。

以血管系统改变为中心的一系列局部反应，有利于清除消灭致病因子，液体的渗出可稀释毒素，吞噬 搬运坏死组织以利于再生和修复，使致病因子局限在炎症部位而不致蔓延全身。因此，炎症是机体的防御 性反应，通常对机体是有利的，如果没有炎症反应，人们将不能长期生存于这个充满致炎因子的自然环境 中。但是炎症对机体也有潜在的很大危害性，严重的过敏反应可危及病人的生命；心包腔内纤维素性渗出 物机化可形成缩窄性心包炎，进而影响心功能；发生于脑实质或脑膜的炎症可引起颅内压升高，甚至形成 脑疝致使生命中枢受压而造成病人死亡；此外声带急性炎症水肿可导致窒息，等等。因此在一定情况下应 采取措施控制炎症反应。基于以上原因，本发明公布了一种具有组织保护活性的新的多肽。

目前已经有多种用于各种人和动物不同疾病的蛋白质和肽。这些蛋白或者多肽有很多是在体内产 生的、并且可以从动物或者人体中提取出来用于制备药物组合物。也有很多是在这些物质的基础上，通过 化学合成，化学改性等等技术手段人工得到，并广泛用于多种疾病。上述物质有：胰岛素、促红细胞 生成素、BMP、干扰素，生长抑素，奥曲肽，亮丙瑞林等等。本发明的目的，公布一种具有组织保护活性 的新多肽的制备方法，用于炎症的。临床实验表明本发明多肽对于多种组织炎症，具有良好的保护， 和治愈作用。

发明内容

本发明涉及了一种新的具有组织保护活性的多肽。该多肽含有8‑15个氨基酸残基、分子量为900‑1600 道尔顿并且具有多种组织保护活性。本发明公布了其序列、化学合成方法及其在中的应用。同时公布 了采用本发明多肽与一种或多种药物载体组合制备各种药物机型的方法以及本发明多肽对于各种组织炎 症具有良好的保护，和治愈作用。虽然具体的作用机理还不明确，本发明多肽以多种方式给予很低剂 量(通常为毫克或纳克/公斤体重)时即对几乎所有的器官和组织显示出保护作用。多项动物实验表明，本 发明的多肽可以削弱由化学诱导引起的肝、肺、结肠和胃等组织的损伤，抑制炎性反应，减少消化道溃疡， 减少肝脏和胆道的损伤，还具有抗焦虑和抗抑郁作用。可以促进血管生成、促进创伤愈合等，可以逆转由 神经毒素MPTP诱导的帕金森症模型中的异常。另外，对于胃粘膜具有显著的保护作用，还可以缓解炎症 反应。

本发明公布的多肽序列具有以下结构通式：

【Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa】

或者：

[Zaa Pro Pro Pro XaaYaa Pro Ala]

其中Xaa是中性脂肪族氨基酸残基，特别是Ala、bAla、Leu、Ile、Gly、Val、Nle或Nva，

Yaa是碱性氨基酸残基，特别是Lys、Arg、Orn或His，

Zaa是酸性氨基酸残基，特别是Glu、Asp、Aad或Apm。

本发明多肽的氨基酸序列的具体组合记录于序列表中。

本发明的多肽合成后，可以做成游离态形式，也可以做成阳离子盐，如：TFA盐(三氟乙酸盐)，HCl 盐(盐酸盐)，醋酸盐形式。

本发明的多肽，可以选择和一种或多种药物载体组合，制成多种药物剂型，用于。这些药物剂型 涵盖：注射溶液、片剂、霜剂、胶囊、软膏、洗剂、舌含片等剂型局部或全身给药。剂量优选在10^‑5～10^‑2mg/kg 体重的范围内，以0.1％‑0.5％的较高浓度全身或局部给药。对于具体的最佳剂量的确定是本领域技术 人员熟知的。

具体实施方法

下面结合具体的实施方法对本发多肽的合成、纯化及理化性能及在牛乳腺炎症中的做进一步的阐 述。

实施例1：多肽的化学合成及纯化：

以SEQ ID No.2所示的氨基酸序列为例化学合成多肽。

采用Fmoc固相法合成：

采用固相合成仪器，选用0.5克的val‑2氯三苯甲基树脂为起始树脂，合成反应管中依次加入：

Fmoc‑leu，Fmoc‑gly，Fmoc‑ala，Fmoc‑Asp(otbu)fmoc‑asp(otbu)，Fmoc‑ala，Fmoc‑pro，Fmoc‑lys(boc)，FMoc ‑gly，FMoc‑pro，Fmoc‑pro，FMoc‑pro，Fmoc‑Glu(otbu)，Fmoc‑gly.

试剂瓶中加入DIC/DMF溶液和HOBT/DMF溶液和DMF溶液。启动合成仪器连接电脑，输入合成程 序，开始合成。

合成的后处理：

把树脂从合成反应柱中取出，放入一底部有烧结玻璃滤片的玻璃容器中，分别依次用DMF(二甲基甲 酰胺)，DCM(二氯甲烷)，MeOH(甲醇)，DCM，MeOH5‑10倍的树脂体积冲洗树脂。冲洗后的树脂冷冻干 燥。

树脂冲洗完毕，另取一带玻璃塞的试管，配置20毫升裂解试剂，配置方式如下：

(1)：加17.5毫升TFA(三氟乙酸)于试管中(TFA有强腐蚀性和挥发性，应在通风厨中操作)

(2)：加EDC0.5毫升

(3)：加thioanisole 1毫升

(4)：加anisole 0.4毫升

以上试剂都加入后，轻微震荡混匀，加入放入树脂的玻璃容器中。反应2.5小时。待反应完毕，用真 空抽滤的办法分离树脂和裂解试剂。把裂解试剂放入一球形烧瓶中，用旋转蒸发的办法减压蒸去液体物质， 只留下固体。

另取100毫升的冷乙醚加入球形烧瓶中，此时有大量的白沉淀物质，为粗多肽。离心分离乙醚和多 肽。丢弃上清乙醚，多肽继续用冷乙醚洗涤，离心，得到多肽粗品。

多肽粗品用冻干机冻干，用于下一步纯化。

合成产物的纯化：

多肽粗品1克，溶于5毫升的纯水中，过滤，上制备级高效液相谱。谱配40*250mm的C18反相 柱。

流动相：A相0.1％的TFA+水

B相0.1％的TFA+乙腈。

采用程序：B在40分钟内从5％上升到55％，收集主峰，得到溶于流动相的多肽纯品。

上述溶液状态的多肽，采用低温旋转蒸发方式初步浓缩，然后用冻干机冷冻干燥。得到纯品。

纯品的质谱图1及HPLC图2见说明书附图。

实施例2：稳定性试验

将本发明多肽于40℃保温76天和120天测试其稳定性。稳定性试验采用HPLC方法进行测定。水溶 液中多肽的浓度为0.2％(w/v)：柱，Kromasil100，5u，250x 4.6mm；流动相，0.1％三氟乙酸的水/乙睛溶 液(0至50vol.％)，在25分钟内梯度洗脱，流速1ml/min；检测：UV，218nm。

为了进行比较，使用游离的多肽及其单乙酸盐。

表1

从表1数据可以表明，本发明多肽稳定性非常高。其溶液在40℃，120天后依然具有97％以上的目标 物质。

实施例3：本发明多肽的毒性

采用小鼠灌胃和注射方式测定本发明多肽的急性毒性。

溶液配制：

采用本发明多肽25毫克，加灭菌水至20毫升，配置成浓度为1.25毫克/毫升的溶液，供口服灌胃。

采用本发明多肽25毫克，加灭菌水至10毫升，配置成浓度为2.5毫克/毫升的溶液，供腹腔注射用。

给药剂量计算：

小鼠口服灌胃给药体积为40毫升/公斤体重，故给药剂量为：1.25mg/ml*40ml/kg＝50mg/kg。

小鼠腹腔注射给药体积为20毫升/公斤体重，故给药剂量为：2.5mg/ml*20ml/kg＝50mg/kg。

取健康小鼠80只，分四组实验。给药后，在第7天和14天，观察，称重。并于实验结束后称重，处 死，解剖观察内部器官。

结论：

1、小鼠一日一次口服灌胃给药，给药剂量50毫克/公斤体重，未见明显急性毒性反应。LD50＞50mg/kg。

2、小鼠一日一次腹腔注射给药，给药剂量50毫克/公斤体重，未见明显急性毒性反应。LD50＞50mg/kg。

由上所述，本发明多肽在50毫克每公斤体重剂量下，未见明显急性毒性表现。

实施例4：含本发明多肽的片剂的制备

实施例5：含本发明多肽的胶囊的制备

实施例6：含多肽的溶液剂的制备

实施例7：含多肽的霜剂的制备

实施例8：对组织炎症的作用。

本发明多肽对于多种组织炎症，具有良好的保护，，治愈作用 引言：

用能代表人类中的急性和/或慢性炎症疾病的适宜模型，可以用来评估目前使用的抗炎药 物。

材料和方法：

在胃肠损伤(消炎痛(30mg/kg，皮下)、阿司匹林(400mg/kg，胃内)和双氯芬酸钠 (125mg/kg，腹膜内))研究中，有规律地施用本发明多肽(10ug或10ng/kg腹膜内)，同时 和在药物(消炎痛)应用前1小时施用。在佐剂关节炎(经尾给药0.2ml弗氏佐剂)研究(14 天、30天、1年)中，单次给药(在应用弗氏佐剂前或后1小时)本发明多肽或以每天一次 的方案(0‑第14天、第14‑30天和第14天‑1年)施用本发明多肽。

结果：

与研究的NSAIA一起给药，本发明多肽持续降低了对照大鼠胃中的其他显著损伤，以及 消炎痛组中小肠中的损伤。在佐剂关节炎研究中，在单次给药后，甚至在每天用本发明多肽 的更衰弱的大鼠中，损伤的发展明显降低。作为已经确立的佐剂关节炎的一种方法， 在仅2星期后，多肽的有益效果就持续出现，而且在应用后1年更明显。这些数据表明 了多肽对粘膜整体的抗炎和保护作用。

已知在佐剂关节炎的中，涉及两种不同的机制，炎症和迟发型的反应过度。本发明 多肽对这两者均有积极的效果。相对于参考标准(即阿司匹林、消炎痛)，本发明在相当低的 剂量(ug和ng/kg对mg/kg)也是有效的。在佐剂关节炎预防中的这种初始有效性在每天的应 用中甚至更高。在一次或每天给药时，较高剂量(10ug/kg)均是有效的，而较低剂量(10ng/kg)， 一次给药是无效的，但当每天给药时，是有效的。本发明多肽在佐剂关节炎中的显著效果(预 防/效果，未确立的/确立的佐剂关节炎)，用目前使用的药物是无法观察到的。当每 天施用时，糖皮质激素对于佐剂关节炎的预防是有效的，但在短期中是无效的。免疫抑 制剂(高剂量的)和非甾类镇痛药分别仅在前或后是有效的。

因此，基于所用模型与相应人疾病之间的极类似性，证明具有粘膜保护特性的本发明多 肽可用于与急性炎症和慢性关节炎有关的疾病。另外，本发明多肽可用于与迟发型 过敏性疾病和在胃肠道各部分诱发的胃肠损伤特别是由药物如NSAIA诱发的损伤有关的疾 病。

本发明多肽除了对上述组织具有作用外，对于受损细胞细胞和器官同样具有明显的 保护作用。