灰飞虱沃尔巴克氏体的检测引物及其检测方法和检测试剂盒

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种灰飞虱沃尔巴克氏体的检测引物及其 检测方法和检测试剂盒。

沃尔巴克氏体作为一种母系遗传的专性胞内共生菌，广泛存在于大量的节肢动物 体内。已有的研究表明，在全世界范围内，理论上约有60％的昆虫感染了沃尔巴克氏体。沃 尔巴克氏体不仅可以在寄主体内诱导胞质不亲和(Cytoplasmic Incompatibility,CI)表 型达到种压制效果，同时也能通过其所推动的种替换达到阻断虫媒病毒的作用。CI是 指当感染一种沃尔巴克氏体的雄虫与不感染沃尔巴克氏体的雌虫或感染不同株系沃尔巴 克氏体的雌虫交配时所产后代胚胎的死亡，从而表现为成虫的不育。

在防治目标区域内，持续地释放经人工转染的沃尔巴克氏体所修饰而具有诱导CI 能力的白纹伊蚊Aedes albopictus雄虫与野外的雌虫交配，可以达到快速压制野生种效 果。与此同时，与传统农药相比，基于沃尔巴克氏体的防治策略具有靶标专一性的优势，大 大减少了对生态系统中其他生物落的影响，对环境的破坏程度也大大降低。

通过人工转染的方式，将这样一种垂直传播的共生菌水平地从原始寄主转入一个 新寄主体内，并使其稳定遗传下去，从而建立一个新的感染品系，作为防治其野生种的供 体的过程，是沃尔巴克氏体应用研究中最为关键的一部分。大量的研究表明，在实验室条件 下利用显微注射技术能够成功地实现沃尔巴克氏体在不同寄主之间的水平转染。一旦进入 新的寄主，Wolbachia往往可以不同程度地影响寄主的表型，比如表达CI、提高寄主的抗病 毒能力以及缩短寄主寿命等等。已经有研究表明综合利用沃尔巴克氏体所诱导的表型，可 以成功通过种替换的方式阻断登革病毒的传播。

稻飞虱作为一种重要的农业害虫，对我国首要的粮食作物——水稻的生产造成了 极大的危害。除了造成水稻的减产甚至部分田块的绝收，每年由于对其防治造成的经济损 失也十分惊人。其中，灰飞虱的成、若虫均以口器刺吸水稻汁液为害，一般集于稻丛中上 部叶片，近年发现部分稻区水稻穗部受害亦较严重，灰飞虱是传播条纹叶枯病等多种水稻 病毒病的媒介，为害作物多为水稻、大麦、小麦、取食看麦娘、游草、稗草、双穗雀稗。近年来， 对玉米的危害正成逐步上升的趋势。考虑到化学杀虫剂的长期使用带来的抗性会无法避免 地降低其对稻飞虱的防治效果，新的防治手段的研究与开发一直是科学家们所关注的热点 问题，也符合有害昆虫综合治理的总体方针。

我国危害水稻的稻飞虱主要有三种：褐飞虱和灰飞虱和白背飞虱三种，自然界中 的灰飞虱天然携带沃尔巴克氏体，但是目前对于灰飞虱的沃尔巴克氏体检测没有特异性的 引物和方法，所以到特异性的检测引物和检测方法显得尤为重要。

本发明的目的之一是提供一种专一性强、特异性高和灵敏度高的灰飞虱沃尔巴克 氏体的检测引物以及试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下：

一种灰飞虱沃尔巴克氏体的检测引物，其上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

一种灰飞虱沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括检测引物和PCR试剂，所述的检测引 物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

优选地，还包括有灰飞虱的DNA提取试剂，DNA提取试剂包括有稀释缓冲液和 DNARelease。

优选地，所述稀释缓冲液为：30mM NaOH、0.25mM EDTA、15mMTris-HCl，溶剂为水； 每20μl稀释缓冲液中加入0.5μl DNARelease。

本发明的另一目的是提供一种灰飞虱沃尔巴克氏体的检测方法。

实现上述目的的技术方案如下。

一种灰飞虱沃尔巴克氏体的检测方法，包括以下步骤：

(1)先把灰飞虱在无水酒精里浸泡，提取样品DNA；

(2)加入样品DNA稀释10倍为模板，以SEQ IDNO.1和SEQ IDNO.2作为PCR引物，进行 PCR扩增。

优选地，所述的进行PCR扩增，其反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性5秒、55 ℃退火30秒、72℃延伸30秒，30个循环。

优选地，所述提取样品DNA的方法包括如下步骤：

将灰飞虱放入稀释缓冲液和DNARelease中；

瞬时离心后，放入PCR仪中进行DNA提取；

DNA提取程序：55℃,5min；98℃,5min；30℃,10s。

优选地，扩增时加入的样品DNA的浓度为是109×10-1—55×10-4ng/μl。

本发明的另一目的是提供一种灰飞虱沃尔巴克氏体DNA的提取方法。

一种灰飞虱沃尔巴克氏体DNA的提取方法，包括以下步骤：

先把灰飞虱在无水酒精里浸泡2±0.2分钟，然后把灰飞虱放入稀释缓冲液和 DNARelease中；

瞬时离心后，放入PCR仪中进行DNA提取；

DNA提取程序：55℃,5min；98℃,5min；30℃,10s，即得。

利用本发明的检测引物按照本发明的检测方法能够快速高效专一的检测出灰飞 虱沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高(只检测出灰飞虱沃尔巴克氏体，而褐飞虱沃尔 巴克氏体不发生扩增)，灵敏度高，其最低检测限为55×10-4ng/μl。

因此，本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便等优点。

图1是实施例2中特异性实验结果，其中M为Marker，1-3为广州灰飞虱的沃尔巴克 氏体，4-6为广州褐飞虱的沃尔巴克氏体。

图2、图3和图4是实施例3中灵敏度实验结果，其中M为Marker，1为10倍稀释的DNA 样品，2、3、4、5、6分别是100、1000、10000、100000、1000000倍稀释的DNA样品。

图5是实施例4中引物对比实验结果。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不 同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本 发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售 产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列 项目的任意的和所有的组合。

实施例1

本实施例所述一种灰飞虱沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括检测引物和PCR试剂， 所述的检测引物如下所示。

wStriF:5’-GTAAATACTTCTGAAACAAATG-3’；SEQ ID NO.1

wStriR:5’-AAA AATTAAACGCTACTCCA-3’；SEQ ID NO.2。

实施例2：特异性

1、取6个分别装有20μl稀释缓冲液和0.5μl DNARelease(稀释缓冲液的配方为： 30mM NaOH、0.25mM EDTA、15mMTris-HCl，溶剂为水)的0.2ml EP管；

2、三只广州灰飞虱(含有灰飞虱沃尔巴克氏体)和三只褐飞虱(含有褐飞虱沃尔巴 克氏体)在无水乙醇里浸泡2分钟后，取出整只飞虱分别放入上述6个EP管中；

3、瞬时离心后，放入PCR仪中进行DNA提取；

4、DNA提取程序：55℃,5min；98℃,5min；30℃,10s。

5、瞬时离心后，得到DNA抽提液，稀释10倍后，-20℃保存，即分别获得六只飞虱的 沃尔巴克氏体的基因组DNA(具体为：三份广州灰飞虱沃尔巴克氏体的基因组DNA，三份褐飞 虱沃尔巴克氏体的基因组DNA)，分别以六只稻飞虱的沃尔巴克氏体的基因组DNA为模板，按 照实施例1所述试剂盒进行PCR反应。

5、PCR扩增体系：

模板DNA 2ul

10uM引物F(wStriF:5’-GTAAATACTTCTGAAACAAATG-3’) 1ul

10uM引物R(wStriR:5’-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3’) 1ul

2xPCR Mix 10ul

灭菌水 补至20ul

6、混匀离心后进行PCR扩增；

7、PCR反应条件：

8.扩增结束后进行琼脂糖电泳，目标条带大小为367bp。

具体结果如图1所示，图1中泳道1-3为广州灰飞虱(灰飞虱沃尔巴克氏体)，4-6为 褐飞虱(褐飞虱沃尔巴克氏体)，从图1中可以看出，只有灰飞虱沃尔巴克氏体能够扩增出， 而褐飞虱沃尔巴克氏体不能扩增出来，由此说明，本发明的扩增引物特异性强。

实施例3：灵敏度

取实施例2的三份稀释10倍的灰飞虱沃尔巴克氏体基因组DNA，然后进行100、 1000、10000、100000、1000000倍梯度稀释，再以稀释后的稀释液为模板DNA，按照实施例1所 述试剂盒以及实施例2所述的PCR方法进行扩增，具体结果如图2、图3和图4所示，稀释10000 倍后的稀释液都能扩增出PCR产物，再进行浓度计算，由此得到最后检测限是55×10-4ng/μl (即10000倍稀释液中灰飞虱沃尔巴克氏体的基因组DNA的浓度)。

实施例4

取三份灰飞虱和三分褐飞虱的沃尔巴克氏体基因组稀释10倍，按照实施例2的操 作和条件扩增，使用灰飞虱的通用引物(81F:5’-TGGTCCAATAAGTGATGAAGA AAC SEQ ID NO.3；691R:5’-AAA AATTAAACGCTACTCCA SEQ ID NO.4)和特异性引物对灰飞虱和褐飞虱进 行扩增。通用引物目标条带大小610bp，特异性引物目标条带大小367bp。

具体结果如图5所示，泳道1-6为通用引物，其中1-3为灰飞虱基因组DNA，4-6为褐 飞虱基因组DNA；7-12为本发明所述的灰飞虱特异性引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，其 中7-9为灰飞虱基因组DNA，10-12为褐飞虱基因组DNA；从图5中可以看出，通用引物能够把 灰飞虱和褐飞虱沃尔巴克氏体都能够扩增出，而本发明所述特异性引物只能把灰飞虱沃尔 巴克氏体能扩增，褐飞虱沃尔巴克氏体不能扩增出来，由此说明，本发明的灰飞虱特异性引 物比通用性的特异性好。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州威佰昆生物科技有限公司

<120> 灰飞虱沃尔巴克氏体的检测引物及其检测方法和检测试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtaaatactt ctgaaacaaa tg 22

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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