用于合成基于RNA的剂的方法和模块化设备与流程

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用于合成基于rna的剂的方法和模块化设备
技术领域
1.本发明涉及rna合成的方法，并且特别地，虽然不是唯一的，涉及用于连续的、自动的或半自动的rna合成的可扩展和模块化的流体流动系统和方法。

背景技术：

2.流动反应器(替选地被称为连续流动反应器)通过被连接成形成流体通道的导管网络提供材料或反应物的连续流动。在组装流动系统的混合模块、反应模块和过滤模块时，通过用端口和阀门启用或禁用流体通道，通过导管网络的各种配置来实现流体连通，以控制rna或核酸剂的合成、纯化和配置的条件，从而以连续流动的形式制造产品。操作有目的地构建的软件代码的计算机系统使得能够对流动系统内的全部过程参数集进行定向控制。这些参数包括混合条件、温度、ph值、试剂浓度、监测、停留时间、纯度曲线、产量等。示例现有技术的流动反应器通常被形成为单独模块的组件，这些模块面对面连接以形成流体被引导通过的整体块。wo 2013/050764中描述了示例流动反应器。
3.流动技术提供了更可持续、灵活和有效的药物制造生产。结合微技术和精密工程，流动系统可以被构建和配置为集成多个单元操作(例如，混合、反应合成、提取、分离、过滤和纯化)的微工厂。此外，流混合和反应系统中典型的小的体积与表面积之比允许精确控制与热和质量传递有关的过程条件，从而在小的装置占用面积(footprint)下加速过程并提高生产率。结合这些单元操作的集成流动系统可以被视为减少工厂地面空间的使用、减少能源消耗、提高资源利用率的微工厂或缩小的生产系统。因此，与目前通常用于生产预防性疫苗的物质的当前制造系统相比，可以实现可持续增长，并具有更好的环境影响、成本效益和灵活性。
4.在分子生物学和生物技术中，有一些方案越来越多地使用片上实验室(loc)装置。这样的loc装置使用微制造技术来使实验室分析化验微型化和集成化，并且在小芯片中进行小规模的合成或过滤。这些小型装置消耗较少的材料，产生较少的废物，降低了成本，也允许更快的反应时间。通过引导流体流过微混合器、微通道、过滤器，可以将给定方案的各种步骤集成到loc装置中，并且给定方案的各种步骤允许细胞分类、混合以及使得能够针对例如dna或rna的合成发生反应。重要的是，loc装置是由反应惰性材料形成的并且优选地是透明的，以便使得能够对芯片中的反应进行实时视觉检查。此外，透明的装置还使得可能进行光谱分析和研究。用于此类应用的快速成型的优选材料是pdms(聚二甲基硅氧烷)。
5.2019年，世界卫生组织确定了对全球健康的十个世界性威胁。特别是在诸如埃博拉或登革热的流行病已经/正在影响那里的人口的lmic(低收入和中等收入国家)中，这十个威胁中有八个是关于流行病和疫苗的可获得性。
6.因此，迫切需要适合用于可以满足大量、低成本和快速批量合成的要求的疫苗和疫苗前体的制造的设备和方法。特别地，需要可以用于满足紧急疫苗需求(即，在几天之内，易于储存和部署在世界各地，并具有很高的生产力和运行成本效益)的化学化合物制造平台。

技术实现要素：

7.因此，本发明的目的是提供一种模块化的制造平台，该模块化的制造平台能够对化学化合物以及生物分子和非生物分子进行可扩展的合成和/或过滤，特别地包括基于rna的疫苗或其他核酸疗法。本发明的特别目的是提供一种用于制备基于核酸的疫苗制造的可配置和集成的微工厂流动系统。
8.本公开内容提供了一种模块化和集成的装置，其灵感来自这些方法和实验室方案，这些方法和实验室方案包括用于快速并最终在使用点(例如，在医院环境内)制造rna和核酸物质的可配置和高度可扩展的方法。
9.特别地，本系统包括流动反应器单元、“连续”过滤单元和混合单元的组合。这些单元可以按照适合于目标rna、核酸性或预防性疫苗的任何顺序来集成。本集成的流动系统可以包括几个可选的分析探测器(包括光纤探测器)、检测器和用于uv-vis吸光度或荧光光谱的光源，以便在连续流动过程中对目标物质的合成或制造进行原位和在线控制。
10.具体目的是提供基于微流控(microfluidic)的设备和方法，所述设备和方法集成了包括经由各自的导管/通道互连以创建连续的流体流动路径的流体流动生物反应器模块和流体流动过滤模块的模块，该连续流体流动路径可以连续地被操作并且可以使用电子和/或软件控制工具(涉及膜、部件执行器如泵、阀、闸门、输送端口、出口端口、注射泵、传感器等的使用)实现自动化，如人们将理解的。
11.具体目的是提供一种流体流动系统，该流体流动系统用于经由可以是连续或非连续的并且可以是自动或半自动的过程对选定的化学成分例如生物分子和非生物分子进行反应合成。另一个具体目的是提供一种其中各个模块单元可以根据合成途径而互连的模块化系统。这样的单元可以包括端口、阀和适当的连接，以实现各个模块之间的流体连通和互连。另一个具体目的是提供一种用于流体的反应系统，该反应系统可配置成测量和响应于系统的特性(例如，流体的压力、温度、ph、流体的一个或更多个选定化学成分的体积或比例、流体的流速和流体的反应状态)。
12.另一个具体目的是提供一种其中可以将流体的化学成分在自动或半自动的流体流动系统内分离的流体流动过滤设备和方法。目的是提供一种可以经由适当的电子控制和经由流体压力的流体输送、再循环和/或驱动而连续操作的过滤系统。另一个具体目的是提供一种具有互连以形成网络的一个或多个反应器模块和过滤模块的流体流动系统。
13.另外的目的是提供用于合成rna的方法和设备。另一个具体目的是提供用于从dna合成rna的设备和方法。又一个目的是提供一种可以用于制备疫苗的合成rna的形式。
14.本发明的一个目的是提供一种能够合成和/或过滤化学化合物以及生物分子和非生物分子(特别地，包括rna和随后的疫苗)的模块化制造平台。本发明的具体目的是提供可配置为用于生物分子合成的微工厂的设备和系统以实现下游疫苗制造。
15.本发明的具体目的是提供形成流体流动集成系统的设备和方法，该流体流动集成系统包括组件模块化部件，组件模块化部件包括流体流动生物反应器模块和流体流动过滤模块，所述流体流动生物反应器模块和流体流动过滤模块经由各自的导管/通道互连以创建可以连续操作并且可以使用电子和/或软件控制工具自动化的流体流动路径。
16.根据本发明的第一方面，提供了一种rna合成的方法，该方法包括：经由多个入口端口将多个反应物引入第一流体流动模块，所述多个反应物包括至少一种三磷酸核苷
(ntp)、反应缓冲液和dna、基于dna的化合物或基于dna的混合物；允许反应物中的至少一些在流动系统的第一模块内的反应通道或井内进行反应；将dna保留在第一反应器模块处或使nda在第一反应器模块处再循环，并且允许反应物的反应产物流入第一流体过滤模块；以及在第一过滤模块内对反应产物进行过滤。
17.可选地，至少一种三磷酸核苷(ntp)是至少一种三磷酸核苷(ntp)的溶液。
18.可选地，至少一种三磷酸核苷(ntp)包括三磷酸腺苷(atp)、三磷酸胞苷(ctp)、三磷酸鸟苷(gtp)、三磷酸尿苷(utp)中的任何一种或三磷酸腺苷(atp)、三磷酸胞苷(ctp)、三磷酸鸟苷(gtp)、三磷酸尿苷(utp)的组合。
19.可选地，dna是质粒dna。可选地，多个反应物还包括酶混合物、盐溶液、rna聚合酶中的任何一种或酶混合物、盐溶液、rna聚合酶的组合。
20.可选地，该方法包括：将多个反应物中的至少一些从第一过滤模块的出口再循环至第一反应器模块的入口区域。可选地，该方法包括：将经过滤的反应产物中的至少一些从第一过滤模块输送至第二流体流动反应器模块中，并且将加帽酶输入至第二反应器模块中。可选地，该方法包括：将从第二反应器模块输出的流体输送至第二流体流动过滤模块。可选地，该方法包括：将任何未反应的ntp再循环至第一反应器模块的入口区域，并将任何未反应的加帽酶再循环至第二反应器模块的入口区域。
21.可选地，盐溶液或缓冲液包括mgcl2。可选地，rna聚合酶包括t7聚合酶。
22.根据本发明的另一个方面，提供了根据本文中所述的方法制备的rna或基于rna的化合物。
23.根据本发明的另一个方面，提供了根据本文所述的方法制备的rna或基于rna的化合物在制备疫苗中的用途。
24.根据本发明的另一个方面，提供了一种流体流动过滤设备，该设备包括：具有入口的第一伸长流体流动通道；具有出口的第二伸长流体流动通道；渗透膜，其被定位成沿着第一通道和第二通道的各自长度将第一通道与第二通道分隔开，使得渗透物可以沿着第一通道的长度和第二通道的长度从第一通道内的流体经由膜进入第二通道。
25.可选地，第一通道的大部分长度被定位成经由膜与第二通道的大部分长度邻近。
26.可选地，膜的孔径在100kda至1000kda的范围内、100kda至800kda的范围内、200kda至800kda的范围内或200kda至600kda的范围内、300kda至10mda的范围内。
27.可选地，该设备包括其中形成有第一通道的第一板和其中形成有第二通道的第二板，膜夹在第一板和第二板各自的相对面之间。可选地，第一通道和第二通道各自包括一系列的直线部分和弯曲部分。可选地，第一通道和第二通道在它们的纵向方向上包括各自的蛇形轮廓。可选地，第一通道和第二通道沿着它们的长度敞开并且被定位成与膜直接接触，该膜部分地限定第一通道和第二通道的纵向壁或面。可选地，膜的孔径小于rna分子的平均分子大小。
28.根据本发明的另一个方面，提供了一种用于处理流体的流体流动系统，该流体流动系统包括：第一反应器模块，其具有反应流动通道或井、至少一个入口和至少一个出口；第一过滤模块，其具有流体过滤区域、被设置成与第一反应器模块的出口流体连通的至少一个入口和至少一个出口；其中，第一过滤模块包括根据本文所述的流体流动过滤设备。
29.可选地，该系统包括第二反应器模块，该第二反应器模块具有反应流动通道或井、
至少一个入口和出口，所述入口被设置成与第一过滤模块流体连通。
30.可选地，该系统包括第二过滤模块，该第二过滤模块具有流体过滤区域、至少一个入口和出口，所述入口被设置成与第二反应器模块的出口流体连通。
31.可选地，该系统包括被设置成与第一过滤模块的入口区域流体连通的流体注入端口。可选地，该系统包括第一再循环导管，该第一再循环导管在第一反应器模块的出口的区域与第一反应器模块的至少一个入口之间延伸。可选地，该系统包括第二再循环导管，该第二再循环导管在第一过滤模块的出口的区域与第一反应器模块的出口之间延伸。可选地，该系统包括第三再循环导管，该第三再循环导管在第二过滤模块的出口的区域与第一反应模块的入口之间延伸。
32.根据本发明的另一个方面，提供了一种使用流体流动过滤设备过滤流体的方法，该方法包括：从入口驱动流体通过第一伸长流体流动通道；迫使流体的渗透物组分通过沿着第一通道延伸的膜并进入第二伸长流体流动通道；以及将流体的滞留物组分保留在第一通道内；其中，膜被定位成沿着第一通道和第二通道的各自长度将第一通道与第二通道分隔开，使得渗透物可以沿着第一通道和第二通道的各自长度从第一通道经由膜进入第二通道。
33.根据本发明的另一个方面，提供了一种流动系统，该流动系统包括：至少一个反应器模块，其具有反应流体流动通道或井、至少一个流体入口和至少一个流体出口；至少一个流动驱动器，其用于驱动流体流过通道或井；第一传感器，其用于测量系统内的流体的压力、温度或ph中的任何一个或者系统内的流体的压力、温度或ph的组合；第二传感器，其用于测量系统内的流体的压力、温度、ph中的任何一个或者系统内的流体的压力、温度、ph的组合；反应状态监测装置，其用于监测系统内的流体的特性，该特性指示系统内的流体的至少两种化学成分的反应状态；控制单元，其用于从第一传感器、第二传感器和反应状态监测装置中的至少一个或者第一传感器、第二传感器和反应状态监测装置的组合接收数据，并且控制系统内的流体的至少一种特性。
34.可选地，该系统的特性是以下中的任何一个或以下的组合：系统内的流体的压力；系统内的流体的温度；系统内的流体的ph；系统内的流体的一种或更多种化学成分的体积或比例；系统内的流体的流速。可选地，驱动流体的步骤包括：对第一通道内的流体加压。可选地，控制单元包括cpu、pcb、plc、pc、处理器芯片、手持电子装置。可选地，附加传感器包括温度传感器、ph传感器、压力传感器、流速传感器、流量传感器或光谱传感器中的任何一个或者温度传感器、ph传感器、压力传感器、流速传感器、流量传感器或光谱传感器的组合。
35.根据本发明的另一个方面，提供了一种使用流体流动设备处理流体的方法，该方法包括：经由至少一个入口将至少一种流体引入反应器模块中；使用至少一个流动驱动器来驱动流体流过反应流动通道或井或者使用至少一个流动驱动器将流体驱动在反应流动通道或井内，并且在出口处输出流体；测量流体流动设备内的流体的压力、温度或ph中的至少一个或者流体流动设备内的流体的压力、温度或ph的组合；监测流体流动设备内的流体内的化学成分的反应状态；以及响应于流体的压力的测量、流体的ph的测量、流体的温度的测量和/或流体的化学成分的反应状态的测量中的至少一个或者流体的压力的测量、流体的ph的测量、流体的温度的测量和/或流体的化学成分的反应状态的测量的组合，使用控制单元来控制流体流动设备内的流体的至少一个特性。
36.可选地，该系统包括以流体连通耦接在一起的多个反应器模块和过滤模块。可选地，流动驱动器是至少一个泵，并且可选地，流动驱动器是注射泵。可选地，流体分析传感器包括uv-vis光谱仪，该uv-vis光谱仪用于在190nm至1000nm的范围内的吸光度或荧光分析。
37.可选地，rna合成的方法包括：将任何未反应的ntp再循环至第一反应器模块的入口区域，并将任何未反应的加帽酶再循环至第二反应器模块的入口区域。
38.根据本发明的另一个方面，提供了根据本文所述的方法制备的rna。根据本发明的另一个方面，提供了根据任一前述权利要求所述的方法制备的rna在制备疫苗中的用途。
39.根据本发明的另一个方面，提供了一种用于处理流体的流体流动设备，该流体流动设备包括：第一反应器模块，其具有反应流动通道或井、至少一个入口和至少一个出口；第一过滤模块，其具有流体过滤区域、至少一个入口和至少一个出口，所述入口被设置成与第一反应器模块的出口流体连通。
40.可选地，该设备包括第二过滤模块，该第二过滤模块具有流体过滤区域、至少一个入口和出口，所述入口被设置成与第二反应器模块的出口流体连通。
41.可选地，该设备包括被设置成与第二反应器模块的入口区域流体连通的流体注入端口。可选地，该设备包括第一再循环导管，该第一再循环导管在第一反应器模块的出口的区域与第一反应器模块的至少一个入口的区域之间延伸。
42.可选地，该设备包括第三再循环导管，该第三再循环导管在第二过滤模块的出口的区域与第一反应模块的至少一个入口的区域之间延伸。可选地，该设备包括多个入口端口，以允许将流体化学成分输入至反应通道或井中。可选地，该设备包括至少一个泵，所述至少一个泵耦接至第一反应器模块的至少一个入口以驱动流体流过反应通道或将流体驱动在井内。可选地，该设备包括被设置成与设备内的流体流体连通的至少一个阀、流体流动闸门、流体流动端口、加热元件、流体储存装置或保存容器。可选地，泵包括注射泵。
43.可选地，该设备具有板状结构，使得第一反应器模块和第一过滤模块至少部分地形成为被设置在板状结构上或板状结构内部的通道或凹槽。可选地，该设备包括定位在设备的不同流体流动区域处的多个传感器。
44.可选地，传感器包括至少一个温度传感器、至少一个流速传感器、至少一个压力传感器、至少一个ph传感器、至少一个流量传感器、至少一个光谱传感器、至少一个光学传感器、至少一个光纤或光谱光纤中的任何一个或者至少一个温度传感器、至少一个流速传感器、至少一个压力传感器、至少一个ph传感器、至少一个流量传感器、至少一个光谱传感器、至少一个光学传感器、至少一个光纤或光谱光纤的组合。
45.可选地，该设备包括控制单元，该控制单元耦接至至少一个泵、阀、流体流动闸门、流体流动端口、加热元件、流体储存装置或保存容器以及传感器，以响应于由传感器确定的流体的物理、化学或机械特性的状态而控制设备内的流体流动的特性。可选地，控制单元包括cpu、处理器、pcb、plc、手持电子装置。
46.可选地，控制单元包括控制模块，该控制模块包括以下中的任何一个或以下的组合：软件；电子部件；数据存储工具；有线或无线通信模块和/或端口；视觉显示输出端；用户接口；至少一个致动器，其用于致动至少一个泵、阀、流体流动闸门、流体流动端口、加热元件、流体储存装置或保存容器和传感器中的任何一个或者至少一个泵、阀、流体流动闸门、流体流动端口、加热元件、流体储存装置或保存容器和传感器的组合。
47.根据本发明的另一个方面，提供了一种用于处理流体的流体流动系统，该流体流动系统包括：根据本文中的权利要求所述的多个设备，设备中的每一个的最终流体流动出口耦接至收集单元以对来自设备中的每一个的流体输出进行组合。
48.可选地，流体流动系统包括控制单元，该控制单元耦接至至少一个泵、阀、流体流动闸门、流体流动端口、加热元件、流体储存装置或保存容器以及每个设备或选择的设备的传感器，以响应于由传感器确定的流体的物理、化学或机械特性的状态而控制设备内的流体流动的特性。
49.根据本发明的另一个方面，提供了一种使用流体流动设备处理流体的方法，该方法包括：经由至少一个入口将至少一种流体引入第一反应器模块中，并允许流体流过反应流动通道或井或者允许流体在反应流动通道或井内流动，以及在第一反应器模块的出口处输出流体；驱动来自所述出口的流体的至少一部分经由至少一个入口通过具有流体过滤区域的过滤模块，并且在出口处输出来自第一过滤模块的流体；其中，在第一反应器模块中，在流体的至少两种化学成分之间发生反应，并且在第一过滤模块中发生流体的过滤。
50.可选地，该方法包括使用至少一个流体泵来驱动流体流过该设备。可选地，该方法包括：经由至少一个再循环导管将流体的至少一部分从反应器模块和/或过滤模块的出口再循环至反应器模块的至少一个入口的区域。可选地，该方法包括：使用至少一个传感器监测流体内化学成分之间发生的化学反应的状态。可选地，该方法包括：响应于由传感器标识的化学反应的状态而控制流体流过该设备。可选地，该方法包括：使用至少一个传感器来监测设备内的流体的物理、化学和/或机械特性。可选地，该方法包括：响应于由传感器标识的流体的物理、化学和/或机械特性而控制设备内的流体流动。可选地，控制流体流动的步骤包括：控制或停用被设置成与设备内的流体流体连通的至少一个执行器、泵、阀、闸门或端口。可选地，控制流体流动包括：使用cpu、处理器、pcb、plc或手持电子装置来致动或停用至少一个执行器、泵、阀、闸门或端口。
51.根据本发明的另一个方面，提供了一种流体流动过滤设备，该流体流动过滤设备包括：具有入口的第一伸长流体流动通道；具有出口的第二伸长流体流动通道；渗透膜，其被定位成沿着第一通道和第二通道的各自长度将第一通道与第二通道分隔开，使得渗透物可以沿着第一通道的长度和第二通道的长度从第一通道内的流体经由膜进入第二通道。
52.可选地，第一通道包括至少一个出口；并且其中，入口被设置成在第一通道的第一纵向端处或朝向第一通道的第一纵向端，并且出口被设置成在第一通道的第二纵向端处或朝向第一通道的第二纵向端。可选地，第二通道可以包括至少一个入口；并且其中，所述入口被设置成在第二通道的第一纵向端处或朝向第二通道的第一纵向端，并且出口被设置成在第二通道的第二纵向端处或朝向第二通道的第二纵向端。
53.根据本技术的另一个方面，提供了一种用于处理流体的流体流动系统，该流体流动系统包括：第一反应器模块，其具有反应流动通道或井、至少一个入口和至少一个出口；第一过滤模块，其具有流体过滤区域、被设置成与第一反应器模块的出口流体连通的至少一个入口和至少一个出口；其中，第一过滤模块包括根据本文所述的流体流动过滤设备。
54.根据本发明的另一个方面，提供了一种使用流体流动过滤设备过滤流体的方法，该方法包括：从入口驱动流体通过第一伸长流体流动通道；迫使流体的渗透物组分通过沿着第一通道延伸的膜并进入第二伸长流体流动通道；以及将流体的滞留物组分保留在第一
通道内；其中，膜被定位成沿着第一通道和第二通道的各自长度将第一通道与第二通道分隔开，使得渗透物可以沿着第一通道和第二通道的各自长度从第一通道经由膜进入第二通道。
55.根据本发明的另一个方面，提供了一种流体流动系统，该流体流动系统包括：至少一个反应器模块，其具有反应流体流动通道或井、至少一个流体入口和至少一个流体出口；至少一个流动驱动器，其用于驱动流体流过通道或井；第一传感器，其用于测量系统内的流体的压力、温度或ph中的任何一个或者系统内的流体的压力、温度或ph的组合；第二传感器，其用于测量系统内的流体的压力、温度、ph中的任何一个或者系统内的流体的压力、温度、ph的组合；反应状态监测装置，其用于监测系统内的流体的特性，该特性指示系统内的流体的至少两种化学成分的反应状态；控制单元，其用于从第一传感器、第二传感器和反应状态监测装置中的至少一个或者第一传感器、第二传感器和反应状态监测装置的组合接收数据，并且控制系统内的流体的至少一个特性。
56.根据本发明的另一个方面，提供了一种使用流体流动设备处理流体的方法，该方法包括：经由至少一个入口将至少一种流体引入反应器模块中；使用至少一个流动驱动器来驱动流体流过反应流动通道或井或者使用至少一个流动驱动器将流体驱动在反应流动通道或井内，并且在出口处输出流体；测量流体流动设备内的流体的压力、温度或ph中的至少一个或者流体流动设备内的流体的压力、温度或ph的组合；监测流体流动设备内的流体内的化学成分的反应状态；以及响应于流体的压力的测量、流体的ph的测量、流体的温度的测量和/或流体的化学成分的反应状态的测量中的至少一个或者流体的压力的测量、流体的ph的测量、流体的温度的测量和/或流体的化学成分的反应状态的测量的组合，使用控制单元来控制流体流动设备内的流体的至少一个特性。
附图说明
57.现在将仅以示例的方式并参照附图来描述本发明的具体实现方式，在附图中：
58.图1是适用于rna生产的连续反应和过滤设备的示意图；
59.图2是适用于图1的设备的反应器和过滤模块的透视图；
60.图3是适用于图1的设备的井或批处理生物反应器模块的平面图；
61.图4是适用于图1的设备的反应通道形生物反应器模块的平面图；
62.图5a是适用于图1的设备的过滤模块的平面图；
63.图5b是图5a的过滤模块内的膜的图像；
64.图6a是过滤模块的一部分的图示，该过滤模块具有被配置用于适用于图1的设备的化学成分的离心力分离的区域；
65.图6b是过滤模块的一部分的图像，该过滤模块具有用于化学成分的离心力分离的区域；
66.图7是适用于本流体流动设备的垂直切向流动过滤(vtff)模块；
67.图8是图7的过滤模块的区域的放大图；
68.图9是螺旋切向流动过滤模块的平面图；
69.图10a是根据具体实现方式的过滤模块的部件；
70.图10b是图10a的过滤模块的另外的部件的示意图；
71.图10c是图10a和图10b的过滤模块的部件的另外的示意图；
72.图11a是形成为双层微通道tff的另外的过滤模块的平面图；
73.图11b是根据具体实现方式的过滤机构和过滤模块的示意图；
74.图12是通道流动生物反应器模块的示意图；
75.图13是用于计算流体流动生物反应器和过滤系统的设计的曲线图；
76.图14是反应器模块耦接至过滤模块以形成流体流动装置的示意图；
77.图15是tff模块的透视图；
78.图16是tff模块的通道尺寸的微观分析的图像；
79.图17是原型构建过程的概要的示意图；
80.图18a是根据具体实现方式的流体流动系统的示意图，该流体流动系统包括反应器模块、一系列传感器、反应状态监测布置和控制单元；
81.图18b是适合作为图18a的流体流动系统的一部分的反应状态监测布置的部件的示意图；
82.图18c是根据具体实现方式的形成图18a的流体流动系统的一部分的一系列传感器、反应状态监测布置和控制单元的示意图；
83.图19是图18的包括光谱仪布置的一部分的微流控流动系统的一部分的架构的示意图；
84.图20是控制系统的串行通信程序的示意图；
85.图21是rna产量与包括nacl、mgcl2、ntp等的各种反应物的比例之间的关系的图表；
86.图22是根据本发明的各方面的数据分析(rna产量与镁离子)和特定反应时间选择的图表；
87.图23a是速度分布分析结果模拟的示意图；
88.图23b是速度分析曲线图的曲线图；
89.图24是过滤模块内的切向流动过滤通道的速度的示意图；
90.图25a是生物反应器通道中的压降的图；
91.图25b是作为多步骤下降的压降的图；
92.图26a是用于制造流体流动反应器和过滤设备的掩模的照片；
93.图26b是连续微流控流动反应器掩模的照片；
94.图27是用kapton带密封的连续流动反应器的图像；
95.图28是使用两个亚克力板的完整设置的图像；
96.图29是3d打印的模具在使用后的图像；
97.图30a是与下游配制系统集成的本流动系统的示例实施方式的示意图的第一部分，该下游配制系统使用附接至常规填充和完成疫苗生产线的模块化流动反应器；
98.图30b是与下游配制系统集成的本流动系统的示例实施方式的示意图的第二部分，该下游配制系统使用附接至常规填充和完成疫苗生产线的模块化流动反应器；
99.图30c是与下游配制系统集成的本流动系统的示例实施方式的示意图的第三部分，该下游配制系统使用附接至常规填充和完成疫苗生产线的模块化流动反应器；
100.图30d是使用uv-vis光谱法评估的图30a至图30d的实施方式的流动反应器的输出
溶液的吸收率与波长的关系曲线的图对照使用常规批处理方案评估的图30a至图30d的实施方式的流动反应器的输出溶液的吸收率与波长的关系曲线的图；
101.图31是实验性的流体流动化学化合物合成平台的照片；
102.图32是python中光谱仪数据(强度与波长)的实时图；
103.图33是用于微流控流动反应器模块和连续过滤系统的具有不同浓度(a：25mm/l，b：50mm/l，c：75mm/l，d：100mm/l)的样本的图像；
104.图34是uv-vis光谱分析的曲线图；
105.图35是python中实时绘制ph值数据的图像；
106.图36是预测图的曲线图(左边是关于1mm dntp的反应，右边是关于4mm dntp的反应)；
107.图37示出了第一实验和第二实验的预测分布图的曲线图(上边是关于1mm dntp的反应，下边是关于4mm dntp的反应)；
108.图38是流体流动生物反应器和过滤的各种数据的汇总(左边是关于1mm dntp的反应，右边是关于4mm dntp logworth＝-log10(p值)的反应)；
109.图39是本系统的放大的流体流动反应器和设备的示意图；
110.图40a是python中吸光度数据和实时图(吸收率与波长)的源代码的图示；
111.图40b是python中实时绘制ph值数据的源代码的图示。
具体实施方式
112.微孔通道中的流体力学原理
113.微细加工的进步使得建造具有微米尺寸的微通道成为可能。由于微通道通常被集成到这些微系统中，因此确定微通道中的流体流动的特性对于更好地设计各种微流装置是很重要的。由于技术的限制，对多孔介质(特别地，可以用于合成rna疫苗制造的片上实验室设计的微孔介质)中流体行为的理解非常有限。在流体-流体界面不形成的意义上，多孔介质被认为被感兴趣的流体饱和，并且单一流体在孔隙空间中占优势。设dp为微粒大小，u为速度尺度。已经发现(1)适用于雷诺数高达1的情况，即：
[0114][0115]
多孔介质的渗透性是取决于孔隙大小和孔隙结构的特性。量纲分析表明，渗透率是孔隙率e和微粒直径dp的函数；每个都分别代表孔隙几何形状和孔隙大小。carman-kozeny关系根据经验将这些量联系起来，但是具有量纲正确性为：
[0116][0117]
微粒直径用米表示，渗透率的量纲为m2。在应用中，我们可能期望具有装置本身的长度尺度，比如说l，并且比率被限定为：
[0118][0119]
其被称为达西数(darcy number)。在许多应用中，微粒的直径约为几分之一毫米，
而装置的长度尺度约为一米或更长。式2可以被适当地表述为在da《《1、re《1的限度内适用。bahrami等人(m.bahrami，2006)开发了预测任意截面的微通道中的压降的通用模型。特征长度的选择是任意的选择，并且将不会影响最终的解决方案。根据bahrami等人的模型，在任意截面的微通道中，层状完全展开的流的压降可以从以下得到：
[0120][0121][0122]
其中ip*＝ip/a是微通道截面的特定极惯性动量，г＝4(w+h)是微通道截面周长，l是完全展开的长度，q是体积流率，ε＝矩形微通道的长宽比(宽度/高度)。
[0123]
已知体积流率q和截面面积a，根据以下计算雷诺数：
[0124][0125]
微小损失δpmin：与测量的压降关联的其他压力损失是入口损失、出口损失和弯道损失。这些损失通常是从宏观尺度上使用的传统关系中得到的。phillips(参考)表明，微小压力损失可以从以下得到：
[0126][0127]
其中a和a
t
分别是通道截面面积和连接管截面面积。kb是弯道的损失系数，kc和ke代表由于面积变化而产生的收缩和膨胀损失系数。phillips建议，对于90度的弯道，kb大约为1.2。假设通道和连接管的截面面积相等，kc和ke为最大可能值，与测量的压降相比，相对的关于测量的压降的微小损失可以忽略不计。hooman和merrikh(m.bahrami,2010)已经开发了针对多孔通道内的流动和压降的分析解决方案，如下所示：
[0128][0129]
h、l和w分别是多孔通道的深度、长度和宽度。
[0130]
在本研究中测试的样本中，截面的长宽比ε为0.5。因此，不考虑整个矩形截面，样本可以被建模为夹在两个平行板之间的多孔介质。
[0131]
选择合适的盒子取决于总的样本量、所需的处理时间和期望的最终样本量。使用下式来计算在指定时间内处理样本所需的膜面积：
[0132][0133]
其中，
[0134]
a＝膜面积(m2)
[0135]
v＝产生的滤液体积(升)
[0136]
j＝滤液流量(升/平方米/小时，lmh)
[0137]
t＝处理时间(小时)
[0138]
用于原型研究的流体流动模拟
[0139]
通道的高度和液体类型对微通道的性能有影响。计算流体动力学(cfd)fluent软件被用于模拟微通道。从cfd，对未完全展开和完全展开的区域的速度分布进行分析，以研究流体流动行为。液体的特性影响微通道内的流体流动。我们需要最小的运动粘度和低表面张力，这取决于选择正确的液体。
[0140]
流体流动在引导小规模装置与许多应用集成方面起着重要作用，原因是它们在化学和生物化学工程方面具有潜力。利用不同类型的液体和表面粗糙度的实验数据，回顾了单相流体流动的机理和基本原理。因此，在微观尺度上，液体特性如表面张力和粘度的影响是主要的。[nawi,m.n.m.,manaf,a.a.,arshad,m.r.,和sidek,o.(2013)，numerical simulation of the microchannel for the microfluidic based flow sensor，论文集
–
2012年ieee控制系统、计算和工程国际会议(2012ieee international conference on control system,computing and engineering)，iccsce 2012，第345页至第348页]。
[0141]
雷诺数是流体在通道中流动的惯性力和粘性力的比率(即，流体的动量与通道壁施加的摩擦力的比率)。低雷诺数流动是层流或分层流，其中流体流彼此平行流动并且仅通过对流和分子扩散进行混合。高雷诺数流动是湍流，其中流体的各种大小的“小包”表现出同时在空间和时间二者上随机的运动，导致整个通道的快速混合。层流与湍流之间的过渡通常发生在内部流动中re＝2000时[schulte,t.h.,bardell,r.l.,和weigl,b.h.(2002)，临床诊断学中的微流控技术_2002_临床化学学报(microfluidic-technologies-in-clinical-diagnostics_2002_clinica-chimica-acta.)，第321期，第1页至第10页]。
[0142]
虽然湍流场比层流场更复杂，但存在显著的二阶影响。描绘这样的条件下分析分布的时间依赖性演变的一维模型和二维模型已经得到了改进。共聚焦荧光显微镜实验和三维数值建模可以有助于确认对壁附近反应-扩散过程的定量描述[schulte,t.h.,bardell,r.l.,和weigl,b.h.(2002)，临床诊断学中的微流控技术_2002_临床化学学报(microfluidic-technologies-in-clinical-diagnostics_2002_clinica-chimica-acta.)，第321期，第1页至第10页]。
[0143]
传感器与流动系统的集成
[0144]
在研究中，应建立传感器集成的平台，以获得和监测整个rna转录过程的数据。gruber,p.[gruber,p.,marques,m.,szita,n.和mayr,t.(2017)，integration and application of optical chemical sensors in microbioreactors，芯片上的实验室(lab on a chip)，17(16)，第2693页至第2712页]提出了描述在流体流动装置中实现鲁棒的传感器集成的路径的流程图，这个图可以作为集成研究的指导。各种集成的平台系统已被设计和开发用于实时反应监测[wang,t.,kim,s.和an,j.(2017)，anovel cmos image sensor system for quantitative loop-mediated isothermal amplification assays to detect food-borne pathogens，微生物学方法期刊(journal of microbiological methods)，第133期，第1页至第7页]。在wang的方法中，互补金属氧化物半导体(cmos)技术在集成和检测方面显示出巨大的潜力。cmos图像传感器作为有效的反应和检测平台工作，
使其能够根据放大过程监测实时的光子变化。cmos图像传感器观察到了光子并将其转换成数字单位。此外，还进行了uv光谱研究、光学颜强度检测和ph值分析，以证明cmos的效率[wang,t.,devadhasan,j.,lee,d.和kim,s.(2016)，real-time dnaamplification and detection system based on a cmos image sensor，分析科学(analytical sciences)，32(6)，第653页至第658页]。l
ó
pez-huerta[l
ó
pez-huerta,f.,woo-garcia,r.,lara-castro,m.,estrada-l
ó
pez,j.和herrera-may,a.(2013)，an integrated isfet ph microsensor on a cmos standard process，传感器技术期刊(journal of sensor technology)，03(03)，第57页至第62页]已经提出了在cmos标准工艺中集成的isfet ph微传感器。整个系统被集成在1.12mm2的硅区域中；它在ph值水平为2至12的浓度范围内呈现59mv/ph的线性，使其成为生物或医疗应用的良好替代品。
[0145]
cmos是相关的选择，但考虑到成本和时间，它很难实现。更现实的是，每个传感器的集成方案已经被审查。对于ph传感器，已经发现了使用集成感测和致动的微流控内ph的实时反馈控制的研究[welch,d.和christen,j.(2014)，real-time feedback control of ph within microfluidics using integrated sensing and actuation，芯片上的实验室(lab on a chip)，14(6),第1191页]。该系统利用扩展栅极离子敏感场效应晶体管(isfet)以及集成的伪参考电极来监测流体流动反应室中的ph值。对于温度传感器，在反应室中心下方集成有蛇形温度传感器(线宽：50mm)和加热器(线宽：400mm)[sun,h.,olsen,t.,zhu,j.,tao,j.,ponnaiya,b.,amundson,s.,brenner,d.和lin,q.(2015)，abead-based microfluidic approach to integrated single-cell gene expression analysis by quantitative rt-pcr，英国皇家化学学会进展(rsc advances)，5(7)，第4886页至第4893页]。choi,k.,mudrik,j.和wheeler,a.(2015).[aguiding light:spectroscopy on digital microfluidic devices using in-plane optical fibre waveguides，分析和生物分析化学(analytical and bioanalytical chemistry)，407(24)，第7467页至第7475页]已经提出了一种用于平面内数字微流控光谱学的新方法。在这项技术中，定制的歧管将光纤与数字微流控装置对准，允许在装置的平面内进行光学测量，这为光学检测提供了思路。本发明的优选分析波长范围在190nm至1000nm之间。获得的峰值在260nm的区域中。
[0146]
方法
[0147]
连续流动合成和扩大
[0148]
图1示出了连续rna生产过程的示意图。如图1所示，流体流动设备包括第一生物反应器模块10、第一切向流动过滤(tff)模块11、第二生物反应器模块12和第二切向流动过滤(tff)模块13。模块10至13中的每一个经由各自的通道或导管互连。在第一反应器模块10处设置有多个流体输送输入端口14，以用于将各自的反应物引入第一生物反应器10中。每个端口14包括各自的注射泵15。第一tff包括各自的输入/入口端口16，第二生物反应器模块包括各自的入口/输入端口17，并且第二tff模块包括相应的输入/入口端口18。端口16至18中的每一个可以被设置有用于引入流体的各自相关联的泵或注射端口，以在压力下将流体流驱动到每个反应器的伸长反应通道24和每个相应模块内的伸长过滤通道25内。多个再循环通道19、20、21将模块10、11、12、13的各个流体流动区域(在各自的入口/出口端区域处或朝向各自的入口/出口端区域)互连，以提供反应物/试剂的流体连通和回流。图1的设备还包括传感器、反应状态监测装置、控制单元和如本文其他地方所述的其他相关联的电子和
执行器部件(未示出)，以便为制造包括生物和非生物物种的化学化合物提供完全自动化和连续的流体流动合成平台。在伸长反应通道24的出口端处的第一生物反应器10包括闸门23。闸门23被配置成基于分子大小和/或分子量从流体中过滤大分子量的化学成分如dna。然后，所需的经过滤的流体经由通道19再循环至反应器10的入口区域。这样，选定的试剂和反应物可以被循环，以提供连续或半连续的过程。
[0149]
参照图1和图2二者，图2示出了图1的流体系统的变体，其中与图1的伸长反应通道24相对比，反应器10包括反应井50。如参照图1所述，多个注射端口14耦接成与井50流体相通，以用于输送反应所需的化学化合物、试剂、溶剂等。过滤模块11、12可以包括一系列的提取端口51、22，使得能够从过滤模块中提取选定的物种、试剂、溶剂，并且也可以例如在端口22处收集最终产品，如完全加帽的rna。
[0150]
正如可以理解的那样，通道轮廓的具体细节、端口、闸门、入口、出口、泵和流体流动控制执行器的使用可以用本文所述的布置来实现。
[0151]
参照图39，参照图1和图2描述的多个反应物和过滤系统(并且通常被表示为板状单元10、11、12、13)可以连接在一起作为扩大的流体流动反应器和设备，以形成完全集成的模块化流体流动反应和过滤系统，以用于以足以用于评估和临床试验并最终生产的规模来制造基于rna的剂和预防性疫苗。特别地，适当的连接导管在各个板状单元10、11、12、13之间提供流体连通，使得每个单元的输出端(在输出端22处)可以结合以提供总产量。图39的集体系统可以包括单个控制单元、多个控制单元和各自的传感器和反应状态监测工具和单元，如本文参照图18a至图20所述的。随着本发明的多个流体装置的平行操作，基于rna的剂和预防疫苗的连续生产可以发生。通过这种扩展策略，人们可以达到目标市场所要求的规模的制造输出，目标市场可以是当地医院的集聚区，或者该单元可以附接至制造商现场处的常规填充和完成线。图20是用于arduino和python ide控制实用程序之间的串行通信程序的示意图。在可能的实施方式中，可以使用arduino板。在优选的实施方式中，使用工业边缘计算sbc(单板计算机)节点。
[0152]
以rna合成为例，在这个过程中，dna的片段被酶rna聚合酶复制到rna中。转录混合物由ntp(核苷三磷酸)、dna、mgcl2(与p2o
7-4
反应以产生沉淀，影响rna的生产率)、t7聚合酶(催化作用)组成，它们分别由注射泵注入第一生物反应器通道中。羟基萘酚蓝(hnb)被用作滴定mg
2+
离子的比指示剂。最初，hnb和mg
2+
离子结合成hnb-mg
2+
复合物。mg
2+
离子的减少导致颜从紫变为天蓝。混合物在第一反应器10中停留约6小时，在此期间，rna转录反应一直在进行，并且rna开始产生，并伴有焦磷酸镁沉淀(mg2p2o7)。除dna外，所有上述成分都流过具有大分子量(mw)截留膜的第一切向流动过滤(tff)模块11。dna经由再循环通道19被过滤回原来的入口端口14(2)，并被保留在第一反应器中，而其他成分则被过滤到下一级。
[0153]
在第一过滤模块之后，上述成分通过再循环进入入口端口14(4)中的t7聚合酶向下游渗透。然后m7g甲基转移酶(5’帽)被注入端口17并且流入第二反应器12和通道24，内容物在其中停留并反应2小时。渗透物进入具有中等分子量截留膜的第二tff单元13。在这个过滤阶段，未反应的ntp和5’帽被保留下来并(经由21和20)被再循环到生物反应器12和/或10中。最后，纯化的rna在出口22处被挤出。同时，其他成分如mg2ppi、水、盐被收集到另一个容器或端口51中，并且可选地被丢弃或继续处理。然后，输出(加帽的rna)可以经由另外的处理规程(本文中没有描述，但对于本领域技术人员来说是熟悉的)被处理，以产生所需的
疫苗。
[0154]
目的是实现连续合成和纯化，以获得rna物质并实现系统产量的增加。有必要经由部件14将原料添加到反应器中，以补偿所消耗的分子，以保持过程的连续反应，这可以通过调节执行器注射泵以及材料流动的反馈回路来实现。通过优化反应条件(如镁浓度、ph、温度、反应时间)，rna产量输出的大幅提高是可能的。
[0155]
基于集合的并行工程(sbce)方法
[0156]
精益产品开发方法已被选为开发设计的主要框架。精益产品开发方法是基于集合的并行工程(sbce)。sbce是如下过程：想要开发的产品被划分为不同的子系统，以允许针对子系统中的每一个并行开发可能的解决方案的集合。随着设计的发展，利用诸如模拟、原型设计、测试或其他获得的知识的工具，通过基于知识的决策来缩小每个子系统的解决方案的集合。遵循sbce方法，第一个基本步骤是将产品分为可以单独开发的不同子系统。考虑到需要开发的系统的概念设计，有四个主要的确定的过程，这四个主要的确定的过程可以被分为正好两个将要开发的功能：生物反应器和过滤过程。同时，该系统需要与如下控制系统集成，该控制系统能够控制来自泵的压力并在产品的关键部分中具有传感器以测量关键参数。在绘制了系统的概念设计图后，可以限定可以并行开发的不同子系统。表1示出了不同的子系统，具有简要描述和针对每个子系统限定的相应的创新水平。
[0157]
表1：流动系统的模块。这些模块可以根据目标剂的需要以任何需要的顺序适当地被组合。例如，在最后一个过滤模块之后，可以存在另外的反应器/混合步骤，以用于将rna物质配制成产品。
[0158]
[0159][0160]
子系统设计规范方法
[0161]
生物反应器
[0162]
关于生物反应器，已经开发了两种不同的设计。第一设计的灵感来自于化学中用于rna合成的常规批处理过程。该设计包括针对原料中的每一个的四个输入端14，这四个输入端14连接至通过允许足够的停留时间而发生反应的1ml主室。然后，通过在出口处释放微流控阀并在入口处引入新鲜试剂，可以选择性地对容器进行放气。这意味着该装置以连续(灌注)模式运行，与常规的批处理系统相当。一旦反应完成，产品就被释放到输出通道。传感器评估它是否可以继续进行下一步的处理或者被拒绝。图2和图3示出了生物反应器的设计。
[0163]
这种设计需要复杂的、协调良好的控制系统来控制与装置集成的阀。在停留时间结束后，产品需要被送入系统的其余部分。
[0164]
生物反应器的第二种设计是形状为蛇形流体导管的微流动反应器，其允许反应物的混合和目标产物的连续合成，如在wo 2019/193346 a1中所述，其细节通过引用并入本文。该实施方式通过控制流体流动来实现连续合成。在这个设计中，存在经由t型混合器连续馈送到流动反应器中的四个试剂输入端。反应条件和效果由进入流体导管的净流量和通过t型混合器的各个组分的流体速度控制。这些都是通过设置电脑控制的分配泵的分配速
率来控制的。在混合物在设定的停留时间内到达蛇形流动生物反应器的端部时，形成产品。在输出端，该装置的特征是：作为小的流体容纳井，暂时减缓流体流动，以获得用特定化学溶液的优选分析方法的在线测量，例如在线uv-vis光谱。通过提取信号的某些特征，在专门构建的软件中解析和分析来自光谱仪的信号，以通过与参考向量进行比较来确定是否确实已经形成了期望的产物。图4是蛇形流动生物反应器的示意图。
[0165]
过滤模块
[0166]
有两种类型的过滤：直接流动过滤(dff)和切向流动过滤(tff)。dff的主流与过滤器垂直，而tff的流与过滤器平行。dff的堵塞风险要高得多，事实证明，在增加过滤量的同时，tff的滤液流量比dff更高。此外，tff的典型应用是生物分子的浓缩、渗滤和分馏以及细胞的净化和去除；这些应用与本项目中出现的应用类似。换言之，对于这个项目的应用，tff是最有效的选择，因此，tff是被选择的过滤类型。
[0167]
对于过滤模块，选择tff方法作为模型。在研究文献和商业实践中，已经提出了几个设计方案。对于本发明，已经考虑了几个其他因素，例如对于这个子系统，已经考虑了可制造性和作为模块与整个系统集成的能力。第一过滤模块设计包括在相同高度处具有两个通道的蛇形路径，在装置上特意形成图案的分离特征用作过滤膜。x.chen等人(2007年)[microfluidic chip for blood cell separation and collection based on crossflow filtration，传感器和执行器(sensors and actuator)b 130(2008)(第216页至第221页)，中国]，在过去已经使用了tff过滤器设计，与其他解决方案相比，tff过滤器设计快速且可重复地分离生物细胞并且成本较低。
[0168]
在本发明中，使用了特意选择的膜，该膜的尺寸适于分离核酸合成后通常存在于溶液中的生物分子。图5a和图5b示出了过滤模块，包括蛇形微通道内的过滤特征。这些通道的尺寸和长度被特意设计成允许在滤液和滞留物流中选择正确的生物分子。该模块的制造采用微工程技术，包括玻璃或硅衬底的光刻和深度反应蚀刻。这些技术是很好理解的，在工业上是可用的，符合药物法规，并且对于大量装置生产是低成本的。
[0169]
第二过滤模块设计不需要任何过滤膜。它利用离心力的原理工作，如果流体以一定速度具有弯曲轨迹，则离心力会使一些微粒比其他微粒运动得更快。因此，具有分成两个不同通道的一个弯曲微通道，有可能使不同大小的微粒进入不同的出口通道[blatter,c.,jurischka,r.,tahhan,i.,schoth,a.,kerth,p.,menz,w.(2005)，microfluidic blood/plasma separation unit based on microchannel bend structures，第三届国际ieee embs年会论文集(proceedings of the 3rd annual international ieee embs)，夏威夷]。值得一提的是，这种过滤方法仅在适当的条件下(例如流体速度超过1[m/s])有效。在合适的条件下，这种分离技术可以获得高达90％的效率，并且由于没有膜，因此可以大大简化过滤过程。图6a和图6b示出了这种设计解决方案的cad设计。
[0170]
第三种设计非常类似于上述第一种设计模块。主要区别在于流体路径是螺旋形的，如在wo 2019/193346 a1中所描述的，其细节通过引用合并在本文中。如z.geng等人(2012)[continuous blood separation utilizing spiral filtration microchannel with gradually varied width and micro-pillar array，传感器和执行器(sensors and actuator)b 180(2013)(第122页至第129页)，中国]描述的，这种设计给常规的蛇形过滤模块增加了离心效应，如前所述。这种离心效应提高了分离效率并且降低了堵塞的风险。图9
至图10c示出了该设计。
[0171]
过滤模块的第四种设计使用夹在两股流体流之间的膜。x.li等人(2014)[continuous-flow microfluidic blood cell sorting for unprocessed whole blood using surface-micromachined microfiltration membranes，英国皇家化学学会进展(royal society of chemistry)]已经将过滤膜用于血细胞分离。然而，在本发明中，过滤模块使用两个微通道层，它们将过滤膜夹在中间以产生滤液流和滞留物流，滞留物流再循环回到反应器模块，而滤液流继续在输出端处被收集并根据处理要求被引导至下游模块。流体来自反应器，通过顶层通道进入tff过程。由于压力差，流体中的一些分子穿过膜并进入底层通道，然而太大而不能穿过膜的分子留在顶层通道上。这种设计解决方案提供了良好的效率，并且最重要的是，它在可制造性方面提供了新的视角。图11a和图11b示出了这种解决方案的设计。
[0172]
上述过滤模块的四个实施方式依赖于对流动流之间的压力差的控制和所使用的分离方法。然而，在第五实施方式中，该装置结合了数字微流控技术和数字宏观流体技术以及分子生物学中常用的方案来分离和提取核酸，特别是dna。这些方案有两种。一种是基于电荷的，另一种是将磁珠附着在dna或rna上以进行纯化。例如，在本发明中，附着于dna质粒的磁珠如invitrogen dna结合珠(赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific))可以使用数字加密磁场被保持在反应容器中，如在图2中的本发明的生物反应器设计的情况下，此时容器被排放并用新溶液进行更新，或者附着于dna质粒的磁珠如invitrogen dna结合珠被强制通过上述过滤模块设计中的过滤膜，并通过滞留物通道按路线返回到反应模块中。
[0173]
示例实施方式
[0174]
虽然所有的设计都是用于基于核酸的疗法的制造的流动系统的多种配置中的模块，但是蛇形过滤模块由于其容易和低成本的制备而代表了优选示例。本文将进一步说明制造用于测试该装置的原型的整个过程。
[0175]
图7和图8示出了流优选过滤模块，该流优选过滤模块优选地包括第一板状层30、第二板状层31，第一板状层30和第二板状层31的主面彼此相对并且将膜36夹在它们之间，以提供薄片结构。板30、31中的每一个包括蛇形通道，所述蛇形通道具有直段34和弯段或曲段35，以形成与中间膜36直接接触并至少部分地由中间膜36限定的相应流体流动通道37、38。收集、输入或缓冲容器33被设置在第一通道37或第二通道38中任一个的相应纵向端部处或朝向所述端部。因此，流体能够流过上板的通道37，流体中分子大小较小的选定化学成分能够通过膜36扩散到第二板31的邻近流体流动通道38中。因此，可以理解，图7和图8的tff模块被配置成用于分离渗透物和滞留物，其区别在于微粒大小(微粒直径)和/或分子量。
[0176]
用于研究装置的流体流动模拟方法
[0177]
如表2所示，需要两种不同尺寸的生物反应器通道。计算流体动力学(cfd)软件已经被用于分析微通道中的假设数据。微通道需要稳态流速。
[0178]
表2不同尺寸的生物反应器通道的计算结果
[0179][0180]
fluent：fluent是计算流体动力学(cfd)软件，该软件有助于解决流体流动问题。它使用有限体积法来求解流体的控制方程并提供许多不同的物理模型，如层流或湍流、粘性或非粘性、可压缩或不可压缩。几何图形和网格生成正在进行gambit，gambit是与fluent捆绑在一起的预处理器。
[0181]
通过以下这些步骤可以得到解决方案：几何形状；网格；设置；求解；结果。以二维cad设计来表示通道。之后，材料属性和边界条件被设置。最后，域必须被网格化。fluent对问题进行收敛，直到满足收敛极限或达到规定的迭代次数。
[0182]
a)几何形状
[0183]
几何形状由壁、入口和出口边界组成，其在图12中被示出。
[0184]
b)网格
[0185]
粗细网格类型可用。网格密度根据细化因子而变化，如表3所示。
[0186]
表3粗细网格类型
[0187][0188]
使用计算流体动力学进行流体流动建模：
[0189]
关于雷诺数(re＝0.0269)，选择了层流。需要选择空气和水-液体作为材料。可以指定以下材料属性：密度和粘度。
[0190]
如表4所示，在fluent中指定了以下边界条件。
[0191]
表4在fluent中指定的边界条件
[0192]
[0193]
c)求解
[0194]
将网格与物理属性和指定的初始条件一起导出到fluent。当解收敛或达到指定的迭代次数时，fluent导出数据。如表5所示，总的流动时间是14400秒，也就是4小时，所以cfd软件每60秒记录需要重复240次的数据，然后cfd软件分析x和y方向的速度、能量和连续性。最后，在38次迭代之后，结果已经收敛，如图13所示。
[0195]
表5 fluent的输入和输出数据
[0196][0197]
原型构建
[0198]
为了构建原型，遵循了不同的步骤。首先创建出模具，然后从模具中铸造出芯片。不同的子系统被分开建造以便测试每个设计。将在每个子系统上进行实验以验证设计。已经对不同版本的模具进行了编辑。设计演变如图14所示。
[0199]
在对每个模具进行实验后，在两个版本之间做了一些改进。
[0200]
·
两个模板已经被重新组合成一个模板，使所有准备芯片制造过程更容易。
[0201]
·
通道的截面面积已经从0.4mm
×
0.8mm增加到0.5mm
×
1mm，避免了在测试芯片时通道壁坍塌。
[0202]
·
在通道之间(0.5mm至1mm)以及在模具的边界和特征之间增加了额外的空间，以提高芯片的质量并避免在从模具中移除pdms掩模时发生任何意外。
[0203]
·
最后，在模具的边缘增加了一些壁，以提高铸造时整个pdms芯片的质量。
[0204]
关于竖直tff装置，顶层和底层已经分别被编辑，以创建将与中间的过滤膜密封在一起的两个不同的层。图15示出了两层的设计。表6说明了这两种设计的不同特征。
[0205]
表6两种设计的特征说明
[0206][0207]
软光刻技术和sla3d打印模具
[0208]
微流控芯片需要精密、准确的方法和技术，以使反应或过滤如预期工作。最常见的用于微流控芯片的方法是软光刻技术。在这种情况下，软光刻技术包括创建pdms将从其铸造的模具[kamei,k.ichiro,mashimo,y.,koyama,y.,fockenberg,c.,nakashima,m.,nakajima,m.,
…
chen,y.(2015)，3d printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients，生物医学微设备(biomedical microdevices)]。该模具是根据所需部件的cad设计3d打印出来的。尽管不同的技术可以用于3d打印，但在本项目的情况下选择了立体光刻技术。
[0209]
设计了不同的模具后，零件被送去使用sla进行3d打印。sla印刷允许在大约24小时内构建精度为10μm的复杂形状。关于模具所需的利用率以及不同形状和特征，在sla机器上设置了最佳分辨率以优化打印的分辨率和精度。通过显微镜对第一版本的掩模进行了分析，以比较cad文件和3d打印零件之间的大小。图16示出了对通道尺寸的两种微观分析。
[0210]
表7通道尺寸的显微镜分析值
[0211]
测量值cad尺寸l1：通道之间的距离437μm400μml2：90
°
弯道处的通道宽度902μm800μml3：规则部分中的通道宽度902μm800μml4：规则部分中的通道宽度910μm800μml5：通道之间的距离440μm400μm
[0212]
最后，模具已经用两种不同的材料进行了印刷。这两种材料都是光聚合物树脂，其中一种材料是高温树脂。这两种材料的主要区别是热变形前的最高温度。第一种材料可以达到50℃，而第二种材料可以高达250℃。
[0213]
过滤膜的选择
[0214]
特定过滤膜的选择分两步进行。第一步骤包括为两个过滤阶段到两种不同膜的分子截留尺寸。事实上，每个过滤阶段都在处理不同分子量的不同分子。如本文的概念性过程所示，由于它们的高成本，一些试剂的分子需要被过滤并被循环回它们各自的生物反应器。表8详细列出了不同的分子及其大小或分子量。
[0215]
表8分子量信息
[0216][0217]
关于两个竖直tff阶段，第一个竖直tff是处理t7聚合酶，而第二个竖直tff是处理m7g+甲基转移酶。考虑到不同的分子大小，选择的过滤膜需要具有比需要保留的分子小三倍的分子截留尺寸，在这种情况下，它是rna分子[通用电气(general electric)，2014]。此外，过滤器需要足够大，以便让回收分子通过它。给定所有这些信息，每个膜的分子截留尺寸分配如下：
[0218]
·
竖直tff 1
→
分子量截留膜为300kda
[0219]
·
竖直tff 1
→
分子量截留膜为500kda
[0220]
该过程的第二步骤是选择合适的膜供应商。因此，由于时间限制，选择了synder过滤公司的1m
×
1m平板膜。已经订购了三种不同孔径的膜：300kda、400kda和500kda，以便进行不同的测试和实验，并且分析每种膜的过滤效果。
[0221]
pdms掩模和铸造
[0222]
随着模具的打印和准备，聚二甲基硅氧烷(pdms)微流控可以从它来铸造。用于制造pdms芯片的产品是sylgard 184硅酮弹性体。该产品由两种要素组成，一种是硅酮弹性体部件，另一种是负责弹性体分子交联的固化剂，该固化剂将固化弹性体，同时保持铸造性能。然而，在模具上方应用pdms之前，需要做一些准备工作。表9示出了固化温度和它们的固化时间。
[0223]
·
在烧杯中将硅酮弹性体与质量比为10:1(硅酮/固化剂)的固化剂混合10分钟。
[0224]
·
混合后，需要借助干燥器去除混合中的气泡。重复此操作，直到所有的气泡消失。
[0225]
·
如果还有小气泡，让烧杯静置。气泡会自己破裂。
[0226]
·
混合物准备好后，将其施加在3d打印模具上，并且让它静置10至20分钟，将具有
pdms的掩膜放在烘箱中的顶部上，或让它在环境温度下静置。
[0227]
·
表
[0228]
表9固化温度和时间
[0229]
固化温度固化时间22℃48小时60℃5小时100℃35分钟125℃20分钟150℃10分钟
[0230]
已经测试了不同的温度以比较pdms固化性能和方面。然而，在这个过程中使用的第一模具不能承受高温。这就是为什么也在一周内测试了环境温度固化。最后，由于pdms掩膜上铸造有不同的特征，这个掩膜需要在敞开的一侧上被密封。已经使用了两种不同的方法来密封掩膜，以允许不同的测试结果(图17是创建连续流动生物反应器系统的原型构建过程的不同步骤的总结)：
[0231]
·
第一种方法是用另一层平坦的pdms密封pdms掩模。这种方法允许增加整个掩膜的额外厚度，并有助于管子及其配件的集成。
[0232]
·
第二种方法是用kapton胶带在开口侧上密封pdms掩膜。这种方法允许pdms掩模的特征和胶带之间的完美密封。然而，随着掩膜的厚度减小，管子和配件的集成将更加复杂。
[0233]
感测方法
[0234]
结合连续流动微流控系统和反应的特征设计了主要感测系统。首先，微流控芯片的感测系统受到芯片尺寸和需要检测的因素的特性的限制。此外，选择合适的传感器以获得芯片的准确和实时的检测结果是另一个关键点。微工厂的感测系统包括光谱仪、ph传感器和压力控制器及传感器。l.zhu(2005)[nuno miguel matos pires(2014)和kihwan choi(2015)]讨论了光谱仪背后的理论。yung-shin sun(2016)也对压力控制器和传感器背后的理论进行了探索。
[0235]
材料选择
[0236]
a)光谱仪
[0237]
光谱仪(usb2000+微型光纤光谱仪，海洋光学公司(ocean optics inc),英国)可以每秒存储1000个全光谱，其检测范围为从190nm至1100nm波长。此外，要使用官方软件，主要是根据感测系统的特性，用python中的开源包编程。这种光谱仪适用于监测连续反应。
[0238]
b)ph计
[0239]
ph计(hi-1093b ph电极，汉纳仪器有限公司(hanna instruments ltd),英国贝德福德郡)的测量范围是0到13。为了将ph计与微流控芯片集成在一起，由于设计规格的原因，ph计的尺寸受到限制。微流控芯片上测量单元的直径为5mm2，而ph计的主体的直径为3mm。
[0240]
c)压力控制器和传感器
[0241]
微流控芯片的cfd分析表明，生物反应器和tff部分的压力为0.27bar。压力传感器(mps微流控高精度压力传感器，elveflow，法国巴黎)可以提供5个测量范围，从70mbar到7bar。它还允许检测7.5μl的超小内部体积，这可以适用于0.5ml体积的微流控芯片。该传感
器的流速调节灵敏且响应迅速，所以它适合于实时监测流速的微小变化。配套的传感器读取器(sensor reader，elveflow，法国巴黎)可以提供高速能力并且很容易集成到芯片中，这使得测量简单可行。
[0242]
d)压力供应器
[0243]
注射泵(c3657 c系列注射泵，tricontinent,美国加利福尼亚州)被用作压力供应器，以将反应物材料供给到微流控芯片中。泵的冲程速度为每冲程1.2秒至100分钟，泵的分辨率为标准模式下3000步和高分辨率模式下24,000步。该系统的反应时间为4至6小时。同时，这些注射泵可以在微流控系统中提供稳定的流速。用于注射反应组分的5个入口的压力可以控制反应物的比例，以实现rna疫苗的经济且有效的产量。
[0244]
方法
[0245]
需要监测的反应的关键参数是rna和mg2+浓度、反应的ph值和温度。同时，需要控制入口压力，以便获得适当比例的rna产量，并在适当的反应时间内调节连续流动通道中混合溶液的流速。微流控芯片上有3个检测点，两个点用于rna和mg2+的定量，另一个点用于ph值测量。此外，压力传感器被制造在芯片外部。mg2+和rna的浓度水平变化可以用来检测反应速率。将吸光度转换为浓度的方法是实现rna和mg2+的定量的常用方法。在260nm处的紫外吸光度测量是rna定量的金标准，mg2+的定量可以通过680nm处的吸光度测量来获得。rna和mg2+的吸光度测量值可以使用比尔-朗伯定律(beer-lambert law)被转换成浓度。在设计中，pdms被用来制作生物反应器，这是足够透明的。这使得有效的rna检测成为可能。
[0246]
在反应中，相应的耐热dna聚合酶是ph值的主要来源。ph值为8.3至9.0时，系统中的结果最佳。此外，提高反应中的ph值有助于稳定dna模板并增强转录结果。重组酶的活性受试验的ph值的显著影响。对于集成的设备，arduino微控制器(arduino uno rev3，arduino，英国)已经被用作数据收集的核心。
[0247]
综合实验平台
[0248]
图18a至图18c中示出了本流体流动反应系统的示意图。该系统包括多个传感器，所述多个传感器适于测量流体流动系统中流动的流体的各种特性，包括压力、温度、ph值、流速、流量等。系统中还包括多个阀、注射端口、泵(特别地，注射泵)、闸门等，以控制设备内流体组分的流动路径。例如，流体的组分可以从生物反应器和/或过滤模块的纵向端部处的出口端口再循环，以根据需要返回到上游生物反应器和/或过滤模块的入口端口。该系统还包括控制单元，该控制单元通常包括cpu、微处理器或其他合适的电子处理器装置。根据具体的实施方式，处理器被集成到pcb或plc中。控制单元设置有用户接口、感测数据存储工具、软件、视觉显示装置、通信端口和/或模块、至少一个模数转换器和/或数据源库。这些组件可以由控制单元与传感器、注射端口、泵、阀等结合使用，以连续和自动控制流体流动系统内的流体流动。因此，提供了连续的反应器系统，该反应器系统用于试剂的连续输入以使实现所需反应物产物的连续输出。本系统的优点是：可以对试剂、溶剂等进行再循环和再利用，以使浪费最小化并使效率最大化。一旦设施准备就绪，将设计它们的布局并将建立实验环境。必要时，pdms芯片应该被固定并由夹具夹住。然后，其他仪器的位置也相应地被确定。
[0249]
开始，4个注射泵被用来分别向4个输入容器施加压力。管道和配件一般用于将小体积的样本输送至pdms芯片。另一个泵将连接至第二容器，第二容器位于第二生物反应器的起始点(第一tff的端部)处，使得可以注射m7g甲基转移酶和调节芯片中的压力，使用带
有反馈回路的压力传感器将显著增加流量控制的响应性。压力传感器被考虑在通道的入口和出口处进行测量。目标是在保持注射泵工作的同时，仍能确保装置中的压力恒定。
[0250]
为了实现浓度检测，uv/vis光应该通过检测室，在那里是第一生物反应器(蛇形通道)的端部处，通过光纤被传输。与特定波长需求匹配的两个微型光纤被彼此垂直地安装：连接至光源的源光纤和连接至微型光谱仪的收集光纤。在连续的生物反应期间，计划将ph传感器放入缓冲液中以测量ph值，而温度传感器可以被放置在板上，另一侧上有加热器以调节温度。ph传感器和温度传感器都配备有可以与arduino连接的bnc连接器。因此，可以从这些传感器获得数据。
[0251]
数据获取和监测
[0252]
光谱仪数据
[0253]
朗伯-比尔定律(lambert-beer law)描述了分析物浓度与特定波长的光吸光度之间的线性关系：
[0254][0255]
其中，i0是光源的初始强度，i1是通过样本后的光强度，∈表示波长相关的摩尔吸光系数，单位为m-1
cm-1
，l是路径长度，c是分析物浓度。
[0256]
因此，预期的光谱仪数据正是吸收光谱。ocean optics光谱仪已经提供了一种简单的方法来从python访问数据。这就是python-seabreeze包，它包装了seabreeze库来与光谱仪进行通信。它提供了ocean optics的usb接口的完整工作和测试参考实现，这意味着可以使用python读取和监测光谱仪数据。python与光谱仪之间的连接如图19所示。
[0257]
一旦ph传感器通过bnc连接器与arduino连接，就可以获得传感器数据，并且可以在串行监视器上检查实时数据。这方面的代码在图19中示出。同样的机制也用于获得温度传感器数据。进行了五个全因素实验，重点是不同比例的试剂以及反应时间和镁离子比例的影响。实验是基于500μl体积的分批进料系统进行的。背景实验数据在下面被示出。从数据中可以得出几个结论。图21示出了来自10mm ntp、10mm nacl、75mm mgcl2与乙酸离子的混合物的最大产量，约为900mm rna产量，这可以被视为最佳组合。rna产量的最佳反应时间如图22所示。当mg(oac)2的比例约为80mmol时，rna产量可以达到最高水平。四个小时的反应之后，rna产量在1800mm左右达到稳定。反应条件的最佳组合取决于四个主要因素：mgcl2、nacl和ntp的比例以及反应时间。对于另外的实验，需要监测mgcl2、nacl和ntp的比例，使其保持在一定水平，以获得最大的rna产量。帝国理工学院和克兰菲尔德大学的实验中最显著的区别是反应系统的设计。出于制造考虑，连续跟随系统被设计用于生物反应器过程，而不是分批进料反应系统。为了测试连续流动系统，实验是基于沙托克集团(shattock group)在帝国理工学院进行的先前实验而设计的。
[0258]
选择四个因素的三个水平(表10)来测试连续流动系统中rna产量的最佳比例。所选择的因素是指分批进料系统实验的结果。另外，由于循环使用的原因，dna和t7聚合酶的值是相同的。考虑到这些因素，新的实验设计如表11所示。该实验旨在到rna产量与四个因素之间的关系，以标识反应的趋势。
[0259]
表10针对流动合成实验选择的因素和水平。
[0260][0261]
表11针对流动合成实验的实验设计表。
[0262][0263]
结果和讨论
[0264]
流体力学和cfd分析
[0265]
将合适的控制方程应用于生物反应器和tff部分中的流体力学研究，以计算在稳态流动条件下具有恒定流体速度和合适压力梯度的滤液体积。式(6)已经被用于预测微通道中的压降。对特征长度的选择是任意选择，并且将不会影响最终解决方案，如表12和表13所示。
[0266]
表12不同通道下的流体特性。所有的测量都是在宽度(μm)为1000、高度(μm)为500、粘度(cpa)为3.5和密度(g/cm3)为1.06的条件下进行的。
[0267][0268]
表13不同流速下的流体特性。所有的测量都是在宽度(μm)为1000、高度(μm)为500、粘度(cpa)为3.5和密度(g/cm3)为1.06的条件下进行的。
[0269][0270][0271]
与测量的压降相关联的其他压力损失是入口和出口的弯道损失。可以在表14中获
得不同数量的弯道内的弯道压力损失。
[0272]
表14关于不同数量的弯道的弯道压力损失百分比计算
[0273][0274]
tff部分的流体力学研究
[0275]
cerman-kozeny关系被用来获得渗透率常数，以在合适的边界条件下求解通过微孔通道的流体参数。由于表15中输入微粒尺寸的变化，此处采用了不同的微粒直径和孔径。
[0276]
表15针对不同微粒直径和孔径的渗透常数
[0277][0278]
几何形状的压降可以通过式10来预测，该式的局限性在于，如果测量单位为微米，则它会产生数学误差。如表16中所示的是微孔通道中长度上的压降。
[0279][0280]
其中，
[0281]
μ＝动态粘度
[0282]
q＝流速
[0283]
h＝通道的高度/深度
[0284]
k＝渗透性
[0285]
表16不同流速下微孔通道中长度上的压力损失
[0286]
[0287][0288]
本研究中得到的结果只是预测，它取决于几何形状、流体条件和边界条件。根据pall corporation文章中的膜选择参数，可以估计出滤液体积，这在表17中被给出。
[0289]
表17不同过滤器长度区域的滤液体积预测
[0290][0291]
计算流体动力学分析
[0292]
生物反应器通道中的速度分布
[0293]
如图23a和图23b所示，x方向的速度穿过整个生物反应器通道。有两种不同的颜显示相同的速度，其在0.0001ms^-1和0.0002ms^-1之间，原因是黄表示正方向，绿表示负方向。在开始时，图23b示出速度增加，因为最初的泵提供了更高的压力，然后下降到约0.00033ms^-1的恒定速度，这比预测的结果高大约2倍。
[0294]
切向流动过滤通道
[0295]
图24示出了切向流动过滤通道中的速度。颜表明，微通道中的不同速度在0.0001327ms^-1和0.0001858ms^-1之间，这与入口速度接近。此外，表18中的数据表明，出
口速度从0.000145ms^-1略微下降到0.000138ms^-1，正如预期的那样。
[0296]
表18速度大小
[0297][0298]
生物反应器中的等压线
[0299]
图25示出了生物反应器通道中的压降。颜代表不同的压力值。图25b表明，由于生物反应器通道中有许多弯道，因此压力下降。这些不同结果已经在设计演变中得到考虑。
[0300]
实验结果
[0301]
pdms掩模测试
[0302]
生物反应器
[0303]
由于通过目前的工作已经实现了不同版本的模具，因此结果的演变已经被观察到并且将被说明。
[0304]
a)第一模具生成
[0305]
首先，两个生物反应器的第一版本二者都已经被测试。对不同的密封选项、kapton带和第二pdms层已经进行了试验，并提取了结果。两个反应器都在35℃下固化了超过两天。首先用另一个平坦的pdms层来密封这两个反应器。由于注射器，绿水已经被引入到每个掩模的多个入口中的一个入口。图26a和图26b显示了关于每个掩模的流体行为的第一结果。这两张图片显示，在批处理生物反应器中，当绿水被引入到掩模中时，水在反应器的中间形成了轮廓。这已经被如下事实所解释：反应器的中间在固化期间已经坍塌，如在图26a的蓝部分可以看到的。此外，图26b显示，绿的水样已经通过掩模的t形接头，并遵循主通道路径。然而，样本已经避开了一些区域。这可以通过通道壁的大小来解释，通道壁在固化过程期间无法承受压力并坍塌。
[0306]
其次，对用kapton带密封的连续流动反应器进行了测试。图27显示了新装置内的流体行为。流体(深绿)正确地遵循路径。密封的效果比以前的好。然而，由于通道的大小，固化再次不能正常进行，并且掩模的某些部分不能从模具上正常剥离，从而在掩模中产生一些缺陷区域。
[0307]
根据对不同测试的所有观察，设计已被改变。此外，已经决定创建如下平台，在该平台中，可以将pdms掩模放置在两个丙烯酸板之间，从而增加两个pdms层之间的压力，因此，避免在测试掩模时通道坍塌。这两个丙烯酸板还允许将配件和管道连接至芯片。
[0308]
图28显示，kapton密封掩模已经被放置在两块板之间，并且已经与管道、配件和一些感测仪器连接，以允许进行首次ph以及吸光度测试和测量。
[0309]
b)第二模具生成
[0310]
使用耐高温材料来打印第二模具生成，在70℃的固化温度下铸造掩模4个小时。如图29所示，模具在使用后，与模具直接接触的侧已经与模具接合。pdms掩模的小部分无法从
掩模剥离和移除。特别是在通道之间，pdms的薄层粘附在掩模上。虽然固化工作正常，但掩模从模具上剥离已经失败。在尝试用异丙醇尽可能多地清洁模具之后，给出了另一个试验，固化温度为100℃，持续35分钟。不幸的是，同样的问题也发生了。对这样的问题的解释是，来自3d打印机的耐高温材料已经与pdms层接合，pdms层与该耐高温材料直接接触。壁也可能对破坏整个掩模的固化均匀性产生影响。
[0311]
竖直流动过滤模块
[0312]
使用耐高温材料打印了仅一个版本的竖直tff模具。对于生物反应器掩模，也遵循同样的过程，并将倒入箔纸容器中的pdms样本与两个掩模一起放置在烘箱中，以便比较该过程的不同方面和结果。图30a和图30b显示了掩模的方面以及在烘箱中固化的样本。对于生物反应器掩模，与模具接触的pdms已经与模具接合在一起。当将pdms从模具剥离时，掩模已经破裂和破碎，如图30a所示。然而，在箔纸中固化的样本已经固化，没有任何缺陷，并且在将样本从箔剥离时没有发生任何事情。此外，如图30b所示，样本已经完美地铸造出箔的形状。
[0313]
根据这些不同的观察，可以做出一些分析，结果发现：
[0314]
·
当箔中的样本起作用时，化学和方案不会受到质疑。
[0315]
·
同样的默认情况在不同的掩模上已经发生了几次。因此，高温材料对pdms掩模铸造有负面影响，因此不应该用于这样的实验。
[0316]
·
应该保留用于第一次实验的第一材料，固化参数应该被设置在环境温度下固化48小时，以使pdms掩模正常铸造，并且避免模具出现任何热变形。
[0317]
尽管有这些结果，但还是创建了新的平台，如图31所示。
[0318]
基于集成的实验设计，已经在实验室中收集了所有设施，并搭建了实验平台以验证该系统的有效性。在实验室里构建的实验平台如图31所示，pdms芯片由夹具固定和夹紧，并通过管道和配件连接泵和芯片。两根光纤彼此垂直地安装：源光纤连接至光源，收集光纤连接至微型光谱仪(ocean optics usb2000+)。
[0319]
吸光度测量和数字输出
[0320]
精确的吸光度测量
[0321]
为了进行精确的吸光度测量，需要设置基线。首先，在没有样本的情况下记录背景辐射源的光谱。第二，通过在吸收路径中添加样本来重复实验。第三，从第二光谱中减去第一光谱，得到该样本的干净的吸收光谱。为了消除噪声影响，应该从样本和参考光谱二者中减去背景光谱。因此，式(9)应该变成：
[0322][0323]
其中：i
sample
是通过样本后的光强度，ib是在光源关闭或被遮挡且没有样本的情况下由光谱仪记录的背景光强度。i
ref
是参考光强度。
[0324]
uv-vis数据分析
[0325]
通过python-seabreeze api，可以很容易地从uv-vis光谱仪获得实时数据，并绘制强度与波长的关系的图。如图32所示，当波长在580nm左右时，光强度达到峰值。为了验证不同浓度下吸光度与波长之间的关系，使用了不同浓度的维生素b12溶液，其分别为a
(25mm/l)、b(50mm/l)、c(75mm/l)、d(100mm/l)，参见图33。uv-vis光谱结果如图34所示，吸光度随着样本浓度的增加而增加，并且吸光度在550nm的波长处达到最大值。
[0326]
ph传感器校准和数字输出
[0327]
ph传感器校准
[0328]
为了确保准确性，首次使用的ph探测器需要被校准。两个标准的缓冲溶液被用来校准ph传感器，它们分别为4.0和7.0。按照dfrobot提供的校准步骤，校准已经被完成。
[0329]
实时的ph值图
[0330]
下一步是用酸性溶液和碱性溶液测试ph传感器的有效性。图35中的结果显示，实时图的动态变化跟随ph值的变化，这证明了它的有效性。
[0331]
讨论
[0332]
关键结果评估
[0333]
所获得的工作和结果是实现片上实验室技术以实现最大rna输出的连续流动反应的有效尝试。应用sbce方法可以允许构建从项目开始到结束都遵循的完整的设计框架。装置的模块化设计具有划分的功能子系统使得能够包含用于混合、反应、过滤和纯化单元操作的不同创新解决方案。图30a至图30c显示了包括用于配制的下游模块的集成系统的示意图。特别地，图30a至图30c是本流动系统的示例实施方式的图示，本流动系统与使用模块化流动反应器(模块2)的下游配制系统(例如，wo 2013/050764和m.jreissat，2016，“anovel flow system for the concurrent product and process design of emulsion-based formulations”，伦敦布鲁内尔大学(brunel university london))和集成的uv-vis探测器集成在一起，并且本流动系统附接至常规填充和完成疫苗生产线。
[0334]
图30d示出了该装置的合成性能，其是图30a至图30d的实施方式的流动反应器的输出溶液的吸光度与波长的关系的曲线图。图40a是python中吸光度数据和实时图(吸光度与波长的关系)的源代码的图示，图40b是python中实时图ph数据的源代码的图示。
[0335]
使用uv-vis光谱与常规批处理方案的关系的曲线图对产物进行评估，其中用uv-vis光谱与常规批处理方案的关系的曲线图对流动反应器的输出溶液进行评估。通过图中更高的峰值指示更高水平的rna浓度，可以设想本方法与批处理方案相比具有显著更高的生产率。图30d所示的uv-vis光谱对使用常规批处理方案获得的rna物质和使用本发明的连续流动方案获得的rna物质进行了比较。与批处理方案相比，流动方案的更高峰值对应于溶液中存在的核酸的更高浓度。虚线对应于已知浓度rna的样本，并且虚线被包括以帮助比较在批处理方案中获得的样本和在流动方案中获得的样本。
[0336]
已经针对该反应器开发了两种不同的设计解决方案，其允许将rna制造从大量的手动批处理过程(常规rna合成)改变为连续流动形式。事实上，本发明的连续流动反应器是创新的并被证明是可行的。本发明代表了现有技术中的步骤变化，因为它体现了发达的设备和工艺，并展示了其在利用自动化计算机控制以连续流动形式快速规模化和生产性制造基于rna的物质方面的操作和性能。
[0337]
已经对过滤模块进行了深入的研究和分析，以满足连续流动处理的要求以及与流动反应器集成的能力，同时易于使用普通制造方法来制造和规模化。尽管切向流动过滤是被证明在rna纯化过程中有效的(a.eon-duval等人，2002年)常用技术，但本发明包括新颖的过滤装置，该过滤装置已经被专门设计和建造，该过滤装置被开发的目的是被配置成用
作连续流动系统，易于制造，能够集成在连续流动系统中，并允许装置的可扩展和经济高效的制造。本系统可以被集成为如下微工厂，该微工厂可以允许在使用点处自动且合规地制造基于性核酸的物质。此外，模块化设计允许使用该过滤系统再循环某些成分(如酶和质粒dna)，从而显著地降低所生产的物质的总成本。
[0338]
关于整个系统，已经开发了新的集成平台以便进行测试和实验。该系统已经使用丙烯酸压力板进行了原型设计，并且该系统还包括泵的所有端口、传感器以及入口和出口的配件。该系统允许测试连续流动反应或过滤，同时从每个过程的不同元件和阶段获得即时反馈。此外，该系统已经以模块化方式进了原型设计，这允许容易的使用用于运行实验的框架。3d打印由于其高灵活性、低成本和短交付周期而成为制造模具的所选工具。使用诸如在玻璃、金属(如不锈钢)和聚甲基丙烯酸甲酯pmma(丙烯酸)衬底上的微加工以及在包括光敏玻璃和硅的衬底上的光刻和深反应离子蚀刻的技术，模块的构造可容易地转移到商业制造。此外，对于模块的大规模制造，注射成型可以用于pmma和聚碳酸酯结构材料。
[0339]
uv-vis光谱证明了本发明实时提供反应溶液内容物的可靠在线和原位分析的能力。这也提供了封闭的反馈回路，以引导流体流动并调节流动系统中反应物的温度、ph值和分配，从而在整个过程中保持工艺条件。

技术特征：

1.一种rna合成的方法，包括：经由多个入口端口将多个反应物引入第一流体流动模块，所述多个反应物包括：至少一种三磷酸核苷(ntp)、反应缓冲液和dna、基于dna的化合物或基于dna的混合物；允许所述反应物中的至少一些反应物在流动系统的第一模块内的反应通道或井内进行反应；将所述dna保留在第一反应器模块处或使所述nda在所述第一反应器模块处再循环，并且允许所述反应物的反应产物流到第一流体过滤模块中；以及在第一过滤模块内对所述反应产物进行过滤。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种三磷酸核苷(ntp)是至少一种三磷酸核苷(ntp)的溶液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述至少一种三磷酸核苷(ntp)包括三磷酸腺苷(atp)、三磷酸胞苷(ctp)、三磷酸鸟苷(gtp)、三磷酸尿苷(utp)中的任何一个或三磷酸腺苷(atp)、三磷酸胞苷(ctp)、三磷酸鸟苷(gtp)、三磷酸尿苷(utp)的组合。4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，所述dna是质粒dna。5.根据任一前述权利要求所述的方法，所述多个反应物还包括酶混合物、盐溶液、rna聚合酶中的任何一个或酶混合物、盐溶液、rna聚合酶的组合。6.根据任一前述权利要求所述的方法，包括：将所述多个反应物中的至少一些反应物从所述第一过滤模块的出口再循环至所述第一反应器模块的入口区域。7.根据任一前述权利要求所述的方法，包括：将经过滤的反应产物中的至少一些从所述第一过滤模块输送至第二流体流动反应器模块中，并且将加帽酶输入至所述第二反应器模块中。8.根据权利要求7所述的方法，包括：将从所述第二反应器模块输出的流体输送至第二流体流动过滤模块。9.根据权利要求8所述的方法，包括：将任何未反应的ntp再循环至所述第一反应器模块的入口区域，并且将任何未反应的加帽酶再循环至所述第二反应器模块的入口区域。10.根据从属于权利要求5的任一前述权利要求所述的方法，其中，所述盐溶液包括mgcl2。11.根据从属于权利要求5的任一前述权利要求所述的方法，其中，所述rna聚合酶包括t7聚合酶。12.一种根据任一前述权利要求所述的方法制备的rna或基于rna的化合物。13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法制备的rna或基于rna的化合物在制备疫苗中的用途。14.一种流体流动过滤设备，包括：具有入口的第一伸长流体流动通道；具有出口的第二伸长流体流动通道；渗透膜，所述渗透膜被定位成沿着所述第一通道和所述第二通道的各自长度将所述第一通道与所述第二通道分隔开，使得渗透物可以沿着所述第一通道的长度和所述第二通道的长度从所述第一通道内的流体经由所述膜进入所述第二通道。15.根据权利要求14所述的设备，其中，所述第一通道的大部分长度被定位成：经由所
述膜与所述第二通道的大部分长度邻近。16.根据权利要求14和15所述的设备，其中，所述膜的孔径在100kda至1000kda的范围内、100kda至800kda的范围内、200kda至800kda的范围内或200kda至600kda的范围内、300kda至10mda的范围内。17.根据权利要求14至16中任一项所述的设备，包括其中形成有所述第一通道的第一板和其中形成有所述第二通道的第二板，所述膜夹在所述第一板和所述第二板各自的相对面之间。18.根据权利要求14至17中任一项所述的设备，其中，所述第一通道和所述第二通道各自包括一系列的直线部分和弯曲部分。19.根据权利要求18所述的设备，其中，所述第一通道和所述第二通道在它们的纵向方向上包括各自的蛇形轮廓。20.根据权利要求14至19中任一项所述的设备，其中，所述第一通道和所述第二通道沿着它们的长度敞开并且被定位成与所述膜直接接触，所述膜部分地限定所述第一通道和所述第二通道的纵向壁或面。21.根据权利要求14至20中任一项所述的设备，其中，所述膜的孔径小于rna分子的平均分子大小。22.一种用于处理流体的流体流动系统，包括：第一反应器模块，所述第一反应器模块具有反应流动通道或井、至少一个入口和至少一个出口；第一过滤模块，所述第一过滤模块具有流体过滤区域、被设置成与所述第一反应器模块的出口流体连通的至少一个入口和至少一个出口；其中，所述第一过滤模块包括根据权利要求13至21中任一项所述的流体流动过滤设备。23.根据权利要求22所述的系统，包括第二反应器模块，所述第二反应器模块具有反应流动通道或井、至少一个入口和出口，所述入口被设置成与所述第一过滤模块流体连通。24.根据权利要求23所述的系统，还包括第二过滤模块，所述第二过滤模块具有流体过滤区域、至少一个入口和出口，所述入口被设置成与所述第二反应器模块的出口流体连通。25.根据权利要求22至24中任一项所述的系统，包括被设置成与所述第一过滤模块的入口区域流体连通的流体注入端口。26.根据权利要求22至25中任一项所述的系统，包括第一再循环导管，所述第一再循环导管在所述第一反应器模块的出口的区域与所述第一反应器模块的至少一个入口之间延伸。27.根据权利要求22至26中任一项所述的系统，包括第二再循环导管，所述第二再循环导管在所述第一过滤模块的出口的区域与所述第一反应器模块的出口之间延伸。28.根据从属于权利要求24的权利要求27所述的系统，包括第三再循环导管，所述第三再循环导管在所述第二过滤模块的出口的区域与所述第一反应模块的入口之间延伸。29.一种使用流体流动过滤设备过滤流体的方法，包括：从入口驱动流体通过第一伸长流体流动通道；迫使所述流体的渗透物组分通过沿着所述第一通道延伸的膜并进入第二伸长流体流
动通道；以及将所述流体的滞留物组分保留在所述第一通道内；其中，所述膜被定位成沿着所述第一通道和所述第二通道的各自长度将所述第一通道与所述第二通道分隔开，使得渗透物可以沿着所述第一通道和所述第二通道的各自长度从所述第一通道经由所述膜进入所述第二通道。30.根据权利要求29所述的方法，其中，驱动所述流体的步骤包括：对所述第一通道内的流体加压。31.一种流动系统，包括：至少一个反应器模块，所述至少一个反应器模块具有反应流体流动通道或井、至少一个流体入口和至少一个流体出口；至少一个流动驱动器，所述至少一个流动驱动器用于驱动流体流过所述通道或所述井；第一传感器，所述第一传感器用于测量所述系统内的流体的压力、温度或ph中的任何一个或者所述系统内的流体的压力、温度或ph的组合；第二传感器，所述第二传感器用于测量所述系统内的流体的压力、温度和ph中的任何一个或者所述系统内的流体的压力、温度和ph的组合；反应状态监测装置，所述反应状态监测装置用于监测所述系统内的流体的特性，所述特性指示所述系统内的流体的至少两种化学成分的反应状态；控制单元，所述控制单元用于从所述第一传感器、所述第二传感器和所述反应状态监测装置中的至少一个或者所述第一传感器、所述第二传感器和所述反应状态监测装置的组合接收数据并且控制所述系统内的流体的至少一个特性。32.根据权利要求31所述的系统，其中，所述系统的特性是以下中的任何一个或以下的组合：
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所述系统内的流体的压力；
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所述系统内的流体的温度；
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所述系统内的流体的ph；
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所述系统内的流体的一种或更多种化学成分的体积或比例；
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所述系统内的流体的流速。33.根据权利要求32所述的系统，其中，所述控制单元包括cpu、pcb、plc、pc、处理器芯片、手持电子装置。34.根据权利要求33所述的系统，其中，附加传感器包括温度传感器、ph传感器、压力传感器、流速传感器、流量传感器或光谱传感器中的任何一个或者温度传感器、ph传感器、压力传感器、流速传感器、流量传感器或光谱传感器的组合。35.一种使用流体流动设备处理流体的方法，包括：经由至少一个入口将至少一种流体引入反应器模块中；使用至少一个流动驱动器来驱动所述流体流过反应流动通道或井或者使用至少一个流动驱动器将所述流体驱动在所述反应流动通道或所述井内，并且在出口处输出所述流体；测量所述流体流动设备内的流体的压力、温度或ph中的至少一个或者所述流体流动设
备内的流体的压力、温度或ph的组合；监测所述流体流动设备内的流体内的化学成分的反应状态；以及响应于所述流体的压力的测量、所述流体的ph的测量、所述流体的温度的测量和/或所述流体的化学成分的反应状态的测量中的至少一个或者所述流体的压力的测量、所述流体的ph的测量、所述流体的温度的测量和/或所述流体的化学成分的反应状态的测量的组合，使用控制单元来控制所述流体流动设备内的流体的至少一个特性。36.根据权利要求35所述的系统，包括以流体连通耦接在一起的多个反应器模块和过滤模块。37.根据权利要求35所述的系统，其中，所述流动驱动器是至少一个泵，并且可选地，所述流动驱动器是注射泵。38.根据权利要求35所述的系统，其中，所述流体分析传感器包括uv-vis光谱仪，所述uv-vis光谱仪用于在190nm至1000nm的范围内的吸光度或荧光分析。

技术总结

一种经由流体流动设备进行RNA合成的方法。该方法可以涉及：经由多个入口端口将多个反应物引入第一流体流动模块，多个反应物包括：至少一种三磷酸核苷(NTP)、反应缓冲液和DNA、基于DNA的化合物或基于DNA的混合物；允许反应物中的至少一些反应物在流动系统的第一模块内的反应通道或井内进行反应；将DNA保留在第一反应器模块处或使NDA在第一反应器模块处再循环，并且允许反应物的反应产物流到第一流体过滤模块中；以及在第一过滤模块内对反应产物进行过滤。产物进行过滤。产物进行过滤。