一种血浆游离核酸共提取试剂组合、试剂盒及提取方法与流程

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1.本发明属于分子生物学技术领域，特别地，涉及一种血浆游离核酸共提取试剂组合、试剂盒及提取方法。

背景技术：

2.cfdna(cell free dna)又称循环dna，是指游离于细胞之外的dna分子，这些dna分子主要来源于正常细胞某些特定释放过程、细胞凋亡、细胞坏死、以及癌细胞生长浸润过程中的释放，其大小主要集中在160-170到数百bp，半衰期在数小时左右。
3.血液中的cfdna水平和种类与包括肿瘤在内的多种疾病相关，此外，在母体血液中也能到胎儿的cfdna。血液中的cfdna检测已经被广泛用于各种癌症、某些自身免疫疾病如红斑狼疮的筛查，以及胎儿遗传疾病如唐氏综合征的无创检测。
4.游离循环rna是一种存在于动植物和人的体液中的细胞外游离状态的rna，有研究报道游离循环rna-蛋白质复合体可以作为一种潜在的肿瘤标记物；研究表明宫内发育迟缓、胎儿非整倍体以及子痫前期等妊娠相关疾病与母血中游离rna有极大关系，说明可以将孕妇血液中游离rna作为一种新的胎儿遗传信息材料。
5.然而，游离核酸在血液中的含量较低且个体差异很大，1ml血浆中游离核酸含量可能为几ng到几十ng不等，如做一次产前筛查仅提取cfdna就需要10ml左右血液样本，普通试剂盒只能提取游离核酸中的dna或rna中的一种，样本不能充分利用。

技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
7.本发明第一方面提供一种血浆游离核酸共提取试剂组合，包括第一裂解液、第二裂解液、绑定液和磁珠分散液，其中，所述第一裂解液含有2～4％sds、80～100mm edta、50～100mmtris-hcl，ph为6.0～6.8；sds使样本中的蛋白变性沉淀，并解聚与核酸结合的核蛋白；edta用于抑制样本中可能存在的核酸酶，保护游离核酸；tris-hcl用于提供适合酸性ph环境，使rna溶于水相，dna溶于有机相。
8.所述第二裂解液为水饱和酚，用于变性分离蛋白，并提供有机相。
9.所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2mnacl；其中，异丙醇用于吸收溶液中水分，使核酸析出；nacl用于提供核酸结合磁珠所需的钠离子。
10.所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50-80mg/ml，所述磁珠用于吸附dna。
11.任选地，所述血浆游离核酸共提取试剂组合还包括平衡液，所述平衡液为naoh溶液，用于调整ph值。优选地，所述naoh溶液浓度为1％。
12.任选地，所述血浆游离核酸共提取试剂组合还包括蛋白清洗液，所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇。其中，盐酸胍用于溶解蛋白；无水乙醇用于清洗蛋白。
13.任选地，所述血浆游离核酸共提取试剂组合还包括漂洗液，所述漂洗液包括
0.2mtris-hcl和60～80％无水乙醇，用于漂洗磁珠。
14.任选地，所述血浆游离核酸共提取试剂组合还包括第一洗脱液和第二洗脱液，所述第一洗脱液为无核酸酶水，所述第二洗脱液为5-10mm tris-hcl。优选地，所述tris-hcl的ph为8.0。
15.本发明第二方面提供一种血浆游离核酸共提取试剂盒，包括本发明第一方面任一所述的血浆样本cfdna提取试剂组合。
16.特别地，在本发明的一个具体实施方案中，所述血浆游离核酸共提取试剂盒包括裂解液、绑定液、磁珠分散液、蛋白清洗液、漂洗液和洗脱液，其中，所述裂解液含有2～4％sds、50～100mm edta、0.5～1mtris-hcl、1～2mnacl和10～20％甘油；所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2mnacl；所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50-80mg/ml；所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇；所述漂洗液包括0.2mtris-hcl和60～80％无水乙醇，所述洗脱液为5-10mm tris-hcl。
17.本发明第三方面提供一种血浆游离核酸共提取的方法，利用本发明第二方面特别的血浆游离核酸共提取试剂盒进行提取，包括以下步骤：
18.s1，在所述血浆样本中加入0.2～0.4倍血浆样本体积的第一裂解液，混匀后加入与所述血浆样本等体积的第二裂解液，50～80℃，≥1000rpm震荡孵育10～20min；
19.s2，10000～15000g离心5～15min，吸取水相上清至一新样本管，命名为样本管1，同时下层有机相加入0.2～0.4倍血浆样本体积的第一裂解液，再加入与血浆样本等体积的平衡液，命名为样本管2；
20.s3，对样本管1和样本管2分别处理：
21.s31，在样本管1中加入1.5～2.5倍血浆样本体积的绑定液，加入0.1～0.2倍上清体积磁珠，充分混匀后室温孵育10min以上，
22.s32，样本管2室温剧烈震荡混匀后，室温静置3～10min，10000～15000g离心8～15min，吸取水相上清入一新样本管，命名为样本管3，在样本管3中加入1.5～2.5倍血浆样本体积的绑定液，加入0.1～0.2倍上清体积磁珠，充分混匀后室温孵育10min以上；
23.s4，将样本管1和样本管3置于磁力架上，室温静置3～10min，吸弃上清；
24.s5，向样本管1和样本管3加入80～150μl的蛋白清洗液，重悬磁珠，室温静置5～15min；
25.s6，向样本管1和样本管3加入180～250μl漂洗液，静置10sec以上，吸弃上清并干燥；
26.s7，向样本管1中加入20～30μl第一洗脱液，向样本管3中加入20～30μl第二洗脱液，吹打重悬磁珠，室温静置5～15min，将样本管1和样本管3置于磁力架上，室温静置5～15min，吸取上清，得到cfdna溶液。
27.在本发明的一些实施方案中，步骤s1中，在所述血浆样本中加入0.25～0.3倍血浆样本体积的裂解液。
28.在本发明的一些实施方案中，步骤s1中，混匀后70℃金属浴孵育15min。
29.本发明的有益效果
30.相对于现有技术，本发明具有以下有益技术效果：
31.利用本发明的试剂组合或试剂盒，结合本发明的提取方法，能够从血浆样本中提
取高质量高纯度的游离核酸，解决游离核酸共提取问题，增加样本的利用率。
附图说明
32.图1示出了利用本发明的试剂组合提取得到的样本s1的cfdna质控结果。
33.图2示出了利用本发明的试剂组合提取得到的样本s2的cfdna质控结果。
34.图3示出了利用本发明的试剂组合提取得到的样本s1的cfrna质控结果。
35.图4示出了利用本发明的试剂组合提取得到的样本s2的cfrna质控结果。
具体实施方式
36.除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本技术中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本技术的提交日期同步的。在适用的情况下，本技术中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本技术中提供的任何定义不一致，则以本技术中提供的术语定义为准。
37.本技术中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本技术中。
38.术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本技术中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本技术中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由
……
组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由
……
组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
39.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
40.实施例
41.以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
42.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
43.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述
的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
44.下述实施例中未作具体说明的实验方法，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
45.实施例1血浆样本游离核酸提取试剂组合
46.本实施例提供一种血浆样本游离核酸提取试剂组合，包括裂解液1、裂解液2、平衡液、绑定液、磁珠、蛋白清洗液、漂洗液、洗脱液1、洗脱液2共九种试剂，各试剂成分内容如下：
47.1.裂解液1
48.组分：4％sds、100mm edta(ph 8.0)、80mm tris-hcl(ph 8.0)。
49.其中，sds使样本中的蛋白变性沉淀，并解聚与核酸结合的核蛋白；edta用于抑制样本中可能存在的核酸酶，保护游离核酸；tris-hcl用于提供适合酸性ph环境，使rna与dna分别分离至水相和有机相。
50.2.裂解液2
51.水饱和酚，用于变性并分离蛋白，同时提供有机相。
52.3.平衡液
53.0.1％氢氧化钠，用于调整溶液ph值。
54.4.绑定液
55.组分：50％异丙醇、1mnacl。
56.其中，异丙醇用于吸收溶液中水分，使核酸析出；nacl用于提供核酸结合磁珠所需的钠离子。
57.5.磁珠
58.粒径1-3μm磁性微球单分散液，浓度80mg/ml，用于吸附dna。
59.6.蛋白清洗液
60.组分：50％盐酸胍、50％无水乙醇。
61.其中，盐酸胍用于溶解蛋白；无水乙醇用于清洗蛋白。
62.7.漂洗液
63.组分：0.2mtris-hcl(ph 8.0)、80％无水乙醇。
64.其中，tris-hcl同样用于提供适合dna稳定的ph环境，无水乙醇用于清洗蛋白。
65.8.洗脱液1
66.无核酸酶水，用于洗脱rna。
67.9.洗脱液2
68.组分：10mm tris-hcl(ph 8.0)。
69.将上述9种试剂组合，可以制备血浆样本游离核酸提取试剂盒。
70.实施例2血浆样本游离核酸提取
71.本实施例应用实施例1的试剂组合对两个血浆样本(编号为s1和s2)进行游离核酸提取，步骤如下：
72.(1)400μl血浆样本中加入100μl裂解液1，充分混匀后，加入400μl裂解液2，震荡金属浴70℃，≥1000rpm剧烈震荡15min。
73.(2)12000g高速离心10min，吸取水相上清入一新样本管，命名为样本名-1，同时下层有机相加入100μl裂解液1，400μl平衡液，命名为样本名-2，
74.(3)在样本管1中加入800μl绑定液，加入80μl磁珠，充分混匀后室温孵育10min以上。
75.(4)样本管2室温剧烈震荡混匀后，室温静置5min，12000g高速离心10min，吸取水相上清入一新样本管，命名为样本名-3。
76.(5)在样本管3中加入800μl绑定液，加入80μl磁珠，充分混匀后室温孵育10min以上。
77.(6)将样本管1、样本管3置于磁力架上，室温静置5min。
78.(7)吸弃上清。
79.(8)将样本管1、样本管3从磁力架上取下，加入100μl蛋白清洗液，重悬磁珠，室温静置10min。
80.(9)将样本管1、样本管3置于磁力架上，室温静置5min。
81.(10)吸弃上清。
82.(11)将样本管1、样本管3置于磁力架上，加入100μl漂洗液，静置10秒以上，吸弃上清。
83.(12)重复步骤(10)确认完全吸弃上清。
84.(13)将样本管1、样本管3置于磁力架上，开盖干燥2min
85.(13)将样本管1、样本管3从磁力架取下，样本名-1管加入20μl洗脱液1，样本名-3管中加入20μl洗脱液2，吹打重悬磁珠，室温静置5min.
86.(14)将样本管1、样本管3置于磁力架上，室温静置5min。
87.(15)吸取上清，样本名-1管上清为提取得到的cfrna，命名为样本名-r，样本名-3管上清为提取得到的cfdna，命名为样本名-d，可用于后续实验或-80℃保存。
88.(16)样本定量和质检：
89.提取得到的cfdna以qubit
tm
dsdna hs试剂盒，qubit 2.0仪器进行定量，以nanodrop1000测定样本纯度，以agilent high sensitivity dna kit试剂盒，agilent bioanalyzer 2100仪器进行dna片段分布质检。
90.提取得到的cfrna以qubit
tm
rna hs assay kit试剂盒，qubit 2.0仪器进行定量，以nanodrop1000测定样本纯度，以agilent rna 6000 pico kit试剂盒，agilent bioanalyzer 2100仪器进行rna片段分布质检。
91.表1样本质检结果
92.样本名称总量(ng)260/280260/230s1-d(cfdna)108.61.921.88s2-d(cfdna)137.71.851.83s1-r(cfrna)43.31.831.86s2-r(cfrna)52.61.851.89
93.样本s1和样本s2提取得到的cfdna的片段分布情况分别如图1和图2所示，样本s1和样本s2提取得到的cfrna的片段分布情况分别如图3和图4所示。
94.由图1～图4可知，利用实施例1的试剂组合，能够得到质量非常高的游离cfdna和
cfrna。
95.实施例3血浆样本cfdna提取试剂盒优化
96.发明人对实施例1试剂组合中的组分或含量进行了优化，事实证明，实施例1的试剂组合提取血浆游离核酸获得了预料不到的技术效果。为了进一步证明该结论，发明人将相关配比变化后提取400μl血浆样本s1游离核酸的结果列于表2中。
97.表2试剂组合配比或比例的变化对游离核酸提取的影响
[0098][0099]
由表2可知，实施例1中试剂组合的任一试剂的组分发生变化，都会导致最终提取的cfdna总量显著下降，由此可知，实施例1的试剂组合中试剂之间互相配合、互相作用共同使得其取得惊人的提取血浆样本中游离核酸的技术效果。
[0100]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：

1.一种血浆游离核酸共提取试剂组合，其特征在于，包括第一裂解液、第二裂解液、绑定液和磁珠分散液，其中，所述第一裂解液含有2～4％sds、80～100mm edta、50～100mmtris-hcl，ph为6.0～6.8；所述第二裂解液为水饱和酚，所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2mnacl；所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50-80mg/ml。2.根据权利要求1所述的血浆游离核酸共提取试剂组合，其特征在于，还包括平衡液，所述平衡液为naoh溶液。3.根据权利要求1所述的血浆游离核酸共提取试剂组合，其特征在于，还包括蛋白清洗液，所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇。4.根据权利要求1所述的血浆游离核酸共取试剂组合，其特征在于，还包括漂洗液，所述漂洗液包括0.2mtris-hcl和60～80％无水乙醇。5.根据权利要求1所述的血浆游离核酸共提取试剂组合，其特征在于，还包括第一洗脱液和第二洗脱液，所述第一洗脱液为无核酸酶水，所述第二洗脱液为5-10mm tris-hcl。6.一种血浆游离核酸共提取试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一所述的血浆游离核酸共提取试剂组合。7.一种血浆游离核酸共提取试剂盒，其特征在于，包括第一裂解液、第二裂解液、平衡液、绑定液、磁珠分散液、蛋白清洗液、漂洗液、第一洗脱液和第二洗脱液，其中，所述第一裂解液含有2～4％sds、80～100mm edta、50～100mmtris-hcl，ph为6.0～6.8；所述第二裂解液为水饱和酚；所述平衡液为naoh溶液；所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2mnacl；所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50-80mg/ml；所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇；所述漂洗液包括0.2mtris-hcl和60～80％无水乙醇；所述第一洗脱液为无核酸酶水；所述第二洗脱液为5-10mm tris-hcl。8.一种血浆游离核酸共提取的方法，其特征在于，利用权利要求6所述的血浆游离核酸共提取试剂盒进行提取，包括以下步骤：s1，在所述血浆样本中加入0.2～0.4倍血浆样本体积的第一裂解液，混匀后加入与所述血浆样本等体积的第二裂解液，50～80℃，≥1000rpm震荡孵育10～20min；s2，10000～15000g离心5～15min，吸取水相上清至一新样本管，命名为样本管1，同时下层有机相加入0.2～0.4倍血浆样本体积的第一裂解液，再加入与血浆样本等体积的平衡液，命名为样本管2；s3，对样本管1和样本管2分别处理：s31，在样本管1中加入1.5～2.5倍血浆样本体积绑定液，加入0.1～0.2倍上清1/10体积磁珠，充分混匀后室温孵育10min以上，s32，样本管2室温剧烈震荡混匀后，室温静置3～10min，10000～15000g离心8～15min，吸取水相上清入一新样本管，命名为样本管3，在样本管3中加入1.5-2.5倍血浆样本体积绑定液，加入0.1～0.2倍上清体积磁珠，充分混匀后室温孵育10min以上；s4，将样本管1和样本管3置于磁力架上，室温静置3～10min，吸弃上清；s5，向样本管1和样本管3加入80～150μl的蛋白清洗液，重悬磁珠，室温静置5～15min；s6，向样本管1和样本管3加入180～250μl漂洗液，静置10sec以上，吸弃上清并干燥；s7，向样本管1中加入20～30μl第一洗脱液，向样本管3中加入20～30μl第二洗脱液，吹打重悬磁珠，室温静置5～15min，将样本管1和样本管3置于磁力架上，室温静置5～15min，
吸取上清，得到cfdna溶液。9.根据权利要求7所述的血浆游离核酸共提取的方法，其特征在于，步骤s1中，在所述血浆样本中加入0.25～0.3倍血浆样本体积的裂解液。

技术总结

本发明公开了一种血浆游离核酸共提取试剂组合、试剂盒及提取方法，属于分子生物学技术领域。所述血浆游离核酸共提取组合第一裂解液、第二裂解液、绑定液和磁珠分散液，进一步还包括平衡液、蛋白清洗液、漂洗液、第一洗脱液和/或第二洗脱液。利用本发明的试剂组合或试剂盒，结合本发明的提取方法，能够从血浆样本中提取高质量高纯度的游离核酸，解决游离核酸共提取问题，增加样本的利用率。增加样本的利用率。增加样本的利用率。