一种外泌体修饰的钙钛矿量子点的制备方法及其产品和应用

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1.本发明涉及发光材料生物应用技术领域，具体涉及一种外泌体修饰的钙钛矿量子点的制备方法及其产品和应用。

背景技术：

2.循环肿瘤细胞(ctcs)是从实质肿瘤中逸出，在肿瘤的发生、发展过程中存活于外周血，携带有关于原发肿瘤的宝贵信息。ctcs在肿瘤诊断和方面显示出巨大的潜力，很快成为一颗璀璨的明星。ctcs被认为是肿瘤转移的生物标志物和“液体活检”样本之一。许多临床研究表明，ctcs与癌症的诊断、预后、总体生存的预测、药物敏感性及临床结局的监测等密切相关。遗憾的是，由于ctcs的稀缺性和异质性，其检测和分离仍然是一个挑战。
3.目前，ctcs的检测方法大多依赖于上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，epcam)。因此，在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，emt)的ctcs中，epcam的表达下调可能会影响基于epcam的ctcs捕获率。更明显的是，大多数ctcs可能没有足够的上皮细胞表面，因此需要排除在基于epcam的检测之外。然而，癌细胞起源于上皮细胞，这种上皮细胞标记物可能存在于许多ctcs表面。由于肿瘤模型中标记物的可变性，暴露了基于epcam识别选择循环肿瘤细胞的局限性。同时，这一过程依赖于昂贵的epcam生物标志物，限制其广泛应用。例如，在黑素瘤循环肿瘤细胞中，epcam极低水平表达。因此，利用anti-epcam对黑素瘤循环肿瘤细胞进行鉴定将导致效率低下，造成浪费，且无法达到检测循环肿瘤细胞的目的。
4.因此，亟待开发一种不依赖于epcam识别黑素瘤循环肿瘤细胞的纳米材料。

技术实现要素：

5.针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种外泌体修饰的钙钛矿量子点的制备方法及其产品和应用，该方法操作简单，反应条件温和，可实现规模化生产。
6.为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：
7.技术方案一：一种外泌体修饰的钙钛矿量子点的制备方法，包括以下步骤：
8.s1、将csbr、pbbr2、n,n-二甲基甲酰胺和有机配体混合得到混合溶液，加热搅拌，得到澄清透明液体；
9.s2、在澄清透明液体中加入含有正硅酸甲酯(tmos)的甲苯，加热搅拌，得到黄绿液体；
10.s3、将黄绿液体离心后真空干燥，得到cspbbr3@sio2颗粒；
11.s4、将cspbbr3@sio2颗粒加入到mpeg-dspe(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺钠盐-甲氧基聚乙二醇)水溶液中，超声，得到浅绿液体，即cspbbr3@sio
2-peg纳米晶水溶液；
12.s5、将cspbbr3@sio
2-peg纳米晶水溶液与外泌体(evs)混合后进行反复挤压，得到cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点，即外泌体修饰的钙钛矿量子点。
13.进一步地，s1中，所述加热搅拌为：在60-90℃条件下搅拌1h。
14.进一步地，s1中，所述csbr、pbbr2和n,n-二甲基甲酰胺的用量比为0.087g:0.1427g:10ml。
15.进一步地，s1中，所述有机配体为油酸和油胺，二者体积比为(2-1.8):(0.6-0.5)。
16.进一步地，s2中，所述加热搅拌为：在30℃条件下搅拌2h。
17.进一步地，s2中，所述澄清透明液体与含有正硅酸甲酯的甲苯的体积比为1:10。
18.进一步地，s2中，所述正硅酸甲酯的用量为甲苯体积的0.05％。
19.澄清透明液体与含有正硅酸甲酯的甲苯溶液混合之前，澄清透明液体中先加入氨水，混合，搅拌混匀，得到的混合溶液再加入含有正硅酸甲酯的甲苯溶液中。
20.进一步地，s3中，所述离心具体操作为：以180r/min搅拌2h，然后以10000r/min离心10min。
21.进一步地，s3中，所述干燥温度为60℃，时间为6h。
22.进一步地，s4中，所述超声功率为40khz，超声时间为20min。
23.进一步地，s4中，所述mpeg-dspe水溶液中，mpeg-dspe与pbs水的用量比为10mg:1ml。
24.进一步地，s5中，所述挤压的次数为6次。
25.以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂与csbr、pbbr2和有机配体混合得到的混合溶液，在60℃条件下搅拌1h，可加速csbr和pbbr2的溶解，加入到含有正硅酸甲酯的甲苯中，在30℃条件下搅拌2h，形成cspbbr3@sio2。在40khz的超声辅助下，将mpeg-dspe修饰在cspbbr3@sio2的表面，通过挤出的物理方式，将外泌体膜包覆在cspbbr3@sio
2-peg表面。
26.未经mpeg-dspe修饰的cspbbr3@sio2容易聚集沉淀，在膜包覆阶段，容易形成团聚状纳米颗粒，颗粒不规则，获得的纳米材料稳定性差。因此本发明反应过程中，利用mpeg-dspe修饰cspbbr3@sio2的表面，提高其稳定性，并增加其量子效率，形成cspbbr3@sio
2-peg钙钛矿量子点。通过挤出的方式，反复挤压外泌体与cspbbr3@sio
2-peg钙钛矿量子点，形成cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点。
27.技术方案二：一种利用上述制备方法制备得到的外泌体修饰的钙钛矿量子点。
28.技术方案三：一种外泌体修饰的钙钛矿量子点作为肿瘤液体活检材料中的应用，优选黑素瘤循环肿瘤细胞。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
30.本发明通过物理的方式，成功制备出cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点，该量子点具有水溶性，提高了识别亲本循环肿瘤的效率。该方法操作简单，反应条件温和，不需要保护气体，可重复效率高，可实现规模化生产。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1为实施例1制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点的发射光谱；
33.图2为实施例2制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点的宏观照片；
34.图3为实施例2制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点的透射电镜图，图标尺在200nm；
35.图4为实施例2制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点的透射电镜，图标尺在500nm；
36.图5为实施例1制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点在365nm紫外光下的发光照片；
37.图6即是实验例1制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点识别黑素瘤循环肿瘤细胞效率图。
具体实施方式
38.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
39.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
40.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
41.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
42.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
43.除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
44.一种外泌体修饰的钙钛矿量子点的制备方法，包括以下步骤：
45.s1、将csbr、pbbr2、n,n-二甲基甲酰胺和有机配体混合得到混合溶液，加热搅拌，得到澄清透明液体；
46.s2、在澄清透明液体中加入含有正硅酸甲酯的甲苯，加热搅拌，得到黄绿液体；
47.s3、将黄绿液体离心后真空干燥，得到cspbbr3@sio2颗粒；
48.s4、将cspbbr3@sio2颗粒加入到mpeg-dspe水溶液中，超声，得到浅绿液体，即cspbbr3@sio
2-peg纳米晶水溶液；
49.s5、将cspbbr3@sio
2-peg纳米晶水溶液与外泌体混合后进行反复挤压，得到cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点，即外泌体修饰的钙钛矿量子点。
50.s1中，所述加热搅拌为：在60-90℃条件下搅拌1h。
51.s1中，所述csbr、pbbr2和n,n-二甲基甲酰胺的用量比为0.087g:0.1427g:10ml。
52.s1中，所述有机配体为油酸和油胺，二者体积比为(2-1.8):(0.6-0.5)。优选的，n,n-二甲基甲酰胺、油酸和油胺的体积比为5:0.9:0.8。
53.s2中，所述加热搅拌为：在30℃条件下搅拌2h。
54.s2中，所述澄清透明液体与甲苯的体积比为1:10。
55.s2中，所述正硅酸甲酯的用量为甲苯体积的0.05％。
56.澄清透明液体与含有正硅酸甲酯的甲苯溶液混合之前，澄清透明液体中先加入氨水，混合，搅拌混匀，得到的混合溶液再加入含有正硅酸甲酯的甲苯溶液中。
57.s3中，所述离心具体操作为：以180r/min搅拌2h后以10000r/min离心10min。
58.s3中，所述干燥温度为60℃，时间为6h。
59.s4中，所述超声功率为40khz，超声时间为20min。
60.s4中，所述mpeg-dspe水溶液中，mpeg-dspe与pbs的用量比为10mg:1ml。
61.s5中，所述挤压的次数为6次。
62.以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂与csbr、pbbr2和有机配体混合得到的混合溶液，在60℃条件下搅拌1h，可加速csbr和pbbr2的溶解，加入到含有正硅酸甲酯的甲苯中，在30℃条件下搅拌2h，形成cspbbr3@sio2。在40khz的超声辅助下，将mpeg-dspe修饰在cspbbr3@sio2的表面，通过挤出的物理方式，将外泌体膜包覆在cspbbr3@sio
2-peg表面。
63.未经mpeg-dspe修饰的cspbbr3@sio2容易聚集沉淀，在膜包覆阶段，容易形成团聚状纳米颗粒，颗粒不规则，获得的纳米材料稳定性差。因此本发明反应过程中，利用mpeg-dspe去修饰cspbbr3@sio2的表面，提高其稳定性，并增加其量子效率，形成cspbbr3@sio
2-peg钙钛矿量子点。通过挤出的方式，反复挤压外泌体与cspbbr3@sio
2-peg钙钛矿量子点，形成cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点。
64.综上，本发明通过物理的方式，成功制备出cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点，该量子点具有水溶性，提高了识别亲本循环肿瘤的效率。该方法操作简单，反应条件温和，不需要保护气体，可重复效率高，可规模化生产。
65.一种利用上述制备方法得到的外泌体修饰的钙钛矿量子点。
66.一种外泌体修饰的钙钛矿量子点作为肿瘤液体活检材料中的应用。
67.以下实施例中原料均为市售所得。
68.本发明使用的外泌体为：
69.收集好黑素肿瘤细胞液通过500r/min离心10min,保留上清，去除细胞，再经过16500r/min,离心30min，保留上清，去除细胞碎片，再经过120000r/min.离心60min，后去除上清，用同样的转速，pbs清洗一次，即可获得外泌体。
70.实施例1
71.一种外泌体修饰的钙钛矿量子点的制备方法，步骤如下：
72.s1、称取0.087g的csbr和0.1427g的pbbr2于100ml的单颈烧瓶玻璃瓶中，加入1.8ml油酸和0.6ml油胺，然后加入10ml n,n-二甲基甲酰胺，得到的混合物在60℃下搅拌1h，得到澄清透明液体；
73.s2、取2ml澄清透明液体，加入40μl氨水，搅拌混匀，得到混合液，将该混合液加入
到20ml甲苯中(甲苯中含有10μl正硅酸甲酯)，在30℃下搅拌2h，得到黄绿液体；
74.s3、将黄绿液体以180r/min搅拌2h，然后以10000r/min离心10min，在60℃真空干燥箱中干燥6h，得到cspbbr3@sio2颗粒；
75.s4、称取10mg mpeg-dspe溶于1ml水溶液中得到mpeg-dspe水溶液中，将得到的cspbbr3@sio2颗粒加入其中，在40khz的功率下超声20min，得到浅绿液体，即cspbbr3@sio
2-peg纳米晶水溶液；
76.s5、浅绿液体与15ηg外泌体混合后在挤出仪中用200nm脂溶性膜进行反复挤压6次，得到cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点，即外泌体修饰的钙钛矿量子点。
77.实施例2
78.一种外泌体修饰的钙钛矿量子点的制备方法，步骤如下：
79.s1、称取0.087g的csbr和0.1427g的pbbr2于100ml的单颈烧瓶玻璃瓶中，加入1.8ml油酸和0.6ml油胺，然后加入10ml n,n-二甲基甲酰胺，得到的混合物在60℃下搅拌1h，得到澄清透明液体；
80.s2、取2ml澄清透明液体，加入40μl氨水，搅拌混匀，得到混合液，将该混合液加入到20ml甲苯中(甲苯中含有10μl正硅酸甲酯)，在30℃下搅拌2h，得到黄绿液体；
81.s3、将黄绿液体以180r/min搅拌2h，然后以10000r/min离心10min，在60℃真空干燥箱中干燥6h，得到cspbbr3@sio2颗粒；
82.s4、称取10mg mpeg-dspe溶于1ml水溶液中得到mpeg-dspe水溶液中，将得到的cspbbr3@sio2颗粒加入其中，在40khz的功率下超声20min，得到浅绿液体；
83.s5、浅绿液体与15ηg外泌体混合，在超声20hz超声作用下，工作30s间歇150s，工作6个循环，然后37℃孵育1h，得到cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点，即外泌体修饰的钙钛矿量子点。
84.实施例3
85.一种外泌体修饰的钙钛矿量子点的制备方法，步骤如下：
86.s1、称取0.087g的csbr和0.1427g的pbbr2于100ml的单颈烧瓶玻璃瓶中，加入1.8ml油酸和0.6ml油胺，然后加入10ml n,n-二甲基甲酰胺，得到的混合物在60℃下搅拌1h，得到澄清透明液体；
87.s2、取2ml澄清透明液体，加入40μl氨水，搅拌混匀，得到混合液，将该混合液加入到20ml甲苯中(甲苯中含有10μl正硅酸甲酯)，在30℃下搅拌2h，得到黄绿液体；
88.s3、将黄绿液体以180r/min搅拌2h，然后以10000r/min离心10min，在60℃真空干燥箱中干燥6h，得到cspbbr3@sio2颗粒；
89.s4、称取10mg mpeg-dspe溶于1ml水溶液中得到mpeg-dspe水溶液中，将得到的cspbbr3@sio2颗粒加入其中，在40khz的功率下超声20min，得到浅绿液体，即cspbbr3@sio
2-peg纳米晶水溶液；
90.s5、浅绿液体与15ηg外泌体混合后在挤出仪中用400nm脂溶性膜进行反复挤压6次，得到cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点，即外泌体修饰的钙钛矿量子点。
91.试验例1
92.1、荧光激发光谱
93.荧光激发光谱采用爱丁堡fls-980荧光光谱仪测试。测试方法：以实施例1制备的
cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点和cspbbr3@sio
2-peg纳米晶为测试对象，监测504nm发射波长下测得荧光激发光谱。
94.图1为实施例1制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点的发射光谱图，从图1中可以看出，经过365nm紫光激发在504处有明显的绿荧光存在。相较于未包覆外泌体的cspbbr3@sio
2-peg，外泌体包覆后发生一定的蓝移。
95.图2为实施例2制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点的宏观照片，从图2中可以看出，获得的cspbbr3@sio
2-peg-evs，澄清透明，无沉淀。
96.2、高分辨透射电镜(htem)透射电镜
97.以实施例2制备的样品为测试对象，利用透射电子显微镜表征样品的形貌和进行元素分析，仪器来自捷克的*/talos f200s场发射透射电子显微镜。
98.图3为实施例2制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点的透射电镜，图标尺在200nm；从图3中可以看出，单颗粒大概在200nm到300nm左右，在纳米材料表面有一层明显的膜状结构，颗粒相对均一，形状相对规则。
99.图4为实施例2制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点的透射电镜，图标尺在500nm；；从图4中可以看出，在超声下获得的cspbbr3@sio2-peg-evs，容易发生团聚，形状并不规则，颗粒较大。
100.3、荧光发射光谱
101.荧光发射光谱采用爱丁堡fls-980荧光光谱仪测试。测试方法：以实施例3制备的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点为测试对象，在365nm的激发波长下，测得荧光发射光谱。
102.图5为实施例1制得的cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点在365nm紫外光下的发光照片。从图5中可以看出，最后合成的cspbbr3@sio
2-peg-evs在365nm紫光激发下发明显的绿荧光。
103.试验例2
104.1)黑素肿瘤细胞(b16)进行以5*104的密度种植，37℃，5％co2培养箱孵育48小时；
105.2)去除培养液，将细胞经过胰酶消化，加入pbs将细胞稀释至1*105/ml，得到细胞溶液，然后分别作出如下处理：
106.a、取1ml上述细胞溶液后离心，加入300ηlpbs，得到含黑素肿瘤细胞的pbs溶液，然后与实试例1获得的cspbbr3@sio
2-peg-evs混合，37℃孵育30min；
107.b、取1ml上述细胞溶液后离心，加入300ηl pbs，得到含黑素肿瘤细胞的pbs溶液，然后与实试例1获得的cspbbr3@sio
2-peg-evs混合，37℃孵育60min；
108.c、取1ml上述细胞溶液后离心，加入150ηl pbs，得到含黑素肿瘤细胞的pbs溶液，然后与上皮细胞粘附分子相对应的抗体(anti-epcam)混合，37℃孵育30min；
109.d、取1ml上述细胞溶液后离心，加入150ηlpbs，得到含黑素肿瘤细胞的pbs溶液，然后与上皮细胞粘附分子相对应的抗体(anti-epcam)混合，37℃孵育60min.；
110.3)将a、b、c、d置于cytoflex流式细胞仪中进行比较。
111.图6即是实验例1获得的流式分选的结果，结果发现，cspbbr3@sio
2-peg-evs识别黑素瘤循环肿瘤细胞，识别的效率虽然不高，但相较于抗体识别黑素瘤循环肿瘤细胞，识
别效率有明显的提升。
112.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种外泌体修饰的钙钛矿量子点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将csbr、pbbr2、n,n-二甲基甲酰胺和有机配体混合得到混合溶液，加热搅拌，得到澄清透明液体；s2、在澄清透明液体中加入含有正硅酸甲酯的甲苯，加热搅拌，得到黄绿液体；s3、将黄绿液体离心后真空干燥，得到cspbbr3@sio2颗粒；s4、将cspbbr3@sio2颗粒加入到mpeg-dspe水溶液中，超声，得到浅绿液体，即cspbbr3@sio
2-peg纳米晶水溶液；s5、将cspbbr3@sio
2-peg纳米晶水溶液与外泌体混合后进行反复挤压，得到cspbbr3@sio
2-peg-evs钙钛矿量子点，即外泌体修饰的钙钛矿量子点。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s1中，所述加热搅拌为：在60-90℃条件下搅拌1h。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s1中，所述csbr、pbbr2和n,n-二甲基甲酰胺的用量比为0.087g:0.1427g:10ml。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s1中，所述有机配体为油酸和油胺，二者体积比为(2-1.8):(0.6-0.5)。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s2中，所述加热搅拌为：在30℃条件下搅拌2h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s2中，所述澄清透明液体与含有正硅酸甲酯的甲苯的体积比为1:10。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s2中，所述正硅酸甲酯的添加量为甲苯体积的0.05％。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s3中，所述离心具体操作为：以180r/min搅拌2h后以10000r/min离心10min。9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备得到的外泌体修饰的钙钛矿量子点。10.一种利用权利要求9所述的外泌体修饰的钙钛矿量子点作为肿瘤液体活检材料的应用。

技术总结

本发明公开一种外泌体修饰的钙钛矿量子点的制备方法及其产品和应用，涉及发光材料生物应用技术领域。包括以下步骤：S1、CsBr、PbBr2、N,N-二甲基甲酰胺和有机配体混合得到混合溶液，加热搅拌，得到澄清透明液体；S2、在澄清透明液体中加入含有正硅酸甲酯的甲苯，加热搅拌，得到黄绿液体；S3、将黄绿液体离心后真空干燥，得到CsPbBr3@SiO2颗粒；S4、将CsPbBr3@SiO2颗粒加入到mPEG-DSPE水溶液中，超声，得到浅绿液体；S5、浅绿液体与外泌体混合后进行反复挤压，得到外泌体修饰的钙钛矿量子点。该方法操作简单，反应条件温和，不需要保护气体，可实现规模化生产。可实现规模化生产。可实现规模化生产。