黑皮质素受体MC5R的用途

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黑皮质素受体mc5r的用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及黑皮质素受体mc5r的用途。

背景技术：

2.骨髓是人体的主要造血器官，各种血细胞均是在骨髓发育成熟，释放到外周血，供机体使用的。在生长发育的过程中，造血功能往往会因为各种因素的诱导而出现功能障碍。癌症作为人类健康的“第一杀手”，严重影响了人类的生活水平，威胁着人类的生命健康。据文献报道，在癌症患者中，肿瘤来源的细胞因子(如：gm-csf、il-6、pge2、cox-2等)可以调节造血干细胞和祖细胞的分化从而导致造血功能紊乱。通过分析133例不同癌症患者的外周血，发现与健康人相比，肿瘤患者血液中造血干细胞和前体细胞发生了显著的改变，其中以循环的粒细胞-单核细胞前体(gmps)变化最为显著，上升了4-7倍，gmps的显著增加加速了髓系来源的抑制细胞(mdscs)的积累，从而促进的肿瘤的生长。以上结果表明癌症确实能够导致髓系造血功能的紊乱，使得造血干细胞偏向髓系分化而加速肿瘤进程。
3.除了肿瘤之外，脓毒血症也与髓系造血密切相关。脓毒血症被定义为宿主对感染的异常反应导致危及生命的器官功能障碍性疾病。至今为止在临床试验中还没有特别有效的方法或者药物，因此发现新的靶点或者新的药物一直是脓毒症研究领域的核心问题。在脓毒血症中，机体为了抵抗感染往往会通过造血干细胞和祖细胞产生大量的固有免疫细胞(如：中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等)，这一过程称作“紧急髓系造血”。“紧急髓系造血”是免疫系统针对感染的一种必备生理反应，然而关于其表观遗传的机制还不太清楚。有文献报道，在盲肠穿刺诱导的脓毒血症模型中，活化的b细胞产生il-3诱导造血祖细胞以及炎性的单核细胞和中性粒细胞的快速扩增，il-3缺陷有效的保护小鼠免受脓毒血症的伤害，显著提高小鼠的存活率。此外有研究发现tet2通过mrna氧化的方式促进病原体感染诱导的骨髓细胞的生成，导致脓毒血症加重。这些结果表明在脓毒血症中，髓系造血功能往往会出现紊乱，造血祖细胞的快速扩增导致炎性的单核细胞和中性粒细胞的积累进一步引发细胞因子风暴而导致器官衰竭甚至死亡。除了细菌诱导的脓毒血症可以导致髓系造血增强之外，有文献报道在病毒感染的情况下，造血前体细胞通过识别病毒，进而促进造血前体细胞的增殖和分化，最终导致髓系造血紊乱。
4.此外，许多其他疾病也与髓系造血功能紊乱密切相关。据报道apoe通过调节造血干细胞增殖，促进单核细胞以及中性粒细胞的增多和积累，增强动脉粥样硬化病变区域炎性细胞的生成，导致动脉粥样硬化斑块的形成和心血管疾病(cvd)的发生。有研究表明压力应激可以通过β3-肾上腺受体降低cxcl12的水平而诱导造血祖细胞大量的扩增，导致炎症性单核细胞和嗜中性粒细胞的迅速积累而诱发各种心理疾病。另外研究人员发现肥胖能够促进造血前体细胞向髓系细胞分化，导致cd11c+脂肪驻留的巨噬细胞的积累而加剧脂肪炎症的发生。除此之外，利用crispr/cas9和短单链寡核苷酸模板纠正镰刀细胞病(scd)病人造血干细胞和祖细胞上编码β球蛋白基因，能够有效的镰刀细胞病。有文献报道，在实验性脊柱关节炎模型中，肥大细胞可以产生gm-csf，进而诱导造血前体细胞数目增多，促进
髓系造血紊乱。以上结果表明，髓系造血与多种疾病密切相关，包括但不限于肿瘤、脓毒血症、糖尿病、肥胖、抑郁、肠炎、痛风、关节炎、白血病、再生障碍性贫血、特发性血小板减小性紫癜等血液病以及各类心血管类疾病等。因此寻髓系造血功能紊乱的药物具有十分重要的临床意义和广阔的应用前景。
5.g蛋白偶联受体(gpcr)，也称七次跨膜结构域受体，能够响应许多胞外信号，并引起细胞内的信号转导。gpcr对于维持机体的许多生理功能至关重要，它们的失调往往会导致许多疾病的发生，因此，将gpcr作为重要的药物的靶点，能够更好的一些疾病。据统计，在美国fda批准的临床药物中，其中超过30％的药物是以gpcr作为的靶点。黑素皮质激素受体(mcrs)家族由5个成员组成，它们属于gpcr超家族。mc1r主要在皮肤中的黑素细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞表达，诱导黑素的生成。mc2r主要在肾上腺中高表达，参与类固醇的合成。mc3r和mc4r是一类中枢神经系统(cns)受体，主要在皮层，丘脑，下丘脑，脑干表达，参与能量稳态调节(食物摄入，储能，脂肪分解)。mc5r在多种外周组织中表达，如胸腺、脾脏和外分泌腺，在性行为调节、体温调节和外分泌(如皮脂生成、泪腺分泌和性信息素释放)中发挥关键作用。此外，mc5r在b细胞、t细胞和肥大细胞上表达，尤其在造血祖细胞上高表达。提示mc5r在调节免疫反应和炎症反应中也同样发挥关键作用，然而，关于mc5r在免疫调节中的作用机制还知之甚少，以及mc5r是否参与调控肿瘤或者脓毒血症中髓系造血紊乱未曾报道。
6.黑素皮质激素受体的激活需要与其配体黑素皮质激素结合。黑素皮质激素包括黑素细胞刺激激素(α-msh、β-msh和γ-msh)以及促肾上腺皮质激素(acth)，它们是一类具有生物活性的内源性多肽，由促黑素细胞皮质素原(pomc)经过不同的激素原转化酶pc1/3和pc2剪切而成。pomc主要表达在垂体和下丘脑弓状核(arc)，在外周组织皮肤中也有一定的表达，主要的功能包括调节食欲和黑素的生成。α-msh是mc5r的天然配体，具有许多的生理功能，包括代谢调控、神经保护以及抗炎作用等。有文献报道α-msh通过激活mc5r促进肌肉组织对葡萄糖的摄取。另外有人发现α-msh通过抑制核转录因子κβ((nf-κβ)减少炎症介质浓度起到保护脑和外周器官免受炎症损伤。但是关于α-msh-mc5r信号通路在肿瘤免疫或者脓毒血症中的作用还不太清楚，以及α-msh-mc5r信号通路是否参与调控髓系造血未曾可知。

技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供黑皮质素受体mc5r的用途。
8.本发明提供了以mc5r为靶点的物质，在制备预防和/或髓系造血功能紊乱相关疾病药物中的应用。
9.本发明中，所述以mc5r为靶点的物质包括i～vi中至少一种：
10.i)、敲除或敲低mc5r基因的表达载体；
11.ii)、含有i)的宿主细胞或病毒载体；
12.iii)、干扰mc5r基因转录的核酸分子；
13.iv)、mc5r基因表达的终止子或转座子；
14.v)、抑制mc5r基因表达的制剂；
15.vi)、mc5r蛋白功能的抑制剂和/或拮抗剂。
16.一些实施例中，所述干扰mc5r基因转录的核酸分子包括：靶向mc5r基因的rnai片段、靶向mc5r基因的sirna片段或促进mc5r信使rna降解的crispr grna。
17.一些实施例中，所述mc5r蛋白功能的抑制剂和/或拮抗剂包括：mc5r中和抗体、mc5r的化学小分子抑制剂和/或mc5r的多肽类抑制剂。
18.一些具体实施例中，所述mc5r的中和抗体包括嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、双特异性抗体和多特异性抗体。。
19.一些具体实施例中，所述mc5r多肽抑制剂为ac-cehfrwcppkd-nh220.一些具体实施例中，mc5r化学的小分子抑制剂为n-(((3s，5s)-1-(2，2-二苯基乙基)-2-氧代-3-(3-(-1-基)丙基)-1，4-二氮杂-5-基)甲基)-2-萘甲酰胺，或其类似物；
21.或者，mc5r化学的小分子抑制剂为jnj-10229570或其类似物。
22.本发明中，所述髓系造血功能紊乱相关疾病包括：肿瘤、脓毒血症、肥胖、抑郁、糖尿病、心血管类疾病、肠炎、血液病、痛风、关节炎、阿兹海默、哮喘、脑卒中、自身免疫性、细菌、真菌和病毒诱导的感染性疾病中至少一种。
23.一些实施例中，所述肿瘤包括：实体瘤和/或非实体瘤；所述实体瘤包括：宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、外阴癌、前列腺癌、腮腺癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肺癌、纤维肉瘤、皮肤癌、鼻咽癌、舌癌、口腔癌、喉癌、脑瘤、胆囊癌、肾癌、牙龈癌、睾丸癌、阴茎癌、多发骨髓瘤和/或恶性黑素瘤；所述非实体瘤包括：白血病和/或恶性淋巴瘤。本发明中，以llc细胞、b16f10-gmcsf细胞、mca205细胞为对象，构建动物模型，分别对本发明所述的mc5r为靶点的物质在肺癌、黑素瘤或纤维肉瘤中的用途进行验证。
24.本发明实施例中，对所述肿瘤的预防和/或包括：降低瘤体质量、抑制肿瘤生长和/或增强抗肿瘤免疫。所述增强抗肿瘤免疫包括：降低髓系来源的抑制性细胞数量或比例、提高肿瘤中毒性淋巴细胞(cd4/cd8/nk/nkt)的数量或比例或杀伤功能和/或降低骨髓前体细胞的数量或比例。一些实施例中，所述血液病包括脓毒血症、再生障碍性贫血和/或特发性血小板减小性紫癜。
25.一些具体实施例中，所述脓毒血症包括由病原菌感染引起的脓毒血症、脂多糖诱导的脓毒血症和/或盲肠结扎诱导的脓毒血症。
26.本发明实施例中，对所述脓毒血症的预防和/或包括延长生存率、增强菌清除能力、减轻炎症反应程度。
27.本发明还提供了一种和/或预防髓系造血功能紊乱相关疾病的药物，其包括以mc5r为靶点的物质和药学上可接受的辅料。
28.所述以mc5r为靶点的物质包括i～vi中至少一种：
29.i)、敲除或敲低mc5r基因的表达载体；
30.ii)、含有i)的宿主细胞或病毒载体；
31.iii)、干扰mc5r基因转录的核酸分子；
32.iv)、mc5r基因表达的终止子或转座子；
33.v)、抑制mc5r基因表达的制剂；
34.vi)、mc5r蛋白功能的抑制剂和/或拮抗剂。
35.本发明所述药物中，所述干扰mc5r基因转录的核酸分子包括：靶向mc5r基因的
rnai片段、靶向mc5r基因的sirna片段或促进mc5r信使rna降解的crispr grna。
36.本发明所述药物中，所述mc5r蛋白功能的抑制剂和/或拮抗剂包括：mc5r中和抗体、mc5r的化学小分子抑制剂和/或mc5r的多肽类抑制剂。
37.本发明所述药物中，所述mc5r多肽抑制剂为ac-cehfrwcppkd-nh2。
38.本发明所述药物中，mc5r化学的小分子抑制剂为n-(((3s，5s)-1-(2，2-二苯基乙基)-2-氧代-3-(3-(-1-基)丙基)-1，4-二氮杂-5-基)甲基)-2-萘甲酰胺，或其类似物；
39.或者，mc5r化学的小分子抑制剂为jnj-10229570或其类似物。
40.本发明所述的药物，还包括免疫抑制分子抗体、小分子化合物和核酸类抑制剂。一些实施例中，所述免疫抑制分子抗体为pd-1抗体、pd-l1抗体、ctla-4抗体、lag3抗体和/或tigit抗体等。
41.一些具体实施例中，所述pd-1抗体与mc5r为靶点的物质的质量比为(0.05～2)：(1～10)。
42.一些实施例中，所述药物包括pd-1抗体与mc5r多肽抑制剂，其中，pd-1抗体与mc5r多肽抑制剂的质量比为(0.05～2)：(1～10)。一些具体实施例中，pd-1抗体与mc5r多肽抑制剂的质量比为(0.05～1)：(1～3)。一些具体实施例中，pd-1抗体与mc5r多肽抑制剂的质量比为0.05:1、0.05:2、0.05:3、0.1:1、0.1:2、0.1:3、0.5:1、0.5:2、0.5:3、1:1、1:2或1:3。
43.本发明中，所述药物的机型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖锭、粉剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂或气雾剂。
44.一些实施例中，药学上可接受的辅料包括以下类型的赋形剂：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、造粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、调味剂、气味遮蔽剂、着剂、抗结块剂、保湿剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和/或缓冲剂中至少一种。
45.本发明还提供了一种和/或预防髓系造血功能紊乱相关疾病的方法，其为给予本发明所述的药物。具体的，该和/或预防髓系造血功能紊乱相关疾病的方法为其包括向有需要的受试者施用有效量的如上所述的药物。
46.本发明中，所述药物的给药方法包括口服、吸入、肠胃外途径。所述胃肠外途径包括皮下注射、肌肉内注射、静脉内注射或皮内注射。
47.本发明实施例中，所述药物组合物的给药剂量为0.5-30mg/kg、1-30mg/kg、2-30mg/kg、3-30mg/kg、4-30mg/kg或以上。一些实施例中，所述药物的给药剂量例如为0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg或以上。
48.本发明通过确定mc5r在抗肿瘤免疫、脓毒血症疾病中的作用，为以mc5r为作用靶点，设计和制备髓系造血功能紊乱相关疾病药物的研究提供了理论支持，为肿瘤、脓毒血症、肥胖、抑郁、糖尿病、心脑血管类疾病、肠炎、血液病、痛风、关节炎、阿尔兹海默症、哮喘、自身免疫性疾病、细菌、真菌和病毒诱导的感染性疾病及各类造血功能异常性疾病提供了新的策略。
附图说明
49.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍：
50.图1示出实施例1中探究荷瘤小鼠血清中α-msh的变化情况结果图，其中a显示与对照鼠相比，在小鼠荷瘤mca205细胞不同时间点分泌的α-msh水平明显增加；b显示与对照鼠相比，在小鼠荷瘤llc细胞不同时间点分泌的α-msh水平明显增加；
51.图2示出实施例2中通过荧光定量pcr仪检测mc5r基因的表达水平，其中a显示骨髓细胞中黑皮质素受体家族成员的表达水平的结果图；b显示在lsk细胞、公共髓系前体细胞(cmp)、粒细胞前体细胞(gmp)、公共淋系前体细胞(clp)、中性粒细胞和单核细胞中mc5r基因的表达水平的结果图；
52.图3示出实施例3中探究全身性敲除mc5r基因小鼠在肿瘤模型中的髓系造血变化情况的结果图，其中a显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的造血前体细胞数目明显减少包括(lsk/cmp/gmp/mdp)；b显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤、脾脏和血液中髓系来源的抑制性细胞数目明显减少(pmn-mdsc/m-mdsc)；
53.图4示出实施例4中探究全身性敲除mc5r基因小鼠在不同肿瘤模型中的变化情况的结果图：在llc肿瘤模型中，a显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤生长速度明显减缓，b显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤重量明显减轻，i显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤中浸润的cd8+t细胞、cd4+t细胞、nk细胞、nkt细胞数目显著增多；在mca205肿瘤模型中，c显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤生长速度明显减缓，d显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤重量明显减轻；在mc38肿瘤模型中，e显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤生长速度明显减缓，f显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤重量明显减轻；在b16f10-gmcsf肿瘤模型中，g显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤生长速度明显减缓，h显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤重量明显减轻；j和k显示，在利用cd4/8抗体和gr-1抗体清除cd4/8细胞和mdsc细胞后，全身性敲除mc5r基因小鼠的肿瘤生长速度减缓的现象消失了，表明mc5r基因缺陷导致小鼠抗肿瘤免疫增强是依赖于cd4/8和mdsc细胞的；
54.图5示出实施例5中探究mc5r抑制剂在肿瘤模型中效果的结果图：在mca205肿瘤模型中，其中a显示与对照鼠相比，多肽抑制剂组小鼠的肿瘤生长速度明显减缓；b显示与对照鼠相比，多肽抑制剂组小鼠的肿瘤重量明显降低；c显示与对照鼠相比，64组小鼠的肿瘤生长速度明显减缓；d显示与对照鼠相比，64组小鼠的肿瘤重量明显降低；在llc肿瘤模型中，e显示与对照鼠相比，jnj-10229570组小鼠的肿瘤生长速度明显减缓；f显示与对照鼠相比，jnj-10229570组小鼠的肿瘤重量明显降低；g显示与对照鼠相比，多肽抑制剂组小鼠的肿瘤生长速度明显减缓；h显示与对照鼠相比，多肽抑制剂组小鼠的肿瘤重量明显降低；在b16f10-gmcsf肿瘤模型中，i显示与对照鼠相比，多肽抑制剂组小鼠的肿瘤生长速度明显减缓；j显示与对照鼠相比，多肽抑制剂组小鼠的肿瘤重量明显降低；在llc肿瘤模型中，k显示与对照鼠相比，多肽抑制剂组小鼠肿瘤中浸润的pmn-mdsc和m-mdsc细胞数目显著减少；i显示与对照鼠相比，多肽抑制剂组小鼠肿瘤中浸润的cd8+t细胞、cd4+t细胞、nk细胞、nkt细胞数目显著增多；图5m显示与对照鼠
相比，多肽抑制剂组小鼠的造血前体细胞数目明显减少包括(lsk/cmp/gmp/mdp)；
55.图6示出实施例6中探究mc5r抑制剂联合pd-1抗体在肿瘤模型中效果的结果图：在mca205肿瘤模型中，a显示与对照鼠相比，多肽抑制剂和pd-1抗体单独有效的抑制了肿瘤的生长，多肽抑制剂联合pd-1抗体效果更加显著，肿瘤生长速度进一步减缓；在llc肿瘤模型中，b显示与对照鼠相比，pd-1抗体单独肿瘤的生长速率没有变化，多肽抑制剂单独有效的减缓了肿瘤的生长速率，多肽抑制剂联合pd-1抗体能进一步减缓肿瘤的生长速率；在b16f10-gmcsf肿瘤模型中，c显示与对照鼠相比，pd-1抗体单独肿瘤的生长速率没有变化，多肽抑制剂单独有效的减缓了肿瘤的生长速率，多肽抑制剂联合pd-1抗体能进一步减缓肿瘤的生长速率；
56.图7示出实施例7中探究全身性敲除mc5r基因小鼠在脓毒血症模型中的变化情况的结果图：在大肠杆菌诱导的脓毒血症模型中，a显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的存活率显著提高；在盲肠穿刺(clp)诱导的脓毒血症模型中，b显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的存活率显著提高；在脂多糖诱导的脓毒血症模型中，c显示与对照鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠的存活率显著提高；
57.图8示出实施例8中探究mc5r抑制剂在脓毒血症模型中效果的结果图：在大肠杆菌诱导的脓毒血症模型中，结果显示与对照鼠相比，多肽抑制剂组小鼠的存活率显著提高；
58.图9示出实施例5、6和8中mc5r抑制剂的结构式：a为多肽抑制剂，b为小分子抑制剂，c为jnj-10229570；
59.数据统计分析：除在图释中特别注明外，本文所用数据统计都是用graphpad prism(软件版本号6)进行统计分析，分析方法采用two-tailed unpaired student’s t-test；*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001，ns：无明显差异。
具体实施方式
60.本发明提供了黑皮质素受体mc5r的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
61.在本研究中，我们首次发现在肿瘤发生发展过程中，下丘脑-垂体可以通过分泌神经肽α-msh作用于骨髓造血前体细胞上的黑皮质素受体mc5r，促进前体细胞的增殖和加速髓系来源的抑制性细胞mdsc的积累，从而导致免疫系统被抑制而加快肿瘤的生长。此外，我们证实了阻断α-msh的产生或者基因敲除mc5r以及使用mc5r的抑制剂均可以有效的增强抗肿瘤免疫功能，减少髓系前体以及mdscs的数目，从而抑制肿瘤的生长，并且显著提高了小鼠的生存率。更有趣的是利用mc5r抑制剂和anti-pd-1联合，能够显著增强anti-pd-1的效果，并且针对对免疫疗法抵抗的肿瘤(llc/b16f10-gmcsf肿瘤)也具有很好的疗效。除此之外，我们还发现在脓毒血症的发病过程中，基因敲除mc5r以及使用mc5r的抑制剂均可以显著提高小鼠的生存率。这些结果表明α-msh-mc5r信号通路在肿瘤免疫调控和脓毒血症发病中发挥关键作用。提示mc5r及其抑制剂在制备预防或髓系造血功能紊乱相关
疾病药物中具有十分广阔的应用前景。本研究为以mc5r为作用靶点，设计和制备髓系造血功能紊乱相关疾病药物的研究提供了理论支持，为肿瘤、脓毒血症、肥胖、抑郁、糖尿病等造血功能异常性疾病提供了新的策略。
62.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
63.mc5r多肽抑制剂：由上海强耀生物技术有限公司合成，序列：ac-cehfrwcppkd-nh2(remark:disulfide bond，f is d-phe,c is d-cys)，分子式：c
31h25
no4cl，结构见图9中的a。
64.mc5r化学小分子抑制剂64：由兰州大学合成，分子式：c
38h44
n4o2，结构见图9中的b。
65.mc5r抑制剂jnj-10229570：medchemexpress,hy-107139，分子式：c
22h19
n3o2s，结构见图9中的c。
66.实验动物：野生型c57bl/6j小鼠从上海斯莱克实验动物有限公司购买。全身性敲除mc5r基因小鼠是由中国科学技术大学生命科学学院动物实验中心技术人员，通过crispr-cas9技术获得。全身性敲除mc5r基因小鼠繁殖出的mc5r
+/+
基因小鼠为实验对照鼠，mc5r-/-基因小鼠为mc5r基因缺陷小鼠。实验中所有实验动物都饲养在spf设施中。
67.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
68.实施例1.荷瘤小鼠血清中α-msh的分泌水平上调。
69.1.小鼠肿瘤细胞系llc/mca205的培养：用dmem培养基+10％fbs培养小鼠肿瘤细胞llc/mca205，置于37℃、含5％co2的培养箱内传代生长。取对数生长期细胞，用pbs洗和0.25％胰酶消化，用pbs收集细胞制成细胞悬液，对每只鼠进行皮下注射，细胞数目为llc(5
×
105/只)和mca205(5
×
105/只)。
70.2.肿瘤模型的建立：选取8周龄的雌性c57bl/6j小鼠，用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入llc和mca205肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
71.3.荷瘤小鼠血清的获取：在荷瘤0天，14天，28天和42天，将小鼠进行眼球放血，收取血清。具体如下：血液静置2小时，随后3500rpm,15分钟，小心收取上清，即为血清，放置-80℃冰箱备用。
72.4.血清中α-msh的检测：根据α-msh试剂盒(e03m0205，bluegene)进行操作。
73.图1中的a实验结果显示，酶联免疫吸附剂测定elisa检测荷瘤mca205小鼠的不同时间点血清中α-msh的分泌水平，发现α-msh的水平显著提高。
74.图1中的b实验结果显示，酶联免疫吸附剂测定elisa检测荷瘤llc小鼠的不同时间点血清中α-msh的分泌水平，发现α-msh的水平显著提高。
75.以上实验结果表明，小鼠荷瘤后血清中的α-msh的分泌水平明显增加。
76.实施例2.mc5r基因特异性高表达于lsk细胞
77.1.骨髓细胞的分离：颈椎脱臼处死小鼠，去除小鼠腿部肌肉；使用20ml注射器吸满1
×
pbs，换上0.65mm医用针头，轻轻将骨髓吹出至50ml离心管中，吹至骨头明显变白，室温1,500rpm离心5min；去上清，加入1ml红细胞裂解液吹匀，静置2min使红细胞充分裂解；加10ml 1
×
pbs终止反应，室温1,500rpm离心5min；使用1ml 1
×
pbs重悬细胞并过滤。
78.2.造血前体细胞的分离：根据1中的方法获取骨髓细胞，然后标记流式抗体fitc-lin1-(b220/cd49b/ter119/ly6g/cd3e/nk1.1/cd11b/il-7ra)和fitc-lin2-(b220/cd49b/ter119/ly6g/cd3e/nk1.1/cd11b)，pe-cd34(公司：biolegend，货号：119307，克隆号：mec14.7)，apccy7-cd16/32(公司：biolegend，货号：101328，克隆号：93)，apc-c-kit(公司：ebioscience，货号：17-0081-82，克隆号：2b8)，pp5.5-sca-1(公司：ebioscience，货号：15-5981-82，克隆号：d7)，bv421-cd115(公司：biolegend，货号：135513，克隆号：afs98)，和bv510-cd45(公司：biolegend，货号：103137，克隆号：30-f11)，通过流式分选cd45
+
lin1-c-kit
+
sca1
+
细胞为lsk细胞，cd45
+
lin1-c-kit
+
sca1-cd34
+
cd16/32
mid
细胞为cmp细胞，cd45
+
lin1-c-kit
+
sca1-cd34
+
cd16/32
high
cd115-细胞为gmp细胞，cd45
+
lin1-c-kit
+
sca1-cd34
+
cd16/32
high
cd115
+
细胞为mdp细胞，cd45
+
lin1-c-kit
+
sca1-cd34-cd16/32
low
细胞为mep，lin2-c-kit
low
sca1
low
cd127
+
细胞为clp。
79.3.中性粒细胞(neutrophil)和单核细胞(monocyte)分离：根据1中的方法获取骨髓细胞，然后标记流式抗体pe-cy7-cd11b(公司：ebioscience，货号：25-0112-82，克隆号：m1/70)，apc-ly6c(公司：biolegend,货号：128016，克隆号：hk1.4)和bv421-ly6g(公司：biolegend,货号：127628，克隆号：1a8)，通过流式分选cd11b
+
ly6g
+
ly6c-细胞为中性粒细胞和cd11b
+
ly6g-ly6c
+
细胞为单核细胞。
80.4.多核来源的髓系抑制细胞(pmn-mdscs)和单核来源的髓系抑制细胞(m-mdscs)分离：根据1中的方法获取荷瘤小鼠的骨髓细胞，然后标记流式抗体pe-cy7-cd11b(公司：ebioscience，货号：25-0112-82，克隆号：m1/70)，apc-ly6c(公司：biolegend,货号：128016，克隆号：hk1.4)和bv421-ly6g(公司：biolegend,货号：127628，克隆号：1a8)，通过流式分选cd11b
+
ly6g
+
ly6c-细胞为多核来源的髓系抑制细胞和cd11b
+
ly6g-ly6c
+
细胞为单核来源的髓系抑制细胞
81.5.收集骨髓细胞、造血前体细胞、中性粒细胞、单核细胞、多核来源的髓系抑制细胞和单核来源的髓系抑制细胞，利用实时荧光定量pcr仪检测mc5r基因的表达情况。
82.图2中的a实验结果显示，实时荧光定量pcr仪检测骨髓细胞中mc1r、mc2r、mc3r、mc4r和mc5r基因的表达水平，mc5r基因相对于其他mcr家族成员，在骨髓细胞表达较高。
83.图2中的b实验结果显示，实时荧光定量pcr仪检测造血前体细胞、中性粒细胞、单核细胞、多核来源的髓系抑制细胞和单核来源的髓系抑制细胞中mc5r基因的表达水平，mc5r基因特异性高表达于lsk细胞。
84.实施例3.全身性敲除mc5r基因小鼠在肿瘤模型中的髓系造血明显减弱
85.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的mc5r
+/+
和mc5r-/-小鼠，其中mc5r
+/+
为来源于同一亲本的对照小鼠。用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入llc肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
86.2.第25天，牺牲小鼠，然后分离小鼠的骨髓细胞、肿瘤、脾脏和血液细胞，进行流式分析检测造血前体细胞和髓系来源的抑制性细胞的细胞数目变化。
87.图3中的a结果显示，在llc肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r基因
小鼠骨髓中的造血前体细胞lsk、cmp、gmp和mdp的数目明显减少。
88.图3中的b结果显示，在llc肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r基因小鼠骨髓中的肿瘤、脾脏和血液细胞pmn-mdsc和m-mdsc的数目明显减少。
89.以上实验结果表明，全身性敲除mc5r基因小鼠在肿瘤模型中髓系造血明显减慢。
90.实施例4.全身性敲除mc5r小鼠在肿瘤模型中的肿瘤生长明显减慢以及抗肿瘤免疫增强
91.一.全身性敲除mc5r小鼠在llc肿瘤模型中肿瘤的生长明显减慢
92.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的mc5r
+/+
和mc5r-/-小鼠，其中mc5r
+/+
为来源于同一亲本的对照小鼠。用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入llc(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
93.2.第10天，使用游标卡尺进行测量小鼠肿瘤的长和宽，每5天测量一次。
94.3.第25天，牺牲小鼠，然后剥离小鼠肿瘤，称量肿瘤的重量以及分离肿瘤细胞，使用流式分析检测淋巴细胞的变化。
95.图4中的a结果显示，在llc肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的生长速度明显减缓。
96.图4中的b结果显示，在llc肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的重量明显减轻。
97.图4中的i结果显示，在llc肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的淋巴细胞的数目明显增加。
98.二.全身性敲除mc5r小鼠在mca205肿瘤模型中肿瘤的生长明显减慢
99.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的mc5r
+/+
和mc5r-/-小鼠，其中mc5r
+/+
为来源于同一亲本的对照小鼠。用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入mca205(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
100.2.第5天，使用游标卡尺进行测量小鼠肿瘤的长和宽，每5天测量一次。
101.3.第25天，牺牲小鼠，然后剥离小鼠肿瘤，称量肿瘤的重量。
102.图4中的c结果显示，在mca205肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的生长速度明显减缓。
103.图4中的d结果显示，在mca205肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的重量明显减轻。
104.三.全身性敲除mc5r小鼠在mc38肿瘤模型中肿瘤的生长明显减慢
105.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的mc5r
+/+
和mc5r-/-小鼠，其中mc5r
+/+
为来源于同一亲本的对照小鼠。用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤
下方0.3厘米处缓慢注入mc38(1
×
106/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
106.2.第10天，使用游标卡尺进行测量小鼠肿瘤的长和宽，每5天测量一次。
107.3.第35天，牺牲小鼠，然后剥离小鼠肿瘤，称量肿瘤的重量。
108.图4中的e结果显示，在mc38肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的生长速度明显减缓。
109.图4中的f结果显示，在mc38肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的重量明显减轻。
110.四.全身性敲除mc5r小鼠在b16f10-gmcsf肿瘤模型中肿瘤的生长明显减慢
111.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的mc5r
+/+
和mc5r-/-小鼠，其中mc5r
+/+
为来源于同一亲本的对照小鼠。用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入b16f10-gmcsf(2
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
112.2.第10天，使用游标卡尺进行测量小鼠肿瘤的长和宽，每5天测量一次。
113.3.第20天，牺牲小鼠，然后剥离小鼠肿瘤，称量肿瘤的重量。
114.图4中的g结果显示，在b16f10-gmcsf肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的生长速度明显减缓。
115.图4中的h结果显示，在b16f10-gmcsf肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的重量明显减轻。
116.五.全身性敲除mc5r小鼠在llc肿瘤模型中肿瘤的生长明显减慢依赖于t细胞和髓系来源的抑制性细胞
117.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的mc5r
+/+
和mc5r-/-小鼠，其中mc5r
+/+
为来源于同一亲本的对照小鼠。用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入llc(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
118.2.第7天，使用cd4和cd8的清除抗体进行抗体清除，每7天进行腹腔注射。
119.3.第10天，使用游标卡尺进行测量小鼠肿瘤的长和宽，每4天测量一次。
120.图4中的j结果显示，在llc肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的生长速度明显减缓依赖于t细胞。
121.3.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的mc5r
+/+
和mc5r-/-小鼠，其中mc5r
+/+
为来源于同一亲本的对照小鼠。用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入llc(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止
注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
122.4.第7天，使用gr-1的清除抗体进行抗体清除，每7天进行两次腹腔注射。
123.5.第10天，使用游标卡尺进行测量小鼠肿瘤的长和宽，每5天测量一次。
124.图4中的k结果显示，在llc肿瘤模型中，与野生型小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠肿瘤的生长速度明显减缓依赖于髓系来源的抑制性细胞。
125.以上实验结果表明，全身性敲除mc5r小鼠在肿瘤模型中的肿瘤生长明显减慢以及抗肿瘤免疫增强，并且此过程是依赖于t细胞和髓系来源的抑制性细胞。
126.实施例5.mc5r抑制剂可以有效缓解肿瘤的生长
127.一.mc5r多肽抑制剂可以有效缓解mca205肿瘤的生长
128.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的c56bl/6j小鼠，用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入mca205(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
129.2.第5天，选取肿瘤大小一致的小鼠，将其随机分成两组，每组5只，具体分组处理如下：
130.第一组：在第5天开始，每两天进行腹腔注射100μl 1xpbs，直至实验结束，即对照组。
131.第二组：在第5天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r多肽抑制剂(注射量为2mg/kg)，直至实验结束，即多肽抑制剂组。
132.3.第25天，牺牲小鼠，然后剥离小鼠肿瘤，称量肿瘤的重量。
133.图5中的a结果显示，在mca205肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，多肽抑制剂组小鼠肿瘤的生长速度明显减缓。
134.图5中的b结果显示，在mca205肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，多肽抑制剂组小鼠肿瘤的重量明显减轻。
135.二.mc5r小分子抑制剂64可以有效缓解mca205肿瘤的生长
136.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的c56bl/6j小鼠，用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入mca205(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
137.2.第7天，选取肿瘤大小一致的小鼠，将其随机分成两组，每组6只，具体分组处理如下：
138.第一组：在第7天开始，每两天进行腹腔注射100μl 1xpbs，直至实验结束，即对照组。
139.第二组：在第7天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r小分子抑制剂(注射量为2mg/kg)，直至实验结束，即小分子抑制剂64组。
140.3.第34天，牺牲小鼠，然后剥离小鼠肿瘤，称量肿瘤的重量。
141.图5中的c结果显示，在mca205肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，小分子抑制剂
组小鼠肿瘤的生长速度明显减缓。
142.图5中的d结果显示，在mca205肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，小分子抑制剂组小鼠肿瘤的重量明显减轻。
143.三.mc5r抑制剂jnj-10229570可以有效缓解llc肿瘤的生长
144.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的c56bl/6j小鼠，用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入llc(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
145.2.第10天，选取肿瘤大小一致的小鼠，将其随机分成两组，每组5只，具体分组处理如下：
146.第一组：在第5天开始，每两天进行腹腔注射100μl 1
×
pbs，直至实验结束，即对照组。
147.第二组：在第5天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r多肽抑制剂(注射量为5mg/kg)，直至实验结束，即jnj-10229570组。
148.3.第28天，牺牲小鼠，然后剥离小鼠肿瘤，称量肿瘤的重量。
149.图5中的e结果显示，在llc肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，jnj-10229570组小鼠肿瘤的生长速度明显减缓。
150.图5中的f结果显示，在llc肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，jnj-10229570组小鼠肿瘤的重量明显减轻。
151.四.mc5r多肽抑制剂可以有效缓解llc肿瘤的生长
152.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的c56bl/6j小鼠，用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入llc(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
153.2.第10天，选取肿瘤大小一致的小鼠，将其随机分成两组，每组5只，具体分组处理如下：
154.第一组：在第10天开始，每两天进行腹腔注射100μl 1
×
pbs，直至实验结束，即对照组。
155.第二组：在第10天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r多肽抑制剂(注射量为2mg/kg)，直至实验结束，即肽抑制剂组。
156.3.第31天，牺牲小鼠，然后剥离小鼠肿瘤，称量肿瘤的重量以及分离肿瘤和骨髓细胞进行流式分析。
157.图5中的g结果显示，在llc肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，多肽抑制剂组小鼠肿瘤的生长速度明显减缓。
158.图5中的h结果显示，在llc肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，多肽抑制剂组小鼠肿瘤的重量明显减轻。
159.图5中的k结果显示，在llc肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，多肽抑制剂组小
鼠肿瘤中髓系来源的抑制性细胞的数目明显减少。
160.图5中的i结果显示，在llc肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，多肽抑制剂组小鼠肿瘤中淋巴细胞的数目明显增加。
161.图5中的m结果显示，在llc肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，多肽抑制剂组小鼠骨髓前体细胞的数目明显减少。
162.五.mc5r多肽抑制剂可以有效缓解b16f10-gmcsf肿瘤的生长
163.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的c56bl/6j小鼠，用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入b16f10-gmcsf(2
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
164.2.第10天，选取肿瘤大小一致的小鼠，将其随机分成两组，每组5只，具体分组处理如下：
165.第一组：在第10天开始，每两天进行腹腔注射100μl 1
×
pbs，直至实验结束，即对照组。
166.第二组：在第10天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r多肽抑制剂(注射量为2mg/kg)，直至实验结束，即肽抑制剂组。
167.3.第31天，牺牲小鼠，然后剥离小鼠肿瘤，称量肿瘤的重量。
168.图5中的i结果显示，在b16f10-gmcsf肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，多肽抑制剂组小鼠肿瘤的生长速度明显减缓。
169.图5中的j结果显示，在b16f10-gmcsf肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，多肽抑制剂组小鼠肿瘤的重量明显减轻。
170.以上实验结果表明，mc5r抑制剂可以有效缓解肿瘤的生长，并且增强抗肿瘤免疫及抑制髓系造血。
171.实施例6.mc5r多肽抑制剂联合pd-1抗体可以有效缓解肿瘤的生长
172.一.mc5r多肽抑制剂联合pd-1抗体可以有效缓解mca205肿瘤的生长
173.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的c56bl/6j小鼠，用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入mca205(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
174.2.第10天，选取肿瘤大小一致的小鼠，将其随机分成四组，每组7只，具体分组处理如下：
175.第一组：在第7天开始，每两天进行腹腔注射100μl 1xpbs，直至实验结束，即对照组。
176.第二组：在第7天开始，进行腹腔注射100μl pd-1抗体(注射量为100μg)，每3天注射一次，共注射3次，即pd-1抗体组。
177.第三组：在第7天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r多肽抑制剂(注射量为2mg/kg)，直至实验结束，即多肽抑制剂组。
178.第四组：在第7天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r多肽抑制剂(注射量为2mg/kg)，直至实验结束。此外，也同时腹腔注射100μl pd-1抗体(注射量为100μg)，每3天注射一次，共注射3次，即联合组。
179.图6中的a结果显示，在mca205肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，pd-1抗体组小鼠肿瘤的生长不受影响，多肽抑制剂组小鼠肿瘤的生长速度明显减缓，但联合组小鼠肿瘤的生长速度最慢。
180.二.mc5r多肽抑制剂联合pd-1抗体可以有效缓解llc肿瘤的生长
181.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的c56bl/6j小鼠，用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入llc(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
182.2.第10天，选取肿瘤大小一致的小鼠，将其随机分成四组，每组7只，具体分组处理如下：
183.第一组：在第10天开始，每两天进行腹腔注射100μl 1xpbs，直至实验结束，即对照组。
184.第二组：在第10天开始，进行腹腔注射100μl pd-1抗体(注射量为200μg)，每3天注射一次，共注射3次，即pd-1抗体组。
185.第三组：在第10天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r多肽抑制剂(注射量为2mg/kg)，直至实验结束，即多肽抑制剂组。
186.第四组：在第10天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r多肽抑制剂(注射量为2mg/kg)，直至实验结束。此外，也同时腹腔注射100μl pd-1抗体(注射量为200μg)，每3天注射一次，共注射3次，即联合组。
187.图6中的b结果显示，在llc肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，pd-1抗体小鼠肿瘤的生长速度无变化，多肽抑制剂组小鼠肿瘤的生长速度明显减缓，但联合组小鼠肿瘤的生长速度最慢。
188.三.mc5r多肽抑制剂联合pd-1抗体可以有效缓解b16f10-gmcsf肿瘤的生长
189.1.第0天，准备年龄和性别相匹配的8周龄的c56bl/6j小鼠，用乙醚进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入llc(5
×
105/只)肿瘤细胞系悬液100μl，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。
190.2.第10天，选取肿瘤大小一致的小鼠，将其随机分成四组，每组10只，具体分组处理如下：
191.第一组：在第5天开始，每两天进行腹腔注射100μl 1xpbs，直至实验结束，即对照组。
192.第二组：在第5天开始，进行腹腔注射100μl pd-1抗体(注射量为200μg)，每3天注射一次，共注射3次，即pd-1抗体组。
193.第三组：在第5天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r多肽抑制剂(注射量为
2mg/kg)，直至实验结束，即多肽抑制剂组。
194.第四组：在第5天开始，每两天进行腹腔注射100μl mc5r多肽抑制剂(注射量为2mg/kg)，直至实验结束。此外，也同时腹腔注射100μl pd-1抗体(注射量为200μg)，每3天注射一次，共注射3次，即联合组。
195.图6中的c结果显示，在b16f10-gmcsf肿瘤模型中，与对照组小鼠相比，pd-1抗体小鼠肿瘤的生长速度无变化，多肽抑制剂组小鼠肿瘤的生长速度明显减缓，但联合组小鼠肿瘤的生长速度最慢。
196.以上实验结果表明，mc5r抑制剂联合pd-1抗体可以有效缓解肿瘤的生长。
197.实施例7.全身性敲除mc5r小鼠在脓毒血症模型中存活率明显延长
198.一.全身性敲除mc5r小鼠在大肠杆菌诱导的脓毒血症模型中存活率明显提高
199.1.准备年龄和性别相匹配的8周龄的mc5r
+/+
和mc5r-/-小鼠，其中mc5r
+/+
为来源于同一亲本的对照小鼠。腹腔注射1
×
109cfu的大肠杆菌，每隔12小时监测小鼠生存率情况。
200.图7中的a结果显示，在大肠杆菌介导的脓毒血症模型中，与对照小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠的生存率明显延长，表明mc5r参与大肠杆菌诱导的脓毒血症过程。
201.二.全身性敲除mc5r小鼠在盲肠结扎诱导的脓毒血症模型中存活率明显提高
202.1.准备年龄和性别相匹配的8周龄的mc5r
+/+
和mc5r-/-小鼠，其中mc5r
+/+
为来源于同一亲本的对照小鼠。具体操作如下：
203.1.1)7-9周小鼠腹腔注射麻醉(50mg/kg)，使用消毒和灭菌的镊子通过捏脚趾来监测麻醉强度，充分的麻醉应该不会引起肢体反应。
204.1.2)使用电动剃毛器刮尽小鼠腹部毛发，并用酒精棉球消毒该区域，同时用灯泡或者电热毯维持小鼠的体温。
205.1.3)将小鼠固定在聚苯乙烯泡沫垫上，用剪刀沿小鼠腹中线(中线白筋膜)剪开1.5-2cm的切口，先剪上皮后剪腹膜。
206.1.4)通过使用钝性解剖钳来分离盲肠并将其外置，将小肠和大肠的其余部分留在腹腔内。至关重要的是不要破坏或损伤肠系膜血管(小心不要损伤回盲动脉的盲肠分支以避免严重出血并发症。)在大多数情况下，盲肠位于腹部左侧。
207.1.5)根据需要的严重程度等级来对盲肠进行结扎(如：为了诱导严重的clp 60-80％的盲肠被结扎，诱导较轻clp 30-50％的盲肠结扎)。确保不要结扎回盲瓣，以保持肠道连续性。
208.1.6)在盲肠穿孔之前，将盲肠内容物轻轻地推向远侧盲肠，在盲肠穿刺时，从盲肠的一侧穿刺到另一侧，小心避免刺破血管。
209.1.7)拔出针头后，从穿透孔挤出少量(液滴)粪便以确保通畅。(确保挤出盲肠内容物的数量是有限的(小滴)，并在所有动物中保持一致性。)
210.1.8)将盲肠放回到腹腔内，注意不要将盲肠上的粪便扩散到腹壁伤口边缘。
211.1.9)使用丝线手术缝合4-0切割针用简单的连续缝合关闭腹膜，使用丝线手术缝合6-0切割针缝合筋膜和腹部肌肉组织。
212.1.10)将小鼠放回到笼盒中，每隔12小时监测小鼠生存率情况。
213.图7中的b结果显示，在盲肠结扎介导的脓毒血症模型中，与对照小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠的生存率明显延长，表明mc5r参与盲肠结扎诱导的脓毒血症过程。
214.三.全身性敲除mc5r小鼠在脂多糖诱导的脓毒血症模型中存活率明显提高
215.1.准备年龄和性别相匹配的8周龄的mc5r
+/+
和mc5r-/-小鼠，其中mc5r
+/+
为来源于同一亲本的对照小鼠。腹腔注射20mg/kg脂多糖，每隔12小时监测小鼠生存率情况。
216.图7中的c结果显示，在脂多糖诱导的的脓毒血症模型中，与对照小鼠相比，全身性敲除mc5r小鼠的生存率明显延长，表明mc5r参与脂多糖诱导的脓毒血症过程。
217.以上实验结果表明，全身性敲除mc5r小鼠在脓毒血症模型中存活率明显延长。
218.实施例8.mc5r抑制剂可以有效缓解脓毒血症的死亡率
219.1.准备年龄和性别相匹配的8周龄的c56bl/6j小鼠。将其随机分成两组，每组7/10只，具体分组处理如下：
220.第一组：腹腔注射100μl 1
×
pbs，即对照组。
221.第二组：腹腔注射多肽抑制剂(注射量为2mg/kg)，即多肽抑制剂组。
222.12小时后，将两组小鼠进行腹腔注射1
×
109cfu的大肠杆菌，在6小时后，再次注射pbs和多肽抑制剂，每隔12小时监测小鼠生存率情况。
223.图8结果显示，在大肠杆菌介导的脓毒血症模型中，与对照小鼠相比，多肽抑制剂组小鼠的生存率明显延长。
224.以上实验结果表明，mc5r抑制剂可以有效缓解脓毒血症的死亡率。
225.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.以mc5r为靶点的物质，在制备预防和/或髓系造血功能紊乱相关疾病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述以mc5r为靶点的物质包括i～vi中至少一种：i)、敲除或敲低mc5r基因的表达载体；ii)、含有i)的宿主细胞或病毒载体；iii)、干扰mc5r基因转录的核酸分子；iv)、mc5r基因表达的终止子或转座子；v)、抑制mc5r基因表达的制剂；vi)、mc5r蛋白功能的抑制剂和/或拮抗剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述干扰mc5r基因转录的核酸分子包括：靶向mc5r基因的rnai片段、靶向mc5r基因的sirna片段或促进mc5r信使rna降解的crispr grna；所述mc5r蛋白功能的抑制剂和/或拮抗剂包括：mc5r中和抗体、mc5r的化学小分子抑制剂和/或mc5r的多肽类抑制剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述mc5r多肽抑制剂为ac-cehfrwcppkd-nh2，mc5r化学的小分子抑制剂为n-(((3s，5s)-1-(2，2-二苯基乙基)-2-氧代-3-(3-(-1-基)丙基)-1，4-二氮杂-5-基)甲基)-2-萘甲酰胺，或其类似物，或者，mc5r化学的小分子抑制剂为jnj-10229570或其类似物。5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述髓系造血功能紊乱相关疾病包括：肿瘤、脓毒血症、肥胖、抑郁、糖尿病、心脑血管类疾病、肠炎、血液病、痛风、关节炎、阿尔兹海默症、哮喘、自身免疫性疾病、细菌、真菌和病毒诱导的感染性疾病中至少一种。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括：实体瘤和/或非实体瘤；所述实体瘤包括：宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、外阴癌、前列腺癌、腮腺癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肺癌、纤维肉瘤、皮肤癌、鼻咽癌、舌癌、口腔癌、喉癌、脑瘤、胆囊癌、肾癌、牙龈癌、睾丸癌、阴茎癌、多发骨髓瘤和/或恶性黑素瘤；所述非实体瘤包括：白血病和/或恶性淋巴瘤。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，对所述肿瘤的预防和/或包括：降低瘤体质量、抑制肿瘤生长和/或增强抗肿瘤免疫。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述增强抗肿瘤免疫包括：降低髓系来源的抑制性细胞数量或比例、提高肿瘤中毒性淋巴细胞的数量或比例或杀伤功能和/或降低骨髓前体细胞的数量或比例。9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述血液病包括脓毒血症、再生障碍性贫血和/或特发性血小板减小性紫癜。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述脓毒血症包括由病原菌感染引起的脓毒血症、脂多糖诱导的脓毒血症和/或盲肠结扎诱导的脓毒血症；对所述脓毒血症的预防和/或包括延长生存率、增强菌清除能力、减轻炎症反应程度。11.一种髓系造血功能紊乱相关疾病的药物，其特征在于，包括以mc5r为靶点的物
质和药学上可接受的辅料；所述以mc5r为靶点的物质包括i～vi中至少一种：i)、敲除或敲低mc5r基因的表达载体；ii)、含有i)的宿主细胞或病毒载体；iii)、干扰mc5r基因转录的核酸分子；iv)、mc5r基因表达的终止子或转座子；v)、抑制mc5r基因表达的制剂；vi)、mc5r蛋白功能的抑制剂和/或拮抗剂。12.根据权利要求11所述的药物，其特征在于，还包括免疫抑制分子抗体、小分子化合物和核酸类抑制剂。13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于，所述免疫抑制分子抗体为pd-1抗体、pd-l1抗体、ctla-4抗体、lag3抗体和/或tigit抗体；所述pd-1抗体与mc5r为靶点的物质的质量比为0.1:2。

技术总结

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及黑皮质素受体MC5R的用途。本发明通过确定MC5R在抗肿瘤免疫、脓毒血症疾病中的作用，为以MC5R为作用靶点，设计和制备髓系造血功能紊乱相关疾病药物的研究提供了理论支持，为肿瘤、脓毒血症、肥胖、抑郁、糖尿病、心脑血管类疾病、肠炎、血液病、痛风、关节炎、阿尔兹海默症、哮喘、自身免疫性疾病、细菌、真菌或病毒诱导的感染性疾病等造血功能异常性疾病提供了新的策略。略。