一种动物磷脂产品的生产工艺的制作方法

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1.本发明涉及磷脂产品制备技术领域，特别涉及一种动物磷脂产品的生产工艺。

背景技术：

2.磷脂(phospholipids,简称pls)是一类含有亲脂性酰基链和亲水头的两性天然表面活性剂。磷脂根据其结构的不同可以分为两类:神经磷脂(鞘脂类)(sphingolipids,简称sls)和甘油磷脂(glycerolphospholipids,简称gpls)。甘油磷脂是由极性头甘油(胆碱，乙醇胺,肌醇，丝氨酸)和在甘油骨架sn-1和sn-2位上酯化了的两条脂肪酸组成的。甘油磷脂主要包括磷脂酰胆碱(phosphatidyleholine,简称pc)、磷脂酰乙醇胺(phosphotidylethanolamin,简称pe)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,简称pi)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,简称ps)等。鞘酯类是来自鞘氨醇，鞘磷脂(sphingomyelin,简称sm)是主要类型，它是由一个磷酰胆碱头和连接鞘氨醇类长链上的酰胺态氮的脂肪酸组成。
3.肺磷脂是一种天然提取物，是一种表面活性活性物质，其中磷脂占干重的90％，大部分为磷脂酰胆碱(pc)，具有表面活性的pc为二棕榈酸磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine,dppc)，其主要提供肺泡的稳定性，减小肺泡的表面张力。磷脂酰甘油则帮助表面活性物质在呼气和吸气时在肺泡内的重分布。其余的磷脂还包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。此外，还有sp-b和sp-c二种表面活性物质(ps)特异性蛋白质。在呼气时,表面活性物质呈二聚体，其亲水区向外，疏水区相互重叠在一起，这时表面活性物质功能下降，肺泡张力增加形成肺泡回缩力；而在吸气时，聚集的二聚体表面活性物质重新变成单聚体，其疏水区吸附于肺泡细胞的表面，亲水区面向肺泡的气相,以减小肺泡的表面张力，有利于肺泡表面积的增加，扩大气体交换面积。
4.肺磷脂提取物是肺磷脂原料药主要原料。肺磷脂的制剂主要功能是降低肺表面张力。肺表面活性物质降低表面张力的特性对于维持肺泡稳定，避免肺泡在呼气末萎陷，维持整个通气循环有充分的气体交换。无论何种原因所致肺表面活性物质缺乏，而导致的早产婴儿严重的被称为呼吸窘迫综合征(rds)或肺透明膜病(hmd)。rds是早产儿急性发病和死亡的主要原因，也会造成长期呼吸和神经系统后遗症。
5.现有技术中缺少可规模化高质量制备肺磷脂的方法，基于此，本发明提出了一种动物磷脂产品的生产工艺。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种动物磷脂产品的生产工艺，以解决上述背景技术中提出的现有技术中缺少可规模化高质量制备肺磷脂的方法的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种动物磷脂产品的生产工艺，包括以下步骤：
8.s1、新鲜动物肺打浆；
9.s2、生理盐水浸提；
10.s3、差速离心；
11.s4、有机溶剂萃取；
12.s5、旋蒸；
13.s6、凝胶谱柱纯化；
14.s7、干燥。
15.优选的，步骤s2中加入与肺重量比2-4倍的生理盐水，浸提温度为15-20℃，浸提搅拌时间为60-120min，得到浸提液。
16.优选的，步骤s3中浸提结束后，用100目的尼龙滤袋过滤，得到浸提液，选择离心转速为800-1000g，离心温度≤20℃，离心15-20min，进行初步离心，除去过滤未除去的肺组织，收集得到上清液，再次选择离心转速为300g，离心温度4
±
1℃，离心时间2h，收集下层沉淀，得到肺液中脂质有效成分。
17.优选的，步骤s4中将差速离心收集的沉淀物，加入溶剂进行萃取，采用的萃取溶剂为氯仿和甲醇，且比例为1:1，萃取温度为15-20℃，萃取时间6-10h。
18.优选的，步骤s5中萃取完成后用纯化水清洗有机相，清洗完成后，蒸发有机相，得到肺磷脂粗产物，于-20℃低温充氮气保存。
19.优选的，步骤s6中将肺磷脂粗产物溶解在15-20倍的溶剂中，将层析柱用凝胶填充，填充完成用流动相置换填充凝胶时所用的甲醇溶液，置换完成，加入样品溶液后，将层析柱密封，利用蠕动泵将洗脱液压出，收集洗脱液。
20.优选的，步骤s6中流动相氯仿和甲醇比例为1:2至1:4。
21.优选的，步骤s7中干燥方式为冻干。
22.本发明的技术效果和优点：
23.本发明方法操作简单，产品质量稳定，适合大批量规模化生产，提高了肺的附加利用值，而且制备成本较低，便于广泛推广使用，具有极佳的应用推广前景。
附图说明
24.图1为本发明制备流程的示意图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1：
27.本发明提供了如图1所示的一种动物磷脂产品的生产工艺，包括以下步骤：
28.打浆浸提：取300kg新鲜肺打浆，加入与2000ml的生理盐水，浸提温度为15℃，浸提搅拌时间为60min，得到浸提液。
29.除组织及分离脂：浸提结束后，用100目的尼龙滤袋过滤，得到浸提液，选择离心800g，离心温度20℃，离心15min，进行初步离心，除去过滤未除去的肺组织，收集得到上清
液。再次选择离心300g离心温度4℃，离心时间1h，收集下层沉淀，得到肺液中脂质等有效成分。
30.制备肺磷脂粗品：将上一步离心收集的沉淀物，加入氯仿和甲醇(1:1)萃取，萃取温度为15℃，萃取时间6h，萃取完成后用纯化水清洗有机相，清洗完成后，用旋转蒸发仪蒸发有机相，得到肺磷脂粗产物，于-20℃低温充氮气保存。
31.磷脂纯化：将肺磷脂粗产物溶解在15倍的溶剂中(氯仿和甲醇1:1)，将层析柱用凝胶填充，填充完成用流动相(氯仿和甲醇)置换填充凝胶时所用的甲醇溶液。置换完成，加入样品溶液后，将层析柱密封，利用蠕动泵将洗脱液压出，收集洗脱液，进行干燥后，得到初步纯化后的肺磷脂312.02g。收率0.104％。
32.检测结果
[0033][0034][0035]
实例2
[0036]
本发明提供了如图1所示的一种动物磷脂产品的生产工艺，包括以下步骤：
[0037]
打浆浸提：取500kg新鲜肺打浆，加入与肺重量比3倍的生理盐水，浸提温度为18℃，浸提搅拌时间为90min，得到浸提液。
[0038]
除组织及分离脂：浸提结束后，用100目的尼龙滤袋过滤，得到浸提液，选择离心900g，离心温度18℃，离心20min，进行初步离心，除去过滤未除去的肺组织，收集得到上清液。再次选择离心300g离心温度4℃，离心时间3h，收集下层沉淀，得到肺液中脂质等有效成
分。
[0039]
制备肺磷脂粗品：将上一步离心收集的沉淀物，加入氯仿和甲醇萃取，萃取温度为15℃，萃取时间8h，萃取完成后用纯化水清洗有机相，清洗完成后，用旋转蒸发仪蒸发有机相，得到肺磷脂粗产物，于-20℃低温充氮气保存。
[0040]
凝脂纯化：将肺磷脂粗产物溶解在18倍的溶剂中(氯仿和甲醇1:1)，将层析柱用凝胶填充，填充完成用流动相(氯仿和甲醇)置换填充凝胶时所用的甲醇溶液。置换完成，加入样品溶液后，将层析柱密封，利用空气将洗脱液压出，收集洗脱液，进行干燥后，得到初步纯化后的肺磷脂509.31g。收率0.102％
[0041]
检测结果
[0042]
[0043][0044]
实例3
[0045]
本发明提供了如图1所示的一种动物磷脂产品的生产工艺，包括以下步骤：
[0046]
打浆浸提：取400kg新鲜肺打浆，加入与肺重量比4倍的生理盐水，浸提温度15-20℃，浸提搅拌时间为60-120min，得到浸提液。
[0047]
除组织及分离脂：浸提结束后，用100目的尼龙滤袋过滤，得到浸提液，选择离心1000g，离心温度20℃，离心20min，进行初步离心，除去过滤未除去的肺组织，收集得到上清液。再次选择离心300g离心温度4℃，离心时间2h，收集下层沉淀，得到肺液中脂质等有效成分。
[0048]
制备肺磷脂粗品：将上一步离心收集的沉淀物，加入氯仿和甲醇(1:1)萃取，萃取温度为20℃，萃取时间10h，萃取完成后用纯化水清洗有机相，清洗完成后，用旋转蒸发仪蒸发有机相，得到肺磷脂粗产物，于-20℃低温充氮气保存。
[0049]
凝脂纯化：将肺磷脂粗产物溶解在20倍的溶剂中(氯仿和甲醇1:1)，将层析柱用凝胶填充，填充完成用流动相(氯仿和甲醇)置换填充凝胶时所用的甲醇溶液。置换完成，加入样品溶液后，将层析柱密封，利用蠕动泵将洗脱液压出，收集洗脱液，进行干燥后，得到初步纯化后的肺磷脂403.03g。收率收率0.100％。
[0050]
检测结果
[0051][0052]
从样品测量结果中可知，样品中绝大部分为pc，其次是pi和pe，另外还含有其他多个微量的磷脂组分，如ch、lpe、sm、lpc等，易引起溶血不良反应的lpc和lpe相当低，三个批次样品间各磷脂组分的含量较为接近，说明该工艺稳定可靠。
[0053]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的
保护范围之内。

技术特征：

1.一种动物磷脂产品的生产工艺，其特征在于：包括以下步骤：s1、新鲜动物肺打浆；s2、生理盐水浸提；s3、差速离心；s4、有机溶剂萃取；s5、旋蒸；s6、凝胶谱柱纯化；s7、干燥。2.根据权利要求1所述的一种动物磷脂产品的生产工艺，其特征在于：步骤s2中加入与肺重量比2-4倍的生理盐水，浸提温度为15-20℃，浸提搅拌时间为60-120min，得到浸提液。3.根据权利要求1所述的一种动物磷脂产品的生产工艺，其特征在于：步骤s3中浸提结束后，用100目的尼龙滤袋过滤，得到浸提液，选择离心转速为800-1000g，离心温度≤20℃，离心15-20min，进行初步离心，除去过滤未除去的肺组织，收集得到上清液，再次选择离心转速为300g，离心温度4
±
1℃，离心时间2h，收集下层沉淀，得到肺液中脂质有效成分。4.根据权利要求1所述的一种动物磷脂产品的生产工艺，其特征在于：步骤s4中将差速离心收集的沉淀物，加入溶剂进行萃取，采用的萃取溶剂为氯仿和甲醇，且比例为1:1，萃取温度为15-20℃，萃取时间6-10h。5.根据权利要求1所述的一种动物磷脂产品的生产工艺，其特征在于：步骤s5中萃取完成后用纯化水清洗有机相，清洗完成后，蒸发有机相，得到肺磷脂粗产物，于-20℃低温充氮气保存。6.根据权利要求1所述的一种动物磷脂产品的生产工艺，其特征在于：步骤s6中将肺磷脂粗产物溶解在15-20倍的溶剂中，将层析柱用凝胶填充，填充完成用流动相置换填充凝胶时所用的甲醇溶液，置换完成，加入样品溶液后，将层析柱密封，利用蠕动泵将洗脱液压出，收集洗脱液。7.根据权利要求6所述的一种动物磷脂产品的生产工艺，其特征在于：步骤s6中流动相氯仿和甲醇比例为1:2至1:4。8.根据权利要求1所述的一种动物磷脂产品的生产工艺，其特征在于：步骤s7中干燥方式为冻干。

技术总结

本发明涉及磷脂产品制备技术领域，公开了一种动物磷脂产品的生产工艺，包括以下步骤：S1、新鲜动物肺打浆；S2、生理盐水浸提；S3、差速离心；S4、有机溶剂萃取；S5、旋蒸；S6、凝胶谱柱纯化；S7、干燥。S2中加入与肺重量比2-4倍的生理盐水，浸提温度为15-20℃，浸提搅拌时间为60-120min，得到浸提液，S3中浸提结束后，用100目的尼龙滤袋过滤，得到浸提液，选择离心转速为800-1000g，离心温度≤20℃，离心15-20min，进行初步离心，除去过滤未除去的肺组织，收集得到上清液，再次选择离心转速为300g，离心温度4